结膜松弛症（conjunctivochalasis，CCH）是指多余、非水肿的球结膜组织堆积在眼球与下睑缘、内外眦部之间形成褶皱，导致干涩、异物感、溢泪等症状[1]。CCH的病因可能与年龄、炎症、机械损伤、紫外线等因素有关[2]。目前，轻症CCH多采用人工泪液、非甾体消炎药等，但仅能缓解症状且长期使用有眼压升高等风险；严重者需手术治疗，但存在手术相关风险[3]。因此，亟须寻求新的预防和治疗手段。课题组前期根据CCH临床表现拟定杞精明目汤，该方可维持泪膜稳定、提高泪液中的黏蛋白，对CCH有良好的治疗效果[4]。但其具体作用机制尚不明确。本研究旨在建立CCH动物模型，通过观察球结膜厚度、炎症因子、相关胶原蛋白及p38的表达情况，探讨杞精明目汤的作用机制，为治疗CCH提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 实验动物

4～5月龄清洁级新西兰兔20只，雌雄不限，体重1.5～2.0 kg，无眼部疾患，购自上海市松江区松联实验动物厂，实验动物生产许可证：SCXK（浙）2018-0005，实验动物合格证：20230523Bezz0606000260，实验动物使用许可证：SYXK（沪）2022-0002。实验动物单笼常规饲养，温度26 ℃，湿度40%～80%，自由饮水和进食，全价颗粒饲料，适应性喂养1周后进行实验。本研究经上海市普陀区中心医院实验动物管理与伦理委员会批准（DWEC-A-202303007）。

1.2 药物

杞精明目汤由枸杞子15 g、黄精20 g、麦冬20 g、茯苓10 g、炙甘草3 g、旱莲草15 g、川芎3 g组成，颗粒剂配比同草药换算配比。颗粒剂为纯药提取，购于江阴天江药业有限公司（批号：2302303）。

1.3 主要仪器与试剂

基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinases-3，MMP-3）（货号：HY-P73297）购于美国MCE公司；抗α-平滑肌动蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）抗体（货号：55135-1-AP）购于武汉三鹰生物技术有限公司；抗p38抗体（货号：100-401-G26）购于美国Rockland公司；抗Ⅱ型胶原蛋白（type Ⅱcollagen，Col lagen Ⅱ）抗体、抗p-p38抗体（货号：ab34712、ab45381）购于美国Abcam公司。

眼前节照相仪（型号：SmartScope M5）购于芬兰OPTOMED公司；光学相干断层扫描仪（型号：HD-4000）购于德国Carl Zeiss公司；电泳仪、电转仪（型号：mini protean 3 cell 1703930）购于美国Bio-Rad公司。

1.4 实验分组及处理

将20只新西兰兔按照随机数字表法分为假模型组、模型组、低剂量组、高剂量组，每组5只。参考Gan等[5]的研究，假模型组球结膜下注射生理盐水0.2 ml，其余三组注射浓度为2.25 μg/ml的MMP-3溶液0.2 ml，隔天注射1次，连续1个月。造模成功后，假模型组与模型组予生理盐水灌胃，低、高剂量组分别灌胃杞精明目汤1、2 g/（kg·次），2次/d，连续1个月。低、高剂量组药物剂量是根据前期究结果，通过人和动物体表面积折算公式计算得出[6]。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 眼前节照相 给药结束后，固定新西兰兔并充分暴露其下方球结膜，使用眼前节照相仪在自然光下拍照。

1.5.2 光学相干断层扫描仪检测球结膜厚度 在造模前、造模成功后1周（造模后）及中药干预后（干预后），固定新西兰兔，轻拉下睑暴露球结膜，在6∶00位角膜缘后3 mm处测量球结膜厚度，每眼测量3次取平均值。

1.5.3 免疫组织化学染色法检测Collagen Ⅱ、α-SMA表达 给药结束后，耳缘静脉注射过量戊巴比妥钠安乐死，取球结膜组织。生理盐水冲洗，4%多聚甲醛固定，脱水、石蜡包埋制作石蜡切片。按照试剂盒说明书进行免疫组织化学染色，光学显微镜下观察并拍片，黄褐色为阳性，根据阳性强度和范围评分。阴性染色记0分，淡黄色(弱阳性)记1分，棕黄色(阳性)记2分，棕褐色(强阳性)记3分；阳性比例＜1%记0分，1%～25%记1分，＞25%～50%记2分，＞50%～75%记3分，＞75%记4分。

