三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是一类特殊的乳腺癌亚型，表现为不表达雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子2受体（human epidermal growth factor 2 receptor，HER2）[1]。由于恶性程度高和靶向治疗方式的缺乏，TNBC的治疗在临床上面临严峻挑战。研究表明，TNBC的表观基因组学常有明显的改变，靶向TNBC的表观遗传调控机制已成为TNBC新的治疗策略[2]。ASH1L基因编码组蛋白赖氨酸甲基转移酶。既往研究表明，ASH1L在混合谱系白血病融合蛋白介导的白血病转化中发挥重要的调控作用[3]。此外ASH1L在肝细胞癌、甲状腺癌和肺癌等多种癌症组织中都高表达，并与肿瘤的侵袭转移、化疗抵抗和不良预后等密切相关，但其对乳腺癌细胞恶性表型的影响尚不明确[4-6]。本研究从体外细胞水平和体内动物水平检测其对TNBC细胞生物学行为的影响，明确其在TNBC中的功能，为深入研究其在TNBC中的调控机制及进一步开发新的靶向治疗策略提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人正常乳腺上皮细胞MCF-10A、乳腺癌细胞株MDAMB-435、MDA-MB-231、MCF-7、BT-549、SK-BR-3由实验室保存；DMEM（美国Gibco公司，货号：11965092）；RPMI-1640培养基（美国Gibco公司，货号：11875093）；胎牛血清（美国Gibco公司，货号：A5256701）；胰蛋白酶（上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0202）；RNA提取试剂盒（日本TaKaRa公司，货号：9767）；Prime ScriptRTMaster Mix反转录试剂盒（日本TaKaRa公司，货号：R045A）；TB Green Premix Ex Taq（日本TaKaRa公司，货号：CN830A）；蛋白提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：BC3710）；细胞凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：CA1030）；细胞计数CCK8试剂盒（上海宏叶生物科技有限公司，货号：GK10001）；HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号：GB23301）；细胞培养板（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号：CCP-6H/12H/96H）；anti-ASH1L抗体（美国Santa Cruz公司，货号：SC-81052）；Balb/c裸鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司，实验动物使用许可证号：SCXK（苏）2023-0009；慢病毒由上海吉凯生物技术有限公司生产；PCR引物由上海生工公司设计合成。本研究已通过西安市妇幼保健院医学伦理委员会批准（2022-3）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞复苏及培养 水浴锅调至37 ℃，将冻存的细胞从液氮中取出，迅速融化。350 g离心5 min，加入含有10%FBS的培养基，37 ℃、5% CO2 培养箱中常规培养，隔天换液。

1.2.2 ASH1L在人正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞中的表达情况 实时定量PCR和Western blot法检测ASH1L在MCF-10A、MDA-MB-435、MDA-MB-231、MCF-7、BT-549、SK-BR-3中的表达水平。

1.2.3 慢病毒感染MDA-MB-231细胞构建稳定敲降ASH1L表达的细胞 从冰箱取出病毒，置于冰上缓慢融化。根据MOI和病毒滴度，加入对照慢病毒、敲降ASH1L表达的慢病毒（设计3条靶向ASH1L的干扰序列，包装成慢病毒分别命名为ASH1L敲降组-1、ASH1L敲降组-2和ASH1L敲降组-3）及慢病毒助染试剂。感染24 h后弃掉感染液，换成正常培养基继续培养，72 h后加入嘌呤霉素筛选感染细胞。

1.2.4 实验分组 慢病毒感染的MDA-MB-231细胞待稳定建系后，通过RT-qPCR和Western blot法检测ASH1L的敲降水平，选择ASH1L敲降效率最高的ASH1L敲降组细胞作为实验组，对照慢病毒感染的细胞为对照组。

1.2.5 RT-qPCR检测ASH1L的mRNA水平 收集对照组细胞和实验组细胞，提取总RNA，将总RNA反转录为cDNA。反转录体系（20 μl）：RNA模板1 μg，5×PrimeScript Buffer 4 μl，RNase-Free H2O补足至20 μl；反转录条件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。ASH1L的正向引物序列：5’-CCCAAAGGAGTAAAGGAGCAAGA-3’，反向引物序列：5’-TCTTCAATCAAGGGTAGAGCATCA-3’；GAPDH的正向引物序列：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，反向引物序列：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。RT-qPCR反应体系（20μl）：cDNA模板1 μl，2×TB Green Premix Ex Taq 10 μl，正向引物1 μl，反向引物1 μl，RNase-Free H2O 7 μl；反应条件：95 ℃，3 min；95 ℃，10 s；58 ℃，30 s；共40个循环。对照组和实验组各设3个复孔，实验重复3次，以GAPDH作为内参基因，2-△△Ct 法计算mRNA的相对表达量。

