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类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以关节滑膜和周围软组织损伤为特征的自身免疫性疾病，正常情况下，成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）在关节内发挥着维持关节腔结构与功能的生理作用，但在RA的病理条件下，类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（rheumatoid arthritis-fibroblast-like synoviocytes，RA-FLS）具有类似肿瘤细胞样异常增殖和过度迁移的特性，在RA的发生和发展中起着重要作用。有效地抑制RA-FLS的增殖与迁移，可延缓RA的疾病进程[1]。近年来，天然黄酮类化合物芹菜素（apigenin，Api）能够通过诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期进程及抑制上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）等关键机制发挥抗肿瘤等生物学效应[2-4]；由于RA-FLS具有类肿瘤样细胞特性，提示Api可能通过调控RA-FLS的生物学行为影响RA的疾病进程。本课题组前期研究发现，Api可以通过调控Hippo通路效应分子表达来调节肿瘤细胞的迁移、侵袭和自噬[5]。在此基础上，本研究旨在揭示Api通过干预Hippo通路抑制RA-FLS迁移的分子机制，以期为临床治疗RA提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

RA-FLS购于上海赛齐生物技术有限公司（货号：CG2301）；正常成纤维细胞样滑膜细胞（negative control-fibroblast-like synoviocytes，NC-FLS）购于广州詹尼奥生物科技有限公司（货号：GB-FLS-N01）；空腺病毒载体对照（adenovirus control，AdC）、过表达YAP腺病毒（adenovirus-YAP，AdYAP）购于山东维真生物科技有限公司（货号：ADV-CON-01、ADV-YAP）；Api购于美国Selleckchem公司，Api的分子式为C15H10O5（CAS号：520-36-5，货号：S9125）；RPMI-1640、DMEM培养基购于赛维尔生物科技有限公司（货号：G4532、G4538）；胎牛血清购于赛默飞世尔科技有限公司（货号：10099-141）；RNAiso Plus购于宝日医生物技术（北京）有限公司（货号：9108）；Transwell细胞培养小室、96孔板购于美国Corning公司（货号：3413、701002）；结晶紫染色液、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）购于上海碧云天生物技术有限公司（货号：C0121、AF2819）；磷酸盐缓冲液购于武汉普诺赛生命科技有限公司（货号：GPB180327）；多聚甲醛溶液购于武汉艾美捷科技有限公司（货号：A-CSH467）；RIPA组织/细胞裂解液、Cell-LightTM EdU Apollo in Vitro Kit购于锐博生物科技有限公司（货号：R0010、C10310）；BCA蛋白定量检测试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒购于新赛美生物科技有限公司（货号：BCA02、P10200）；细胞核/细胞质蛋白提取试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司（货号：R0050）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞分组及细胞培养实验分为以下几组：①研究Api对RA-FLS的影响。NC-FLS组作为对照组，用于比较RA-FLS与正常滑膜细胞之间的差异；RA-FLS组作为模型组，用于模拟RA病理条件下的细胞状态；RA-FLS加用不同浓度Api处理，分成低浓度Api组（20 μmol/L）、中浓度Api组（30 μmol/L）、高浓度Api组（40 μmol/L），用于评估不同浓度Api对RAFLS增殖和迁移的影响[6]。②RA-FLS+Api（30 μmol/L）组作为Api处理组，用于研究Api对RA-FLS中YAP表达的影响。③研究Api对RA-FLS中YAP表达对细胞迁移的影响。构建了以下细胞模型：RA-FLS+AdC组作为过表达对照组；RA-FLS+AdYAP组（YAP过表达组），通过腺病毒介导的YAP过表达，研究YAP对RA-FLS迁移能力的影响；RA-FLS+AdYAP+Api（30 μmol/L）组（过表达Api处理组），在YAP过表达的RA-FLS中加入Api，观察Api对YAP过表达细胞迁移能力的影响。

所有细胞均培养于RPMI-1640培养基（含15%胎牛血清和1%青霉素/链霉素）中，于37 ℃、5%CO2 的温箱中培养。

1.2.2 细胞增殖实验接种RA-FLS于96孔板，采用Cell-LightTM EdU Apollo in Vitro Kit按照说明书操作检测各组细胞的EdU阳性细胞率的改变，EdU阳性细胞率=（EdU阳性细胞数/总细胞数）×100%，使用Image J软件对条带灰度值进行定量分析，测量结果重复3次。