1.5.4 酶联免疫吸附试验法检测白细胞介素（interleukin，IL）-17、IL-6、细胞间黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）表达 球结膜组织剪碎后冰上研磨，4 ℃，5 000 r/min离心10 min（离心半径为7 cm），取血清，按照试剂盒说明书测定吸光度。

1.5.5 Western blot法检测p38/p-p38蛋白表达球结膜组织剪碎后加入预冷裂解液，冰上研磨，12 000 r/min离心15 min（离心半径为7 cm），取上清液。蛋白定量后，煮沸5 min。电泳分离蛋白并转移到PVDF膜。5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加p38、p-p38及β-actin一抗（1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），4 ℃孵育过夜，加二抗（1∶5 000），室温孵育1 h后显影，用Image J软件分析结果。

1.6 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组眼前节照相

与假模型组比较，模型组下方球结膜松弛、不紧贴于巩膜，形成褶皱；与模型组比较，低剂量组仍可看到结膜褶皱，但结膜褶皱变小；高剂量组结膜褶皱不明显。见图1。

图1 各组眼前节照相

A：假模型组；B：模型组；C：低剂量组；D：高剂量组。箭头示球结膜褶皱处。

2.2 各组球结膜厚度

造模前，各组球结膜厚度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与造模前比较，模型组，低、高剂量组造模后球结膜厚度变薄（P＜0.05）；与造模后比较，高剂量组干预后球结膜厚度增厚（P＜0.05）。与假模型组比较，模型组造模后、干预后球结膜厚度变薄（P＜0.05）；与模型组比较，低、高剂量组干预后球结膜厚度增厚（P＜0.05）。见图2、表1。

表1 杞精明目汤对球结膜厚度影响（μm，）

注 与同组造模前比较，aP＜0.05，与同组造模后比较，bP＜0.05；与假模型组同期比较，cP＜0.05；与模型组同期比较，dP＜0.05。

图2 各组不同时间点球结膜厚度测量

A：假模型组；B：模型组；C：低剂量组；D：高剂量组。

2.3 各组球结膜组织Collagen Ⅱ、α-SMA评分比较

与假模型组比较，模型组Collagen Ⅱ、α-SMA评分降低（P＜0.05）。与模型组比较，高剂量组CollagenⅡ、α-SMA评分升高（P＜0.05）。高、低剂量组CollagenⅡ评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与低剂量组比较，高剂量组α-SMA评分升高（P＜0.05）。见图3～6。

图3 各组球结膜组织Collagen Ⅱ免疫组织化学染色结果（200×）

A：假模型组；B：模型组；C：低剂量组；D：高剂量组。

图4 各组球结膜Collagen Ⅱ评分比较（n=5）

与假模型组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。Collagen Ⅱ：Ⅱ型胶原蛋白。

图5 各组球结膜α-SMA免疫组织化学染色结果（200×）

A：假模型组；B：模型组；C：低剂量组；D：高剂量组。

图6 各组球结膜α-SMA评分比较（n=5）

与假模型组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05。α-SMA：α-平滑肌动蛋白。

2.4 各组球结膜组织IL-17、IL-6、ICAM-1表达水平比较

与假模型组比较，模型组IL-17、IL-6、ICAM-1表达水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、高剂量组IL-17、IL-6、ICAM-1表达水平降低（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组IL-17、IL-6、ICAM-1表达水平降低（P＜0.05）。见图7。

图7 各组IL-17、IL-6、ICAM-1表达水平（n=5）

与假模型组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05。IL：白细胞介素；ICAM-1：细胞间黏附分子1。

2.5 各组球结膜组织中p38/p-p38蛋白表达比较

各组p38蛋白表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与假模型组比较，模型组p-p38蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、高剂量组p-p38蛋白表达降低（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组p-p38蛋白表达降低（P＜0.05）。见图8。