1.2.6 Western blot法 将对照组和实验组细胞传代至6孔板中培养，每组均设3个复孔。培养48 h后裂解细胞提取蛋白，测定蛋白浓度，煮沸使蛋白变性。SDS-PAGE电泳分离蛋白，将电泳后的凝胶和PVDF膜在转膜装置中进行恒流电转。5 %脱脂奶粉封闭1 h，将封闭后的膜放入稀释的一抗液中（目的蛋白：anti-ASH1L抗体1∶500稀释，内参蛋白：anti-β-actin抗体1∶3 000稀释），4 ℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜，HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体（1∶10 000稀释）稀释液在室温孵育2 h，洗膜，加显色液显影。

1.2.7 CCK8法检测细胞增殖 细胞消化后离心，调整细胞密度为4×104 个/ml。在96孔板中接种100 μl细胞悬液，设置6个复孔，同时设置空白组、对照组和实验组。将96孔板放入细胞培养箱中培养24、48、72、96 h后，每孔加入10 μl CCK8溶液。继续培养4 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度（OD450），以时间为横坐标、OD450 为纵坐标绘制生长曲线图。

1.2.8 PI单染法检测细胞周期 收集对照组和实验组细胞，加入75 %的乙醇将细胞重悬混匀，4 ℃固定48 h后离心。PBS重悬细胞，加入含RNase的PI染液，4 ℃避光30 min，流式细胞仪检测，实验重复3次。

1.2.9 AnnexinV/7-AAD双染色法检测细胞凋亡 收集对照组和实验组细胞，用Binding Buffer缓冲液重悬细胞。1×105 个细胞加入5 μl的AnnexinV-PE和5 μl的7-AAD，避光孵育20 min。上机前加入400 μl Binding Buffer，流式细胞仪检测，实验重复3次。

1.2.10 裸鼠皮下荷瘤 细胞培养至对数生长期，胰酶消化并离心。调节细胞密度为5×107 个/ml，置于冰上。选取5周龄的Balb/c雌性裸鼠，采用随机数字表法将其分为裸鼠对照组和裸鼠实验组并编号，每组5只；将MDA-MB-231细胞和敲降ASH1L表达的MDA-MB-231细胞悬液分别接种于对照组和实验组裸鼠背部皮下，每只裸鼠100 μl。3周后处死裸鼠，分离肿瘤，称量。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ASH1L在乳腺癌细胞中的表达情况

RT-qPCR检测结果显示（图1A），与人正常乳腺上皮细胞MCF-10A比较，ASH1L mRNA在TNBC细胞（MCF-7、MDA-MB-231、BT-549、MDA-MB-435）中表达量增加（P＜0.01），其中在MDA-MB-231细胞中的表达量最高，提示ASH1L在TNBC细胞中高表达。Western blot法检测结果也显示，与人正常乳腺上皮细胞MCF-10A比较，ASH1L蛋白在TNBC细胞（MDAMB-435、MDA-MB-231、BT-549、SK-BR-3）中也高表达，其中在MDA-MB-231细胞中的表达水平最高，与RT-qPCR检测结果一致（图1B～C）。

图1 乳腺癌细胞中ASH1L表达水平的检测

A：RT-qPCR检测乳腺癌细胞中ASH1L的mRNA的表达量；B：Western blot法检测乳腺癌细胞中ASH1L蛋白的表达；C：ASH1L蛋白表达的相对表达水平。与MCF-10A比较，aP＜0.05，aaP＜0.01。

2.2 在MDA-MB-231细胞中建立对照组细胞及敲降ASH1L表达的实验组细胞

与对照组细胞比较，ASHIL敲低组-1，ASHIL敲低组-2，ASHIL敲低组-3细胞中ASH1L的mRNA表达水平降低（P＜0.01），其中以ASH1L敲降组-3的沉默效率最高（图2A）。Western blot法检测结果显示，ASH1L敲降组-3细胞的ASH1L在蛋白水平上也降低（图2B～C），因此成功构建了沉默ASH1L的MDA-MB-231细胞株，以下实验均选择敲降效率较高的ASH1L敲降组-3组为实验组。

