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糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最严重的微血管并发症之一，其导致的终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）已成为重大的公共卫生负担。肾小球足细胞损伤在DKD进展中起关键作用[1]。研究表明，线粒体功能障碍及其引发的氧化应激是足细胞损伤的核心机制之一[2]。高糖环境下，足细胞沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，Sirt1）表达下调，导致其下游调控因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ 共激活因子1α（peroxisome proliferatorsactivated receptor gamma coactivator-1α，PGC-1α）活性降低，抑制Sirt1/PGC-1α 通路，损害线粒体生物合成和抗氧化能力，致使活性氧（reactive oxygen species，ROS）过度累积[3]。过量ROS不仅直接损伤线粒体，还可激活半胱氨酸蛋白酶Caspase级联反应、破坏线粒体动力学平衡加剧足细胞损伤[4-5]。因此，改善线粒体功能障碍、减轻氧化应激是延缓DKD进展的重要策略。

钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂（sodium-glucose cotransporter 2 inhibitors，SGLT2i）恩格列净被证实具有独立于其降糖作用之外的肾脏保护作用，研究显示其可以改善DKD小鼠足细胞损伤及线粒体功能障碍[6]。然而，恩格列净是否通过调控关键的Sirt1/PGC-1α 通路改善高糖诱导的足细胞线粒体功能障碍，目前尚未明确。因此，本研究拟通过体外细胞实验，以Sirt1/PGC-1α 通路为切入点，探讨恩格列净对高糖环境下足细胞线粒体功能的影响，旨在为阐释其肾脏保护机制提供新依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

D-葡萄糖（美国Sigma公司，货号：G7021）；恩格列净原药（美国MCE公司，货号：HY-15409R）；ROS检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：S0033S）；线粒体膜电位检测试剂盒（中国Biosharp公司，货号：BL711A）；兔抗人PGC-1α 一抗（澳大利亚Affinity Biosciences公司，货号：AF5395）；兔抗人Sirt1一抗（澳大利亚Affinity Biosciences公司，货号：DF6033）；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（武汉赛尔维生物科技有限公司，货号：GB23303）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（新赛美生物科技有限公司，货号：WB6501）；DMEM培养基（美国Gibco公司，货号：C11995500BT）。CO2 细胞培养箱（德国Binder公司，型号：CB53）；超净工作台（苏州净化设备有限公司，型号：SW-CJ-2FD）；蛋白电泳仪（上海天能科技有限公司，型号：EPS-200）；蛋白转膜仪（上海天能科技有限公司，型号：VE-186）；冷冻高速离心机（德国Eppendorf公司，型号：5920R）；化学成像系统（美国GE公司，型号：5804）；流式细胞仪（美国BD公司，型号：FACS Canto）；共聚焦显微镜（德国Zeiss公司，型号：LSM710）。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠足细胞原代培养选取200～220 g健康SD大鼠，SD大鼠购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。本研究已通过长沙市第一医院伦理委员会批准，伦理批号为（2023）伦会审【基研】第（64）号。大鼠在SPF级环境下饲养，标准屏障系统。动物房饲养条件：温度（22±2）℃，湿度（60±10）%，12 h/12 h光照黑暗循环，自由进食进水。脱颈处死大鼠后，无菌分离肾皮质，依次通过80、150、200目细胞筛，DMEM培养基收集肾小球，放置于37 ℃、5%CO2 恒温恒湿培养箱培养1周后，足细胞传代并采用倒置相差显微镜光镜鉴定。

1.2.2 实验分组足细胞按培养条件不同分为正常对照组、高糖组（30 mmol/L葡萄糖）、恩格列净低浓度组（30 mmol/L葡萄糖+250 nmol/L恩格列净）、恩格列净中浓度组（30 mmol/L葡萄糖+500 nmol/L恩格列净）、恩格列净高浓度组（30 mmol/L葡萄糖+1 000 nmol/L恩格列净）[7]；各组分别培养48 h，DCFH-DA法检测足细胞ROS水平，JC-1法评估足细胞线粒体膜电位，Western blot法检测足细胞PGC-1α 和Sirt1蛋白表达。

