中药天花粉蛋白（trichosanthin，Tk）是葫芦科草本 植物栝楼块根中提取的单体蛋白质，用药历史悠久，古人用于治疗痈疮肿毒、止肺热、通月水；近代研究发现其抗艾滋、抗早孕及抗肿瘤功效[1-2]。本课题组前期研究发现低剂量Tk具有负向免疫调节功能，每只小鼠注射1 μg Tk即可抑制同种异体皮肤和心脏移植免疫排斥反应，诱导生成髓系抑制性细胞[3-5]。调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）是一群具有负向免疫调节功能的细胞，分为CD4和CD8 Treg，参与维持机体免疫稳态[6-8]。本研究将探讨Treg在Tk发挥负向免疫调节过程中的作用。然而，深入研究发现Tk疏水性氨基酸比例高，水溶性差，且三级结构不稳定，存在半衰期短、代谢快、生物利用度低等问题。

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-聚乳酸羟基乙酸（polylactic glycolic acid，PLGA）共聚物是包载难溶性药物的最佳纳米材料，PEG是亲水端，PLGA为疏水端，具有高包封率、高生物相容性、缓释、低毒等特点，目前用于递送阿霉素、顺铂、紫杉醇等抗肿瘤药物，提高了药物水溶性、靶向性和抗肿瘤疗效，还可用于载血红蛋白，稳定性和生物相容性较高[9-13]。本研究为提高Tk水溶性、稳定性和生物利用度，拟采用FITC标记Tk便于示踪，构建载FITC-Tk的PEG-PLGA荧光纳米颗粒，探究其负向免疫调节功能，以期为Tk的临床应用提供新的思路[14]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验仪器 Sorvall ST1 R Plus台式冷冻离心机（美国Thermo Fisher公司）；SP8激光扫描共聚焦显微镜（德国Leica公司）；JY92-Ⅱ超声细胞粉碎机（宁波新芝生物科技有限公司）；R-200旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；Malvern Zetasizer Nano ZS激光粒度仪（英国Malvern公司）；LSRFortessa X20流式分析仪（美国BD公司）。

1.1.2 实验试剂Tk粉末购于上海金山制药有限公司（批号：170106）；FITC（货号：60514ES60）购于翌圣生物科技（上海）股份有限公司；PLGA-PEG购于济南聚福凯生物技术有限公司；流式抗体CD4（货号：17-0042-82）、CD25（货号：11-0257-42）、Foxp3（货号：48-5773-82）均购于美国英潍捷基公司；CD8（货号：140417）、CD28（货号：102105）、CD122（货号：123215）、CD103（货号：121431）均购于美国Biolegend公司。

1.1.3 实验动物 雌性C57BL/6小鼠，6～8周龄，体重20～22 g，购于上海灵畅生物科技有限公司，实验动物生产合格证号：20230003005532，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2023-0003，饲养于上海交通大学医学院动科部SPF级屏障环境。本研究经上海交通大学医学院实验动物管理和使用委员会批准（JUMC2023-140-A）。

1.2 研究方法

1.2.1 FITC标记Tk Tk粉末用PBS配制母液，调pH值8～9，稀释得到3、4、5 mg/ml Tk浓度，分别作为低、中、高浓度标记组，每组加入2 mg/ml的FITC溶液（约200 μl）4 ℃搅拌过夜[15-16]。使用葡聚糖G25凝胶柱过滤得FITC-Tk溶液并检测蛋白浓度。

1.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞分离 研磨小鼠脾脏成单个细胞后过70 μmol/L细胞筛，使用红细胞裂解液充分裂解，加入PBS终止并离心即得单个脾脏淋巴细胞。

1.2.3 流式细胞术检测FITC荧光标记效率 小鼠脾脏淋巴细胞按每孔5×105 个细胞密度均匀铺板，设置对照组和FITC-Tk组（1 μg/ml）[3-4,17-18]，置于5%CO2培养箱，37 ℃恒温培养24 h，流式检测每个细胞中FITC的荧光强度。

1.2.4 激光共聚焦观察Tk在细胞中的定位 收集FITC-Tk处理后的细胞，DAPI染核15 min，封片后置于激光共聚焦显微镜下观察FITC-Tk的定位情况。

1.2.5 PEG-PLGA-FITC-Tk纳米递药系统的构建及包封率、载药量计算 使用乙醚（逆相蒸发法）或二氯甲烷（单乳法和复乳法）配制PLGA-PEG溶液（5 mg/ml），加入FITC-Tk溶液200 W功率超声50 s（复乳法需超声2次），再加胆酸钠溶液（5 mg/ml）混匀后旋转蒸发，11 000 g离心得纳米沉淀，超纯水重悬并检测Tk含量，计算包封率、载药量参数，具体计算公式如下：包封率=实际载药物质量/投入药物质量×100%，载药量=实际载药物质量/纳米粒总质量×100%。