图8 各组球结膜组织中p38/p-p38蛋白表达比较

A：蛋白条带图；B：各组p38蛋白表达情况（n=5）；C：各组p-p38蛋白表达情况（n=5）。与假模型组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05。

3 讨论

CCH是一种年龄相关性眼病[7]。中医学将其归为“干涩昏花”范畴，临床上以肝肾阴虚型多见[8]。杞精明目汤具有滋补肝肾、健脾益气的功效[4]；药理学研究表明，该方中多种生物活性成分（如枸杞多糖）具有抗衰老、抗氧化、抗炎等作用[9-10]。鉴于临床缺乏有效防治CCH的药物，深入探究杞精明目汤的作用机制十分必要。

前期研究发现，CCH患者球结膜厚度薄于正常人，且随着年龄的增长逐渐变薄[11]。本研究结果显示，与假模型组比较，模型组球结膜厚度变薄；与模型组比较，高剂量组球结膜厚度增厚。MMPs几乎可降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中的所有分子，尤其是胶原蛋白和弹性纤维[12-13]。肌成纤维细胞可分泌高水平的ECM蛋白，α-SMA是其特异性标志物[14-16]。本研究结果显示，与假模型组比较，模型组CollagenⅡ、α-SMA评分降低；与低剂量组比较，高剂量组α-SMA评分升高；提示该方可促进ECM修复从而治疗CCH。

IL-17、IL-6是重要的炎症因子，可促进细胞中MMPs表达[17-18]。ICAM-1介导黏附反应，IL-17以p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）依赖性方式增加其表达[19]。研究表明，CCH患者泪液和血清中IL-6、IL-17及ICAM-1水平显著升高，且与疾病严重程度相关[20-21]。本研究结果显示，杞精明目汤可降低IL-17、IL-6和ICAM-1的表达，发挥抗炎作用。p38 MAPK参与细胞凋亡、炎症反应等多种过程，CCH中p38表达高于正常结膜组织，并上调MMPs表达[22-24]。前期实验发现，杞精明目汤可降低结膜成纤维细胞中p-p38蛋白表达[25]。本研究通过动物模型也证实了p38 MAPK在CCH的发病机制中起作用，为CCH提供新的治疗靶点。

本研究存在一定的局限性：①本研究样本量相对较小，可能影响结果的普适性；②目前临床缺乏有效防治CCH的药物，因此本研究未设置阳性药物对照组；③杞精明目汤成分相对复杂，具体起效成分及其作用机制还需进一步研究。

综上所述，杞精明目汤可增加球结膜厚度，增加球结膜组织中Collagen Ⅱ、α-SMA的表达，降低IL-17、IL-6、ICAM-1的表达，并抑制p38磷酸化从而有效治疗CCH，为该自拟方的作用机制和临床用药提供理论依据，也为中医中药的有效推广奠定实验基础。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1] MARMALIDOUA，KHEIRKHAHA，DANAR.Conjunctivochalasis：a systematic review[J].Surv Ophthalmol，2018，63（4）：554-564.

[2] YVON C，PATEL B，MALHOTRA R.Conjunctivochalasis[J].Int Ophthalmol Clin，2023，63（3）：209-223.

[3] MARMALIDOU A，PALIOURA S，DANA R，et al.Medical and surgical management of conjunctivochalasis [J].Ocul Surf，2019，17（3）：393-399.

[4] 周欢明，项敏泓，麻凯，等.杞精明目汤联合人工泪液对结膜松弛症临床疗效及细胞衰老的影响[J].国际眼科杂志，2020，20（6）：1079-1082.

[5] GAN J Y，LI Q S，ZHOU H M，et al.A preliminary study on the establishment of an animal model of conjunctivochalasis [J].Int J Ophthalmol，2018，11（6）：899-904.

[6] 沙咏怡，赵怡，涂少华，等.杞精明目汤联合人工泪液对肝肾阴虚型结膜松弛症患者泪液中Th17相关细胞因子的影响[J].国际眼科杂志，2025，25（1）：31-36.