图2 MDA-MB-231细胞中ASH1L敲降水平的检测

A：RT-qPCR检测乳腺癌MDA-MB-231细胞中ASH1L mRNA的表达水平；B ：Western blot法检测ASH1L蛋白的表达；C：ASH1L蛋白表达的相对表达水平。与对照组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01。

2.3 ASH1L对TNBC细胞增殖的影响

CCK8实验结果显示，在细胞培养的第2、3、4天，与对照组细胞比较，实验组MDA-MB-231细胞的OD450均降低（P＜0.05）。见图3。

图3 CCK8检测MDA-MB-231细胞在不同时间点450nm的吸光度

与对照组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01。

2.4 ASH1L对TNBC细胞周期的影响

流式分析结果显示，与对照组比较，实验组处于G0/G1 期的细胞比例增加、G2/M期细胞的比例减少（P＜0.05）。见图4。

图4 ASH1L对MDA-MB-231细胞周期的影响（n=3）

A：流式细胞术检测细胞周期；B：细胞周期的统计分析。与对照组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01。

2.5 ASH1L对TNBC细胞凋亡的影响

流式结果显示，实验组凋亡细胞的比例高于对照组（P＜0.05）。见图5。

图5 ASH1L对MDA-MB-231细胞凋亡的影响（n=3）

A：流式细胞术分析细胞凋亡；B：细胞凋亡的统计分析。与对照组比较，aP＜0.05。

2.6 ASH1L在体内对TNBC移植瘤生长的影响

MDA-MB-231细胞接种21 d后，裸鼠实验组的移植瘤重量较裸鼠对照组降低（P＜0.05）。见图6。

图6 ASH1L在体内对TNBC移植瘤的影响（n=5）

A：MDA-MB-231细胞接种第21天荷瘤小鼠图像；B：肿瘤重量的统计分析。与裸鼠对照组比较，aP＜0.05。TNBC：三阴性乳腺癌。

3 讨论

乳腺癌是一种严重危害女性健康的恶性肿瘤，具有高度的异质性[7]。TNBC是乳腺癌的一个特殊亚型，约占15%。临床上TNBC以浸润性导管癌为主，恶性程度高，复发率高且易发生远处转移，预后较差[8]。目前，TNBC的治疗方案有限，主要依赖化疗，临床疗效差。TNBC的恶性生物学行为与其复杂的遗传和表观遗传机制密切相关。表观遗传学的改变，特别是组蛋白修饰的异常变化，对TNBC的发生和转移具有重要影响[9]。组蛋白修饰异常是TNBC表观基因组变化中的一个较为突出的特征，其中组蛋白甲基化修饰是一种重要的表观遗传修饰方式，涉及组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶[10-12]。研究表明，组蛋白H3K4的甲基化修饰在TNBC进展中发挥重要作用[13]。

ASH1L是由位于1号染色体长臂22带（1q22）的Ash1l基因编码的组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶，是果蝇属Ash1基因的人类同源物[14]。ASH1L因其在果蝇中基因突变导致的同源异形的表现与三胸腔结构蛋白的突变体相似而被归类于三胸腔结构蛋白[15]。ASH1L的SET结构域具有组蛋白甲基转移酶的活性，可特异性催化H3K4和H3K36位点发生甲基化修饰，激活基因转录，在决定细胞命运中起关键作用[15-18]。

既往研究表明，ASH1L在基因的转录调控中发挥作用，在早期胚胎发育和多能干细胞分化中发挥重要作用[19-20]。此外ASH1L在多种癌症组织中的表达异常，如在甲状腺癌和食管鳞状细胞癌中高表达，并且与患者的不良预后相关[5，21]。ASH1L通过影响组蛋白的甲基化状态，调控靶基因的表达，在肿瘤细胞的增殖、凋亡等恶性生物学行为及肿瘤微环境的重塑中发挥作用[4,22-23]。组学研究显示ASH1L在乳腺癌中高表达，并且与患者较短的生存期相关，提示ASH1L在乳腺癌的发生和发展过程中可能是一个重要的表观遗传修饰分子[24-25]。Liu等[24]研究表明，ASH1L在基底样乳腺癌中过表达，但是其具体的生物学功能尚不明确。