1.2.6 纳米粒径和Zeta电位的检测 使用Malvern Zetasizer Nano ZS激光粒度仪检测粒径和Zeta电位是否符合标准。

1.2.7 Nano-Tk免疫调节功能检测 小鼠淋巴细胞铺板，设置空白组、对照组（淋巴细胞体外增殖体系，即加入刺激剂anti-CD3/28，浓度为1 μg/ml[18-19]）、细胞因子诱导组（在增殖体系中加入细胞因子转化生长因子-β 和白细胞介素-2，浓度分别为5、10 ng/ml[18,20]）、Tk诱导组（在细胞因子诱导体系中加入Tk，浓度为1 μg/ml[3-4,17-18]）和Nano-Tk诱导组（在细胞因子诱导体系中加入Nano-Tk，浓度为1 μg/ml），流式检测CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD103+CD8+Treg、CD122+CD8+Treg和CD28-CD8+Treg细胞比例。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 8软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FITC-Tk荧光标记效率及其在脾脏淋巴细胞中的定位

中浓度标记组的FITC荧光标记效率高于低浓度标记组（P＜0.05）（图1A）。流式结果显示，FITC-Tk组中约71%的细胞呈FITC阳性（图1B），且激光共聚焦显微镜观察到Tk-FITC主要定位于细胞质中（图1C）。

图1 FITC-Tk荧光标记效率及其在脾脏淋巴细胞中的定位

A：不同浓度Tk组FITC荧光标记效率比较。B：流式检测小鼠脾脏淋巴细胞FITC荧光强度；C：激光共聚焦检测FITC-Tk在细胞中的定位情况（上图630×，下图局部再放大3×）。与低浓度标记组比较，aP＜0.05。Tk：天花粉蛋白。

2.2 根据包封率、载药量、粒径和电位等参数筛选Nano-Tk最佳制备方案

复乳法的包封率高于逆相蒸发法和单乳法（P＜0.05）（图2A）；逆相蒸发法的载药量高于复乳法和单乳法（P＜0.05）（图2B）。粒径和Zeta电位检测结果显示，以上3种方法制备的Nano-Tk粒径均在50～70 nm，Zeta电位均在-20 mV左右，均符合纳米药物要求（图2C～F）。逆相蒸发法的载药量最高，但其使用的有机溶剂乙醚微溶于水，存在残留问题，可能影响纳米药物活性，故综合比较得出复乳法是制备Nano-Tk的最佳方法。

图2 3种方法构建的Nano-Tk包封率、载药量、粒径和Zeta电位参数

A：不同方法制备的Nano-Tk包封率比较；与逆相蒸发法比较，aP＜0.05；与单乳法比较，bP＜0.05。B：不同方法制备的Nano-Tk载药量比较；与单乳法比较，aP＜0.05；与复乳法比较，bP＜0.05。C：纳米粒径检测图；D：纳米粒径统计图；E：Zeta电位检测图。F：Zeta电位统计图。Tk：天花粉蛋白。

2.3 复乳法制备的Nano-Tk免疫调节功能探究

流式检测结果显示，与对照组比较，细胞因子诱导组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例上调（P＜0.05）；与细胞因子诱导组比较，Tk诱导组和Nano-Tk诱导组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例升高，且Nano-Tk诱导组高于Tk诱导组（P＜0.05）。见图3。

图3 Nano-Tk体外诱导CD4+Treg

A：各组CD4+Treg细胞比例流式典型图。B.各组CD4+Treg细胞比例统计分析图；与对照组比较，aP＜0.05；与细胞因子诱导组比较，bP＜0.05；与Tk诱导组比较，cP＜0.05。TK：天花粉蛋白。

同时，流式检测CD8+Treg诱导结果显示，与对照组比较，Tk诱导组和Nano-Tk诱导组CD8+CD103+Treg、CD8+CD122+Treg的比例均升高（P＜0.05），且Nano-Tk诱导组CD8+CD103+Treg高于Tk诱导组（P＜0.05）。与对照组比较，Nano-Tk诱导组CD8+CD28-Treg下降（P＜0.05）。见图4。

图4 Nano-Tk体外诱导CD8+Treg

A～B：CD103+CD8+Treg细胞比例流式图和统计分析图；与对照组比较，aP＜0.05；与Tk诱导组比较，bP＜0.05。C～D：CD122+CD8+Treg细胞比例流式图和统计分析图，与对照组比较；aP＜0.05，aaP＜0.01。E～F：CD8+CD28-Treg细胞比例流式图和统计分析图；与对照组比较，aP＜0.05。