[7] ZHAO Y，HUANG L，XIANG M，et al.Trends in conjunctivochalasis research from 1986 to 2017：A bibliometric analysis[J].Medicine（Baltimore），2018，97（39）：e12643.

[8] 文杭，宋正宇，刘江，等.老年结膜松弛症患者中医证候及证型的相关研究[J].中国中医眼科杂志，2021，31（12）：863-867.

[9] QI Y，DUAN G，FAN G，et al.Effect of Lycium barbarum polysaccharides on cell signal transduction pathways[J].Biomed Pharmacother，2022，147：112620.

[10] 王雨心，李金洋，胡婷婷.枸杞子化学成分和药理作用研究进展[J].广州化工，2024，52（24）：1-4.

[11] ZHANGX，LIQ，XIANGM，et al.Bulbarconjunctivalthickness measurements with optical coherence tomography in healthy chinese subjects [J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2013，54（7）：4705-4709.

[12] DE MARTINO D，BRAVO-CORDERO J J.Collagens in Cancer：Structural Regulators and Guardians of Cancer Progression[J].Cancer Res，2023，83（9）：1386-1392.

[13] DE ALMEIDA L G N，THODE H，ESLAMBOLCHI Y，et al.Matrix Metalloproteinases：From Molecular Mechanisms to Physiology，Pathophysiology，and Pharmacology[J].Pharmacol Rev，2022，74（3）：712-768.

[14] LENDAHL U，MUHL L，BETSHOLTZ C.Identification，discrimination and heterogeneity of fibroblasts[J].Nat Commun，2022，13（1）：3409.

[15] VENUGOPAL H，HANNA A，HUMERES C，et al.Properties and Functions of Fibroblasts and Myofibroblasts in Myocardial Infarction[J].Cells，2022，11（9）：1386.

[16] ANGELINI A，TRIAL J，ORTIZ-URBINA J，et al.Mechanosensing dysregulation in the fibroblast：A hallmark of the aging heart[J].Ageing Res Rev，2020，63：101150.

[17] JIANG J，WU Q，RAJASEKARAN S，et al.MMP3 at the Crossroads：Linking Molecular Pathways to Disease Diagnosis and Therapy[J].Pharmacol Res，2025，216：107750.

[18] 徐春晴，夏泽梅，刘晓嵘，等.白介素-17介导炎症反应与干眼症[J].临床个性化医学，2024，3（4）：2332-2336.

[19] LIAO J，YU X，HUANG Z，et al.Chemokines and lymphocyte homing in Sjogren’s syndrome [J].Front Immunol，2024，15：1345381.

[20] MA K，ZHOU H，ZHANG W，et al.Study of IL-17 and Intercellular Adhesion Molecule-1 in Conjunctivochalasis Using Correlation Analysis[J].Cornea，2024，43（5）：537-544.

[21] MA K，LIU J，SHA Y，et al.Qi Jing Mingmu decoction inhibits the p38 signaling pathway in conjunctivochalasis fibroblasts by down-regulation of Th17 cell differentiation[J].J Ethnopharmacol，2023，301：115812.

[22] JIA Y L，LIU X J，WEN H，et al.The expression of MAPK signaling pathways in conjunctivochalasis [J].Int J Ophthalmol，2019，12（11）：1801-1806.

[23] JANG H Y，KIM G B，KIM J M，et al.Fisetin Inhibits UVAInduced Expression of MMP-1 and MMP-3 through the NOX/ROS/MAPK Pathway in Human Dermal Fibroblasts and Human Epidermal Keratinocytes[J].Int J Mol Sci，2023，24（24）：17358.

[24] KARAYIANNIS I，MARTINEZ-GONZALEZ B，KONTIZAS E，et al.Induction of MMP-3 and MMP-9 expression during Helicobacter pylori infection via MAPK signaling pathways[J].Helicobacter，2023，28（4）：e12987.

[25] XIANG M，LIU J，MA K，et al.The mechanism of Qijing Mingmu decoction on cellular senescence of conjunctivochalasis[J].BMC Complement Med Ther，2023，23（1）：302.

