附子为毛茛科植物乌头的子根加工所得，是传统中药的重要药材，历代本草记载其具“回阳救逆、补火助阳、散寒止痛”之效。现代临床中，广泛用于寒湿痹痛、心阳虚衰、水肿虚脱、阳痿宫冷等病症，疗效确切。其主要活性成分为生物碱，具有强心、抗炎、镇痛、抗抑郁及抗肿瘤等多种药理作用，对心力衰竭、关节炎、神经损伤等疾病显示良好干预潜力[1]。然而，附子的药效与毒性并存，毒性反应尤以心脏毒性最为突出。研究表明，乌头碱等双酯型生物碱通过激活钠通道引发神经兴奋、心律失常及心肌损伤，严重者可导致心源性猝死[2]。

尽管目前相关毒理研究日益增多，仍多局限于动物模型或单一成分验证，缺乏对毒性靶点和信号通路的系统解析。尤其在心脏毒性方面，尚缺乏多组学整合与网络建模等前沿策略的深入应用。本研究结合多数据库挖掘与分子模拟手段，系统解析附子“多成分-多靶点-多通路”介导心脏毒性的分子机制，弥补附子毒理研究在机制与整合层面的不足。本研究结果有望深化对附子毒性本质的理解，为其临床安全应用提供理论依据与风险干预参考。

1 资料与方法

1.1 附子毒性化合物及其相关靶点筛选

本研究通过中医药整合药理学研究平台（Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine，TCMIP）（https：//www.tcmip.cn/），以“附子（FUZI）”为关键词筛选相关化学成分。考虑部分数据库缺乏明确毒性阈值，故采用文献验证、数据库注释与靶点可预测性三重标准，提高毒性成分筛选的科学性与可靠性。具体筛选以TCMIP中涉及“有毒”或“毒性相关”成分为基础，辅以文献报道中具有心脏毒性或生物碱类特征的附子化合物[3]。经PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取筛选化合物的结构信息，采用Swiss Target Prediction平台（http：//www.swisstargetprediction.ch/）预测潜在靶点。剔除无法进行靶点预测的成分后，整合预测结果作为附子毒性化合物的潜在作用靶点，并通过UniProt（https：//www.uniprot.org/）完成基因标准化注释。

1.2 附子的心脏毒性作用靶点筛选

以“Cardiotoxicity”和“Heart injury”为关键词，分别在GeneCard（https：//www.genecards.org）、OMIM（http：//www.omim.org）和DisGeNET（https：//www.disgenet.org）数据库中检索，整合获取与心脏毒性相关的潜在靶点信息。随后将其与此前获得的附子毒性靶点取交集，筛选出附子可能作用于心脏毒性的关键靶点。

1.3 构建附子-毒性化合物-交集靶点网络图

将附子经过初步筛选所得的潜在毒性化合物、交集靶点导入至Cytoscape 3.10.0构建“附子-毒性化合物-交集靶点”网络图，同时进一步筛选附子导致心脏损伤的关键核心毒性成分。

1.4 心脏毒性关键靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）网络构建与核心靶点筛选

将交集靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org），设定物种为“Homosapiens”，交互置信度设为0.400，即平台推荐的中等置信标准，确保相互作用的可靠性与网络信息的完整性[4]。随后导出PPI网络并在Cytoscape 3.10.0中可视化，借助NetworkAnalyzer插件评估节点度值、介数中心性和接近中心性等拓扑参数，筛选潜在关键靶点。

1.5 基因本体（gene ontology，GO）注释及京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

通过Metascape平台（http：//metascape.org/）对附子毒性相关靶点进行富集分析。设定物种为Homo sapiens，为控制多重比较带来的假阳性风险，设置显著性阈值P＜0.01，并采用Benjamini-Hochberg方法进行FDR校正，以FDR＜0.05作为显著富集的最终判定标准（平台默认）[5]。分析内容涵盖GO三大类：生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular components，CC）和分子功能（molecular function，MF），以及KEGG信号通路，用于探讨靶点在附子诱发心脏毒性中的潜在生物功能及通路特征。

1.6 分子对接和分子动力学模拟

以筛选出的核心成分为配体，核心靶点为受体开展分子对接。化合物三维结构来自PubChem数据库，蛋白结构由RCSB PDB（https：//www.rcsb.org）获取。采用AutoDock模拟对接，结合PyMOL绘制三维构象与Discovery Studio生成二维对接图，直观展示配体-靶点结合关系。分子对接结合能以≤-5.0 kcal/mol作为较强亲和力的判断标准，该阈值为当前分子模拟领域普遍采用的经验值，代表配体与靶点之间存在较稳定的结合倾向[6]。