1.2.3 DCFH-DA法检测足细胞ROS水平将DCFH-DA探针用无血清培养基按1∶1 000比例稀释。收集细胞后，重悬于稀释好的DCFH-DA溶液中（细胞密度调整为1×106～2×107 个/ml），置于37 ℃培养箱孵育20 min，其间每隔3～5 min轻柔颠倒混匀。孵育结束后，用预冷的无血清培养基洗涤细胞3次，每个样本收集15 000个细胞并用流式细胞仪检测荧光强度，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm，计算各组细胞内ROS的表达水平。实验重复3次。

1.2.4 JC-1法评估足细胞线粒体膜电位将细胞接种于6孔板，PBS轻柔漂洗1次后，每孔加入1 ml培养基与1 ml JC-1染色工作液，37 ℃避光孵育20 min。使用预冷的JC-1染色缓冲液（按说明书配制）清洗细胞2次，补充2 ml新鲜培养基。荧光显微镜下观察：高膜电位时JC-1形成红色荧光聚集体，低膜电位时呈单体绿色荧光，通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变检测到细胞膜电位的变化，检测JC-1单体时把激发光设置为490 nm，发射光设置为530 nm；检测JC-1聚合物时，把激发光设置为525 nm，发射光设置为590 nm。另取细胞经JC-1缓冲液重悬，每个样本收集15 000个细胞，通过流式细胞仪记录的红绿色荧光比值来量化线粒体膜电位。实验重复3次。

1.2.5 Western blot法检测足细胞PGC-1α 和Sirt1蛋白表达裂解细胞提取总蛋白，按目标蛋白分子量配制适宜浓度的SDS-PAGE凝胶。电泳结束后，冰浴条件下以300 mA恒流转膜90 min至PVDF膜。5%脱脂牛奶-TBST溶液室温封闭1 h，依次孵育兔抗人PGC-1α 一抗（稀释倍数1∶1 000），兔抗人Sirt1一抗（稀释倍数1∶1 000）2 h，弃去一抗，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（稀释倍数：1∶9 000）1 h，每次抗体孵育后以TBST洗膜3次（10 min/次）。ECL化学发光试剂显影，Image J软件定量分析条带积分光密度。实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（ pagenumber_ebook=19,pagenumber_book=14

）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 足细胞鉴定

生长活跃的足细胞体积中等为多边形无突起伸出，细胞迅速生长至融合状态，呈铺路石样外观。消化传代后的足细胞继续生长，细胞体和细胞核较增殖状态显著增大，自细胞体伸出明显的树枝样突起，常见双核，相邻细胞间形成连接。见图1。

2.2 高糖对足细胞ROS合成的影响

与正常对照组比较，高糖组ROS水平升高（P＜0.05）；与高糖组比较，恩格列净低、中、高浓度组ROS水平降低（P＜0.05）。见图2。

2.3 高糖对足细胞线粒体膜电位的影响

共聚焦显微镜下显示，正常对照组足细胞线粒体中JC-1以聚合物形式存在，呈红色荧光，细胞质中的绿色荧光弱；高糖组线粒体内红色荧光强度降低，而细胞质中的绿色荧光增强，恩格列净低、中、高浓度组可以部分恢复高糖诱导的线粒体损伤，足细胞线粒体内红色荧光强度增强，而细胞质中的绿色荧光减弱（图3）。流式结果显示，与正常对照组比较，高糖组足细胞内绿色荧光细胞百分率升高（P＜0.05）；与高糖组比较，恩格列净低、中、高浓度组足细胞内绿色荧光细胞百分率下降（P＜0.05）。见图4。