3 讨论

Tk是我国中医药库的瑰宝，《神农本草经》记载其“主治消渴，身热烦满”，临床上曾用于抗病毒、抗肿瘤、抗早孕治疗。本课题组报道了低剂量Tk的负向免疫调节作用，在同种异体器官移植、自身免疫病等炎症性疾病中疗效显著[3-4]。但Tk作为由247个氨基酸组成的单体蛋白质，疏水氨基酸比例较高，水溶性较差，导致临床用药生物利用度低，带来不可避免的毒副作用，本研究提出使用PEG-PLGA共聚物搭载Tk构建纳米颗粒为解决以上难题提供了新思路。首先PEG-PLGA具有双亲性，疏水端PLGA分子与Tk共价结合形成稳定的纳米囊泡，亲水端PEG则提高了水溶性和生物利用度，毒副作用降低，在药物制剂领域广泛应用[21-22]；López等[10]报道了PEG-PLGA包裹抗肿瘤多肽的纳米药物可在特定肿瘤部位释放，提高局部药物浓度，提升抗肿瘤效果；Zhu等[13]研究团队还发现PEG-PLGA-阿霉素纳米药物可有效增强药物敏感性，减轻全身毒性，克服耐药现象，在软骨肉瘤治疗方面有巨大应用前景。由此可见，运用PEG-PLGA制备Tk纳米颗粒是提高Tk生物学功能的可行性策略。

本研究综合比较发现复乳法是构建Nano-Tk的最佳方法，逆相蒸发法虽操作简单，包封效率较高，但存在有机溶剂残留问题；单乳法则适合热敏感物质，载药量低；而复乳法具有包封率高，适用范围广的特点。Tk分子量大，蛋白三维结构复杂，选用复乳法适当增加超声时长和次数可有效提高包封率和载药量，粒径和Zeta电位满足蛋白纳米药物的要求，是构建Nano-Tk的最优方案。

值得强调的是，Nano-Tk的负向免疫调节功能显著增强，一方面与其溶解性增加，半衰期延长有关，Nano-Tk的双亲分子结构有助于跨膜进入细胞内，增加药物浓度，提高生物利用度，且结构稳定，不易被蛋白酶降解，半衰期延长，药效持久；另一方面涉及的分子机制可能是诱导CD4/8 Treg细胞的效率提高，前期研究已报道Tk可体外诱导CD4 Treg和CD8 Treg，促进Th2型细胞因子IL-4/IL-10等的分泌，用于治疗小鼠糖尿病和脑脊髓炎模型[5,17-18,23-25]。本研究也发现Nano-Tk可增强诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD8+CD103+Treg和CD8+CD122+Treg，但具体信号通路尚不明确，且该群Treg的功能仍需体内外实验进一步验证，明确其对EAE等炎症疾病模型的治疗效果，为临床应用奠定实验基础。

构建PEG-PLGA-Tk-FITC纳米递药系统可有效提高Tk水溶性，促进药物进入淋巴细胞，增强Tk负向免疫调节功能，为开发Tk临床用药剂型提供了一定参考。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突

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Preparation of trichosanthin nanoparticles with fluorescent labeling and exploration of immune regulatory function

DING Xuping* WANG Kefan* ZENG Cong LU Liming

Department of Immunology and Microbiology,Shanghai Institute of Immunology,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200025,China

[Abstract] Objective To prepare traceable fluorescent nanoparticles loaded with trichosanthin (Tk)of traditional Chinese medicine,and to improve the water solubility and bioavailability of the drug and enhance its immunomodulatory function.Methods FITC labeled Tk was used to observe the site of action of the drug.PEG-PLGA-Tk-FITC nanoparticles(Nano-Tk) were prepared by reverse evaporation method,single emulsion method,and double emulsion method with PEG-PLGA as nanocarrier.The optimal preparation method was screened by particle size,potential,encapsulation efficiency,and drug loading.The in vitro induction system of mouse spleen lymphocytes was constructed,and the function of Nano-Tk induced regulatory T cells was detected by flow cytometry.Results In this study,FITC-Tk fluorescent labeling system was successfully established with high labeling efficiency and localization in cytoplasm.Double emulsion method was screened and confirmed as the best preparation method of Nano-Tk.Compared with direct administration of Tk,Nano-Tk can significantly improve the induction efficiency of CD4+Treg and CD8+Treg in vitro (P＜0.05).Conclusion In this study,the preparation method of traceable fluorescent nanoparticle Nano-Tk is established,which not only improved the water solubility of the drug,but also enhanced its negative immunomodulatory function,and opened up new ideas for maximizing the anti-inflammatory activity of Tk and improving bioavailability.

[Key words] Trichosanthin;FITC fluorescence labeling;Fluorescent nanoparticle;Immune regulation

[中图分类号] R284.2

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）08（c）-0028-06

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.24.06

[基金项目] 上海市科学技术委员会科技计划项目（22490760400）；中央本级重大增减支项目（2060302）。

[作者简介] 丁旭苹（1990-），女，硕士；研究方向：免疫调节。王克凡（1997-），女，上海交通大学医学院2020级免疫学专业在读博士研究生；研究方向：免疫调节。

＊具有同等贡献

[通讯作者] 路丽明（1976-），女，博士，教授；研究方向：免疫调节和免疫耐受的诱导。

（收稿日期：2025-01-02）

（修回日期：2025-06-12）