本研究通过体外的细胞实验证实ASH1L在TNBC细胞中高表达，并且与TNBC细胞的增殖、细胞周期和凋亡等恶性生物学行为相关。在高表达ASH1L的MDA-MB-231细胞中敲低ASH1L的表达后，乳腺癌细胞的增殖减慢，细胞周期阻滞，凋亡增加，这些结果均表明ASH1L能促进TNBC的生长。在体内通过裸鼠荷瘤实验，也进一步证实敲降ASH1L的表达能抑制乳腺癌的生长，降低肿瘤负荷。因此本研究的体内外实验均发现ASH1L是促进TNBC恶性增殖的一个重要的表观遗传分子，在TNBC中主要发挥癌基因的功能。本研究也尝试在体外构建ASH1L过表达细胞株，但由于ASH1L分子量较大（327 kD），最终没有成功构建ASH1L过表达的细胞株，因此本研究没有从过表达实验证实ASH1L对TNBC表型的影响，这是其中不足之处。由于ASH1L是一个表观遗传修饰酶，其在细胞中通过影响组蛋白的甲基化修饰进而调控多个基因的表达。文献报道ASH1L还可以通过协调其他的表观遗传机制，共同影响靶基因的转录[26]。本研究虽证实了ASH1L对TNBC的恶性生物学行为的影响，但是ASH1L在TNBC中的靶基因及ASH1L如何通过表观遗传修饰影响染色质的结构，进而调控靶基因表达的详细机制是后续研究的重点。

综上所述，本研究通过体内外实验，明确了ASH1L对TNBC恶性表型的影响，发现ASH1L在TNBC中发挥促癌作用，在表观遗传层面为TNBC的治疗提供了新的潜在靶点和理论依据。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Effect of ASH1L on the proliferation,cell cycle,and apoptosis of triplenegative breast cancer cells

HAN Xiaoxiao1 ZHANG Jinbao2 TIAN Huizhen1 WU Wenwen3

1.Department of Laboratory Medicine,Xi’an Maternal and Child Health Care Hospital,Shaanxi Province,Xi’an 710002,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,Shaanxi Provincial People’s Hospital,Shaanxi Province,Xi’an 710068,China;3.Medical Laboratory Center,Northwest Women’s and Children’s Hospital,Shaanxi Province,Xi’an 710061,China

[Abstract] Objective To investigate the effect and function of ASH1L on the malignant phenotype of triple-negative breast cancer (TNBC).Methods The expression of ASH1L in human breast epithelial cells and human breast cancer cells was detected by RT-qPCR and Western blot.Control cells and experimental cells with stable ASH1L knockdown were constructed in MDA-MB-231 through lentiviral infection.The effect of ASH1L on TNBC cell proliferation was assessed using the CCK8 assay.The effect of ASH1L on TNBC cell apoptosis and cell cycle distribution was evaluated by flow cytometry.MDA-MB-231 cells and ASH1L knockdown MDA-MB-231 cells were inoculated subcutaneously into nude mice to establish the breast cancer xenograft model in control and experimental groups,and the tumors were excised and weighed on day 21 post-inoculation.Results Compared with normal breast epithelial cells,ASH1L mRNA and protein was overexpressed in TNBC cells(P＜0.01),with the highest expression in MDA-MB-231 cells.Short hairpin RNA mediated gene silencing effectively reduced ASH1L expression at both mRNA and protein levels in MDA-MB-231 cells(P＜0.01).CCK8 results showed that the proliferation ability of TNBC cells in the experimental group was reduced compared with the control group(P＜0.05).Flow cytometry results indicated that compared with the control group,the cell cycle of TNBC cells in the experimental group was arrested in G0/G1 phase,and apoptosis increased (P＜0.05).The results of nude mouse subcutaneous tumor-bearing experiment demonstrated that the weight of the xenografts in the experimental group was reduced compared with the nude mice control group (P＜0.05).Conclusion ASH1L is highly expressed in triple-negative breast cancer and promotes the growth of triple-negative breast cancer cells,playing an oncogenic role as a key epigenetic molecular in TNBC.

[Key words] ASH1L;Triple-negative breast cancer;Proliferation;Cell cycle;Apoptosis;Epigenetics

[中图分类号] R737.9

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）08（a）-0013-06

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.22.03

[基金项目] 西安市创新能力强基计划资助项目（22YXYJ 0070）。

[作者简介] 韩肖肖（1990.3-），女，硕士，主要从事肿瘤分子生物学研究工作。

[通讯作者] 吴雯雯（1990.5-），女，硕士，主要从事临床检验诊断学研究工作。

（收稿日期：2025-03-19）

（修回日期：2025-06-19）