2.4 高糖对足细胞Sirt1、PGC-1α 蛋白表达的影响

Western blot法检测结果显示，与正常对照组比较，高糖组足细胞Sirt1、PGC-1α 蛋白表达下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与高糖组比较，恩格列净中、高浓度组Sirt1蛋白表达升高，恩格列净低、中、高浓度组足细胞PGC-1α 蛋白表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

3 讨论

本课题组前期研究发现，高糖刺激可诱导肾小球系膜细胞ROS生成增加及细胞外基质合成增多，加速肾脏纤维化进程，发现氧化应激是DKD发生和发展的重要环节，拮抗氧化应激对DKD治疗具有重要意义[8]。线粒体不仅是ROS过度产生的主要场所，也是ROS攻击的关键靶点。作为肾小球滤过屏障的核心组分，足细胞线粒体功能障碍已被证实与DKD蛋白尿的发生及肾功能进行性下降密切相关[9]。

本研究结果显示，高糖环境下足细胞内ROS合成显著增加，同时伴随线粒体功能障碍，表现为线粒体膜电位下降。此现象提示高糖可诱导线粒体产生过量ROS，进而损伤呼吸链及线粒体结构，形成“ROS-线粒体损伤”的恶性循环，最终导致足细胞损伤。在糖尿病肾病大鼠模型中亦可观察到氧化应激标志物表达上调、线粒体膜电位降低、足细胞凋亡增加，伴随尿蛋白增加和肾功能的恶化[10]。上述结果提示，线粒体功能障碍是高糖诱导足细胞损伤的关键分子事件，可能成为驱动DKD进展的重要因素。

Sirt1/PGC-1α 信号通路是调控足细胞线粒体能量代谢的核心通路之一。既往研究显示，在局灶节段性肾小球硬化小鼠模型[11]及膜性肾病大鼠模型[12]中，均观察到足细胞Sirt1、PGC-1α 表达下调，并伴随线粒体功能障碍及氧化应激标志物异常。在DKD进展过程中，Sirt1/PGC-1α 通路同样被证实与足细胞线粒体功能障碍和氧化应激相关。费成璆等[13]在DKD大鼠模型中观察到Sirt1、PGC-1α 表达异常，伴随ROS增多，足细胞凋亡相关蛋白Caspase-9、Caspase-3表达上调。体外实验同样发现高糖培养条件下足细胞Sirt1和PGC-1αmRNA水平显著降低，且与线粒体功能障碍呈正相关[14]。本研究结果与上述报道一致，在高糖诱导的足细胞损伤模型中，Sirt1及PGC-1α 蛋白表达水平显著下调，伴随有ROS水平升高且线粒体膜电位降低，提示Sirt1/PGC-1α 通路抑制可能是高糖诱导线粒体功能障碍的重要机制。近期研究证实，线粒体靶向抗氧化剂Mito TEMPO和胎盘间充质干细胞均可通过激活Sirt1/PGC-1α 通路，减轻氧化应激，改善线粒体功能（如提高膜电位、增加ATP合成、减少ROS累积），从而保护DKD足细胞[15-16]。综合本研究及文献报道，推测高糖可能通过抑制Sirt1/PGC-1α通路，削弱线粒体抗氧化防御能力，导致ROS清除失衡，最终加剧线粒体损伤。因此，药理激活Sirt1/PGC-1α 通路有望成为修复足细胞线粒体功能、干预DKD进展的潜在策略。