1.2.3 细胞迁移实验 Transwell细胞迁移实验按照课题组前期发表的论文中的方法进行[7]。简而言之，细胞经胰蛋白酶消化后，重新悬浮于无血清培养基中，将5×104 个细胞接种于Transwell小室的上室，下室则加入含有10%胎牛血清作为化学吸引剂600 μl培养，在37 ℃、5%CO2 的条件下孵育24 h后，用棉签拭去未迁移的细胞，迁移至下室的细胞经4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色20 min，随后用磷酸盐缓冲液冲洗。显微镜下进行图像采集、统计，分析细胞迁移情况，测量结果重复3次。

1.2.4 Western blot法使用RIPA裂解缓冲液（添加含蛋白酶/磷酸酶抑制剂）裂解RA-FLS，提取细胞的总蛋白；使用细胞核/细胞质蛋白提取试剂盒分别提取RA-FLS中细胞核和细胞质蛋白。Western blot法检测按照本课题组前期发表的论文中方法进行[8]。GAPDH作为总蛋白或细胞质蛋白的内参，组蛋白H3作为细胞核蛋白的内参，实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用GraphPadPrism9.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（

）表示，比较采用t检验；通过Bartlett检验对数据的方差齐性假设进行了验证，确保数据满足方差分析的前提条件；多组间比较，采用方差分析来评估各组数据之间是否存在显著性差异；若方差分析结果显示存在显著性差异，则进一步采用Bonferroni校正方法进行多重比较校正，以明确具体组间的差异并控制Ⅰ类错误的发生率。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Api对RA-FLS的细胞增殖、迁移的影响

模型组EdU阳性细胞数高于对照组（P＜0.05）；低浓度Api组EdU阳性细胞数与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），中、高浓度Api组低于模型组（P＜0.05）。见图1A～B。与对照组比较，模型组的细胞迁移能力增强（P＜0.05），低浓度Api组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），中、高浓度Api组低于模型组（P＜0.05）。见图1C～D。本研究选择30 μmol/L Api浓度作为后续实验的研究浓度。

2.2 Api对RA-FLS中Hippo通路效应分子YAP表达的影响

与对照组比较，模型组中YAP蛋白表达水平增加（P＜0.05），与模型组比较，Api处理组YAP蛋白表达水平降低（P＜0.05）。见图2A～B。与过表达对照组比较，YAP过表达组YAP蛋白表达水平增加（P＜0.05），与YAP过表达组比较，过表达Api处理组YAP蛋白表达水平降低（P＜0.05）。见图2C～D。

2.3 Api可通过调控RA-FLS中YAP表达影响细胞的迁移

与过表达对照组比较，YAP过表达组RA-FLS迁移能力增强（P＜0.05），与YAP过表达组比较，过表达Api处理组细胞的迁移能力下降（P＜0.05）。见图3A～B。

3 讨论

RA作为一种自身免疫性疾病，其病理特征包括关节滑膜的炎症、血管翳的形成及骨质的破坏。RA-FLS是滑膜衬里层的主要细胞类型，通过过度分泌基质金属蛋白酶和炎症因子，这些细胞不仅获得侵袭性生长能力，破坏软骨及骨基质，还能通过血液循环迁移至远端关节形成新病灶，其异常增殖和活化参与了炎症反应、骨破坏和滑膜增生等病理过程，在RA的发生和发展中起着至关重要的作用[9-10]。因此，寻找调控RA-FLS增殖、迁移和侵袭等过程的关键驱动基因，并明确其作用的具体分子机制，对于临床发掘RA的潜在治疗药物具有重大指导意义。