分子动力学模拟使用AMBER22软件进行，蛋白与配体分别采用AMBER ff14SB和GAFF力场[7]。复合物置于半径1.2 nm的水盒中，加离子中和后进行能量最小化，并完成等温等容系综与等温等压系综平衡，使体系稳定于300 K、1 bar。随后开展100 ns模拟，每10 ps记录一帧，共获取10 000帧轨迹。轨迹分析由CPPTRAJ完成，自由能由MMPBSA.PY计算。设定100 ns模拟时长是因其广泛用于中小分子-蛋白复合物的稳定性评估。分析指标包括：均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）衡量结构偏移；回旋半径（radius of gyration，RG）反映蛋白质原子分布的紧密程度；均方根波动（root mean square fluctuation，RMSF）反映残基柔性与波动；溶剂可及表面积（solvent-accessibility surface area，SASA）表示蛋白表面暴露于溶剂的面积[8]。这些参数用于综合评估复合物的结构稳定性与结合可靠性。

2 结果

2.1 附子毒性成分数据集

在TCMIP数据库中筛选附子化学成分，最终确定29个具有潜在毒性的化合物，见表1。预测获得262个潜在作用靶点，为后续靶点研究提供基础数据。

表1 附子的潜在有毒成分

注“-”为暂无CAS ID。

2.2 附子的心脏毒性作用靶点筛选

在GeneCards、OMIM和DisGeNET数据库中检索与心脏毒性相关的靶点，分别得到1 892、482、861个靶点，整合去重后共获得2 391个非冗余靶点。与前述262个附子毒性靶点进行交集分析，筛得113个共同靶点，作为附子毒性成分的潜在心脏毒性作用位点。

2.3 构建附子-毒性化合物-交集靶点网络图

在附子毒性成分与交集靶点的网络中（图1），以节点度值筛选核心成分。图中节点面积越大、颜色越深、连接越密，通常代表其网络重要性越高。根据度值排序，筛得核心毒性成分包括乌头碱（FZ1）、一枝蒿丙素（FZ7）、草乌甲素（FZ10）、去甲乌药碱（FZ17）、光翠雀碱（FZ18）、异飞燕草碱（FZ22）、14-O-芳酰新碱（FZ28）和黄草乌碱丙（FZ29）。

图1 附子-毒性化合物-交集靶点网络图

2.4 PPI网络及核心靶点的筛选

将筛选得到的113个交集靶点构建PPI网络（图2）。并对网络进行可视化及拓扑分析，生成包含112个节点和1 067条边的相互作用网络。以节点的度值、介数中心性和接近中心性为筛选指标，分别取其中位数作为阈值（度值≥16，介数中心性≥0.003 57，接近中心性≥0.495 53），共筛选出37个关键靶点。按度值降序排列，前7个高中心性蛋白被定义为核心靶点，包括Akt1、IL-6、SRC、EGFR、STAT3、BCL2和ESR1。

图2 附子与心脏毒性交集靶点PPI网络及关键靶点

PPI：蛋白质-蛋白质相互作用。

2.5 GO分析和KEGG富集分析

将113个交集靶点输入Metascape平台进行GO及KEGG分析。GO分析涉及1 396项BP，主要包括血液循环、循环系统过程、细胞对氮化合物的反应等；101项的CC主要是膜筏、膜微结构区、突触膜等；以及以蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性（类受体）、组蛋白激酶活性为首的214项MF。KEGG分析显示附子通过168条信号通路导致心脏毒性作用。如图3～4所示。

图3 潜在靶点GO分析

图4 潜在靶点KEGG分析

KEGG：京都基因和基因组数据库。

2.6 分子对接与分子动力学模拟

2.6.1 核心毒性成分与心脏毒性靶点的分子对接分析利用AutoDock、PyMOL及Discovery Studio软件，将乌头碱（FZ1）、一枝蒿丙素（FZ7）、草乌甲素（FZ10）、去甲乌药碱（FZ17）、光翠雀碱（FZ18）、异飞燕草碱（FZ22）、14-O-芳酰新碱（FZ28）和黄草乌碱丙（FZ29）与Akt1、IL-6、SRC、EGFR、STAT3、BCL2、ESR1这7个核心靶点进行分子对接。结合能热图（图5）显示，所有复合物结合能均低于-5 kcal/mol，提示核心毒性成分与关键靶点间可能具有良好结合活性。其中，ESR1-去甲乌药碱结合能最低，为-8.7 kcal/mol。图6展示了部分核心配体与靶点的典型结合构象。