恩格列净作为SGLT2i家族的重要成员，其可通过调节肾脏血流动力学、抑制炎症反应、减轻氧化应激等多途径延缓DKD进展，但其肾脏保护分子机制尚不完全明确。近年提出的“能量剥夺”假说为理解SGLT2i作用机制提供了新视角。Packer等[17]认为，SGLT2i促进尿糖排泄的作用模式模拟了一种营养剥夺或能量丢失的机体生理状态，可能上调包括Sirt1在内的细胞能量感受器表达。多项研究支持这一观点：Tian等[18]研究发现恩格列净可上调心肌细胞Sirt1表达，抑制线粒体凋亡通路，从而减轻乙醇诱导的心肌损伤；在D-半乳糖诱导的肾脏衰老模型中，恩格列净亦通过增加Sirt1表达及超氧化物歧化酶活性，拮抗氧化应激并发挥抗衰老作用[19]。值得注意的是，同为SGLT2i代表药物的达格列净可通过激活Sirt1/PGC-1α 信号通路增强足细胞自噬，提示该通路可能是SGLT2i类药物的共同作用靶点[20]。尽管既往研究证实恩格列净可改善db/db小鼠足细胞损伤及线粒体功能，但其是否通过调控Sirt1/PGC-1α 通路介导足细胞保护作用尚未明确[21]。本研究通过体外建立高糖诱导的足细胞损伤模型，发现恩格列净干预能显著且呈浓度依赖性地降低足细胞ROS水平、恢复线粒体膜电位；同时，中、高浓度恩格列净可显著上调Sirt1及其下游PGC-1α 的蛋白表达（高浓度组效果更显著）。值得注意的是，恩格列净对Sirt1/PGC-1α 通路的激活效应与其抗氧化及线粒体功能保护作用呈现出高度一致的浓度依赖性变化趋势。这一结果提示，恩格列净可能通过激活Sirt1/PGC-1α 通路，增强线粒体生物合成及抗氧化能力，从而阻断“ROS-线粒体损伤”的恶性循环，发挥足细胞保护作用。

综上所述，线粒体功能障碍是DKD足细胞损伤的关键环节，本研究结果显示，SGLT2i类药物恩格列净可能通过激活Sirt1/PGC-1α 信号通路，恢复足细胞线粒体功能，减轻氧化应激损伤，这可能是其发挥肾脏保护作用的重要分子机制之一。然而，本研究仅为体外细胞实验结果，后续需在DKD动物模型中进一步验证恩格列净对足细胞线粒体功能及Sirt1/PGC-1α通路的调控作用。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

[1]BARUTTA F，BELLINI S，GRUDEN G.Mechanisms of podocyte injury and implications for diabetic nephropathy [J].Clinical science，2022，136（7）：493-520.

[2]LV Z，WANG Z，HU J，et al.LncRNA PVT1 induces mitochondrial dysfunction of podocytes via TRIM56 in diabetic kidney disease[J].Cell Death Dis，2023，15（9）：697.

[3]SHIH-WEI C，CHEN B，MAO Y，et al.Polygala fallax Hemsl.ameliorated high glucose-induced podocyte injury by modulating mitochondrial mPTP opening through the SIRT1/PGC-1α pathway[J].Arch Physiol Biochem，2023，131（2）：135-146.

[4]胡佳，胡童，王旭，等.足细胞线粒体损伤在糖尿病肾脏疾病中的发病机制及治疗药物研究进展[J].中国糖尿病杂志，2021，29（11）：862-866.

[5]GALVAN D L，LONG J Y，GREEN N，et al.Drp1S600 phosphorylation regulates mitochondrial fission and progression of nephropathy in diabetic mice [J].J Clin Invest，2019，129：2807-2823.

[6]LI X，LI Q，JIANG X，et al.Inhibition of SGLT2 protects podocytes in diabetic kidney disease by rebalancing mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes [J].Cell Commun Signal，2023，22（1）：534.

[7]LIANG R，WANG M，XU F，et al.Empagliflozin Ameliorates Kidney Injury in Diabetic Nephropathy via SIRT1 and TXNIP[J].Diabetes，2020，69（Supple 1）：1138.

[8]赵晋晋，皮银珍，周赟，等.西格列汀对高糖环境下人肾小球系膜细胞NF-E2相关因子2/ 抗氧化反应原件通路影响的研究[J].中国糖尿病杂志，2021，12：923-929.