Api是一种广泛存在于水果和蔬菜中的黄酮类化合物，主要以芹菜素-7-O-葡萄糖苷及其乙酰化衍生物形式存在，其主要存在于芹菜、半枝莲中，在瑞香科、马鞭草科、卷柏科等植物和西藏雪莲花、车前子等中草药中也有分布。Api分子量约为270，化学名称为4，5，7-三羟基黄酮，分子式为C15H10O5，其结构式中C4’、C5’和C7’上的3个羟基和C2C3 双键决定了其独特的生物学作用和药理活性，其中3个羟基为黄酮类化合物所共有，可发挥结合并清除活性自由基的作用[11-12]。目前Api在抗肿瘤领域的研究已取得显著进展，多项研究表明，该化合物通过G2/M期细胞周期阻滞抑制肾细胞癌、前列腺癌等的细胞增殖[13-14]；通过调控基质金属蛋白酶-2/9、Snail/Slug等转移相关蛋白及E-cadherin/β-catenin复合物，有效抑制胰腺癌、乳腺癌等的迁移和侵袭能力[3,15-16]；这种多靶点调控特性源于其对PI3K/Akt/MTOR、JAK/STAT、NF-κB和ERK/MAPK路等关键信号通路的干预，提示其在病理细胞行为调控中具有广泛作用[17]。RA-FLS具有类似肿瘤细胞的异常增殖和过度迁移的特性，在RA的疾病进程中起着重要作用，基于上述Api抗肿瘤机制，本研究探讨了Api对RA-FLS的作用，通过细胞增殖实验发现，随着Api浓度的增加，EdU阳性细胞的数量逐渐减少，当Api的作用浓度达到30 μmol/L时，EdU阳性细胞数显著减少；Transwell细胞迁移实验显示了不同处理条件下细胞的迁移情况，结果显示模型组的细胞迁移能力明显增强，而加入Api处理后，RA-FLS的细胞迁移能力逐渐降低，当Api浓度为30 μmol/L时，可以显著抑制细胞迁移。本研究结果显示，Api以浓度依赖的方式抑制RA-FLS的细胞增殖和迁移，这一发现提示Api可能通过对RA-FLS的调控作用，影响RA的疾病进程，这凸显了天然化合物作用的独特优势，为开发新型RA治疗策略提供了重要实验依据。

Hippo信号通路作为高度保守的细胞调控网络，通过调节细胞增殖、凋亡和迁移等核心生物学过程维持组织稳态，YAP作为Hippo通路下游的关键效应分子，具有转录共激活因子的功能，在细胞核中，YAP与转录增强缔合域家族结合转录，调控多种基因的表达，从而影响细胞的生物学行为[18-19]。有研究发现，YAP在RA滑膜组织中被发现异常活化，其表达水平与滑膜炎症程度及RA-FLS的异常迁移能力呈正相关，靶向抑制YAP可显著改善关节炎进程，这为探索新型治疗靶点提供了重要方向[20-21]。基于上述机制关联，本研究通过Western blot法发现，与对照组比较，模型组中YAP蛋白表达显著上调（P＜0.05），而经Api处理后，YAP表达下降，揭示Api可能通过调控Hippo/YAP信号轴干预RA进程，为Api在RA治疗中的潜在应用提供分子机制支持，提示其可能通过调节YAP表达抑制RA-FLS迁移，发挥抗炎等作用，也提示YAP可能是RA治疗的潜在靶点。进一步的YAP过表达细胞模型实验显示，与过表达对照组比较，YAP过表达组的YAP蛋白表达水平显著上调，但加入Api处理后YAP蛋白表达下降；Transwell实验显示，过表达YAP增强了RA-FLS的迁移能力，而加入30 μmol/L的Api后这种增强被明显抑制。该发现为天然化合物干预信号通路治疗RA提供了直接证据。

综上所述，本研究结果显示Api可能通过调控Hippo通路效应分子影响RA-FLS的增殖和迁移等生物学行为，为临床治疗RA提供新的思路。

本研究创新性地揭示了Api通过调控Hippo信号通路中的关键效应分子YAP的表达，有效抑制RA-FLS的增殖与迁移，为RA的治疗提供了新的治疗靶点和研究方向。与传统RA治疗药物（如JAK抑制剂）比较，Api作为天然化合物，展现出独特优势：其具备多靶点调控能力，能同时干预RA复杂的病理环节；且安全性高、毒副作用小，具有良好的开发潜力。然而，本研究也存在一些局限性。首先，研究主要集中在RA-FLS上，而RA的发病机制涉及多种免疫细胞的相互作用，因此需要进一步研究Api对其他免疫细胞（如T细胞、B细胞和巨噬细胞）的影响，以全面评估其在RA治疗中的潜力；其次，目前的研究仅限于体外实验，缺乏体内的验证，因此，未来需要在动物模型中进行深入研究，以验证Api在体内的疗效和安全性。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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【作者机构】	扬州大学附属医院风湿免疫科
【分类号】	R285.5
【基金】	国家自然科学基金资助项目（82101890）江苏省自然科学基金项目（BK20190904）。

基于Hippo通路效应分子探讨芹菜素抗类风湿关节炎的作用及可能机制

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