Explore the mechanism of action of Qijing Mingmu Decoction in the treatment of conjunctivochalasis based on MMP-3 animal modeling

KONG Xueqing1 YANG Can2 TAO Nixia1 YI Chenglong1 WANG Binxin1 XIANG Minhong1,2

1.Department of Ophthalmology,Putuo Hospital,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200062,China;2.Shanghai Putuo Center Clinical College,Anhui Medical University,Shanghai 200062,China

[Abstract] Objective To establish a conjunctivochalasis (CCH)model induced by matrix metalloproteinases-3(MMP-3)and investigate the therapeutic effects and mechanisms of Qijing Mingmu Decoction on CCH.Methods Twenty clean New Zealand rabbits aged 4-5 months were divided into sham model group,model group,low-dose group,and high-dose group according to the random number table method.In the sham model group,normal saline was injected subconjunctival,while in the other three groups,0.2 ml of MMP-3 solution was injected once every other day for one month.After successful modeling,the sham model group and model group were given normal saline by gavage,while the low-dose and high-dose groups were respectively given Qijing Mingmu Decoction at a dose of 1 g/(kg·time) and 2 g/(kg·time) twice a day for one month.The conjunctival folds of rabbits in each group were observed;the bulbous conjunctival thickness of each group before modeling,one week after successful modeling (after modeling),and after traditional Chinese medicine intervention(after intervention)were compared;the expressions of CollagenⅡand α-smooth muscle actin (α-SMA) were detected by immunohistochemical staining;theexpressionsofinterleukin(IL)-17,IL-6,andintercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1)were detected by enzyme-linked immunosorbent assay;and the expression of p38/p-p38 protein was detected by Western blot.Results The model group exhibited conjunctival laxity with visible folds;low-dose group had smaller folds,while high-dose group had minimal folds.Compared with before modeling,the bulbar conjunctival thickness in model group,low-dose and high-dose groups became thinner after modeling(P＜0.05);compared with after modeling,the bulbar conjunctival thickness increased in high-dose group after intervention(P ＜0.05).Compared with sham model group,the bulbar conjunctival thickness in model group became thinner after modeling and intervention (P＜0.05);compared with model group,the bulbar conjunctival thickness increased in low-dose and high-dose groups after intervention (P ＜0.05).Compared with sham model group,the scores of Collagen Ⅱand α-SMA in model group were decreased (P＜0.05).Compared with model group,the scores of Collagen Ⅱand α-SMA in high-dose group increased (P＜0.05).There was no statistically significant difference in the scores of Collagen Ⅱbetween high-dose and low-dose groups (P ＞0.05);compared with low-dose group,the score of α-SMA in high-dose group increased (P＜0.05).Compared with sham model group,the expression levels of IL-17,IL-6,ICAM-1 and the protein expression of p-p38 in model group increased(P＜0.05);compared with model group,the expression levels of IL-17,IL-6,ICAM-1 and the protein expression of p-p38 in low-dose and high-dose groups decreased (P＜0.05);compared with low-dose group,the expression levels of IL-17,IL-6,ICAM-1 and the protein expression of p-p38 in high-dose group decreased(P＜0.05).Conclusion Qijing Mingmu Decoction effectively treats CCH by increasing the thickness of the bulbar conjunctival and the expression of Collagen Ⅱand α-SMA,reducing the expression of IL-17,IL-6,and ICAM-1,and inhibiting the phosphorylation of p38.

[Key words] Conjunctivochalasis;Animal model;Qijing Mingmu Decoction;Matrix metalloproteinases-3;Inflammatory factors

[中图分类号] R77.3；R289.5

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）08（c）-0001-07

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.24.01

[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（82074495）；上海市东方英才计划拔尖项目（2024DFYC）；上海市普陀区中心医院临床匠才计划项目（2022-RCJC-06）。

[作者简介] 孔雪晴(1996.10-)，女，上海中医药大学附属普陀医院2022级中西医结合临床专业在读硕士研究生，主要从事眼表泪液学疾病的中西医结合研究工作。

[通讯作者] 项敏泓（1977.12-），女，博士，主任医师，副教授，博士生导师，上海中医药大学附属普陀医院眼科主任，主要从事眼表泪液学疾病的中西医结合研究工作。

（收稿日期：2025-05-06）

（修回日期：2025-07-02）