[9]HUANG S，TAN M，GUO F，et al.Nepeta angustifolia C.Y.Wu improves renal injury in HFD/STZ-induced diabetic nephropathy and inhibits oxidative stress-induced apoptosis of mesangial cells[J].J Ethnopharmacol，2020，255：112771.

[10]HAN B，LV Z，HAN X，et al.Harmful Effects of Inorganic Mercury Exposure on Kidney Cells：Mitochondrial Dynamics Disorder and Excessive Oxidative Stress [J].Biol Trace Elem Res，2021，200（4）：1591-1597.

[11]何改丽，翟文生，李冰，等.益气化瘀清热方对SIRT1/PGC-1α 介导的FSGS小鼠足细胞线粒体功能障碍的干预作用[J].中华中医药杂志，2022，37（11）：6828-6831.

[12]张尧，高飞，檀淼，杨凤文，等.丹参多酚酸盐通过AMPK/Sirt1/PGC-1α 信号通路诱导膜性肾病大鼠足细胞自噬的机制[J].中国实验方剂学杂志，2023，29（8）：203-213.

[13]费成璆，吴雪平，高琴，等.SIRT1/PGC-1α 在高糖状态下线粒体氧化应激损伤致足细胞凋亡中的作用[J].中国中西医结合肾病杂志，2023，24（8）：669-673，753-754.

[14]LI L，ZOU J，ZHOU M，et al.Phenylsulfate-induced oxidative stress and mitochondrial dysfunction in podocytes are ameliorated by Astragaloside Ⅳactivation of the SIRT1/PGC1α/Nrf1 signaling pathway [J].Biomed Pharmacother，2024，177：117008.

[15]闫燕，宝群，苗永政，等.线粒体抗氧化剂MitoTEMPO对糖尿病肾脏疾病大鼠肾组织腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息调节因子1/ 过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1α 信号通路及氧化应激影响的研究[J].中国糖尿病杂志，2022，30（4）：284-290.

[16]HAN X，WANG J，LI R，et al.Placental Mesenchymal Stem Cells Alleviate Podocyte Injury in Diabetic Kidney Disease by Modulating Mitophagy via the SIRT1-PGC-1 alpha-TFAM Pathway[J].Int J Mol Sci，2023，24（5）：4696.

[17]PACKER，MILTON.Role of Deranged Energy Deprivation Signaling in the Pathogenesis of Cardiac and Renal Disease in States of Perceived Nutrient Overabundance [J].Circulation，2020，141（25）：2095-2105.

[18]TIAN G，YU Y，DENG H，et al.Empagliflozin alleviates ethanol-induced cardiomyocyte injury through inhibition of mitochondrial apoptosis via a SIRT1/PTEN/Akt pathway[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2021，48（6）：837-845.

[19]FANG R，CHEN J，LONG J，et al.Empagliflozin improves kidney senescence induced by D-galactose by reducing sirt1-mediated oxidative stress [J].Biogerontology，2023，24（5）：771-782.

[20]熊锐，熊哲学，唐明娟，等.达格列净通过增强营养剥夺信号促进糖尿病肾病大鼠足细胞自噬的研究[J].现代生物医学进展，2023，23（12）：2201-2208.

[21]KLIMONTOV V V，KORBUT A I，TASKAEVA I S，et al.Empagliflozin alleviates podocytopathy and enhances glomerular nephrin expression in db/db diabetic mice [J].World J Diabetes，2020，11（12）：596-610.

【作者机构】	中南大学湘雅医学院附属长沙医院内分泌代谢科
【分类号】	R587.1
【基金】	湖南省自然科学基金资助项目（2023JJ60068）湖南省卫生健康委员会课题（D202303066791）。

基于Sirt1/ PGC-1α 通路恩格列净对高糖诱导的足细胞线粒体功能障碍的影响

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