图5 核心毒性成分与核心靶点结合能热图

图6 部分核心毒性成分与核心靶点分子对接

A：Akt1-光翠雀碱；B：BCL-2-光翠雀碱；C：EGFR-乌头碱；D：ESR1-去甲乌药碱。

2.6.2 分子动力学模拟和自由能分析 基于对蛋白复合物进行分析，其中ESR1-去甲乌药碱与EGFR-乌头碱复合物因展现出稳定氢键及强疏水互作的“高亲和-高稳定”结合特征，被选为分子动力学模拟代表。RMSD分析显示，两组复合物在5 ns后分别稳定于0.6～0.8 Å 与0.5～0.7 Å，远低于5Å 漂移阈值，未发生整体构象偏移；RG值分别维持于17.2～17.3 Å 和18.4～18.6 Å，提示蛋白三级结构稳定紧凑。结合界面残基RMSF值普遍低于1.0 Å，提示配体限制了局部涨落，符合“构象选择”机制。二者SASA值均稳定于12000～13000Å2，提示疏水核心完整且未受破坏。进一步通过MM/PBSA计算，ESR1-去甲乌药碱与EGFR-乌头碱的结合自由能分别为（-20.72±1.90）kcal/mol和（-35.76±2.94）kcal/mol，均为热力学自发结合，主要驱动力为范德华力与静电作用。见图7、表2。

图7 分子动力学模拟结果

表2 蛋白与配体复合物相互作用能（kJ/mol）

3 讨论

临床常采用先煎、久煎等方法减弱附子毒性。研究表明，煮制、去皮、切片等处理可促使二酯类生物碱水解为单酯类，显著降低其心脏毒性[9]。

本研究通过网络毒理学分析，确定附子心脏毒性核心靶点包括Akt1、IL-6、SRC、EGFR、STAT3、BCL2和ESR1。Akt1是PI3K/Akt通路关键分子，调控心肌细胞存活和代谢。研究表明，Akt1抑制会增强细胞对心脏毒性药物（如阿霉素）的敏感性，是重要致毒靶点之一[10]。IL-6结合其受体后可促进STAT3的磷酸化、二聚化及核转位，调控下游基因表达，并激活PI3K/Akt与JAK/STAT通路，诱导心肌肥大与重构[11]。SRC可通过调控PI3K/Akt与STAT3通路，参与心肌细胞的生长与凋亡[12]。同时活性SRC可抑制c-JunN端激酶和连接蛋白43的磷酸化，缓解阿霉素诱导的心肌损伤[13]。BCL-2是重要抗凋亡基因，在马兜铃酸改善心肌凋亡研究中，上调BCL-2并抑制胱天蛋白酶3活性及Bax蛋白表达，从而发挥保护作用[14]。ESR1编码雌激素受体，参与心肌间隙连接的维持与能量代谢调控。研究表明，其表达上调有助于稳定心肌结构，并通过转录调节机制支持心脏功能的正常维持[15]。

根据KEGG通路分析，附子诱导心脏毒性主要涉及PI3K-Akt、钙信号、EGFR和ErbB家族相关通路。在人参皂苷Rb1缓解乌头碱诱导的心肌损伤的研究中，PI3K/Akt激活可下调胱天蛋白酶3、Bax，增强BCL-2表达以减轻毒性损伤[16]。PI3K/Akt还调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，其异常激活与附子毒性表型密切相关[9]。钙信号通路是另一关键机制，乌头碱等可干扰Na+通道，诱导Na+/Ca2+交换失衡，诱发Ca2+过载，导致下调BCL-2，在损伤心肌的同时也会增加心律失常风险[17]。EGFR属HER家族，其激活可调控细胞增殖、生存及迁移，研究显示，小分子酪氨酸激酶抑制剂通过阻断ATP与EGFR激酶结构域结合，可激活氧化应激，诱发心脏毒性[18]。此外，ErbB2抑制会干扰BCL-x剪接形式，激活内源性凋亡，损伤心肌细胞[19]。

二萜类生物碱是附子毒性的主要成分，其在体内主要通过细胞色素P450酶系代谢，细胞色素P450 3A4酶与细胞色素P450 2D6酶可介导乌头碱等发生去甲基化、脱氢、羟基化等反应，生成多种代谢产物[20]。尽管这些产物结构上有所改变，多数仍具有一定毒性。如苯甲酰乌头原碱作为乌头碱的脱酰基代谢物，虽毒性减弱，但仍可抑制心肌，机制可能涉及钠通道失活与钙稳态紊乱[21]。

综上所述，本研究基于网络毒理学、分子对接及分子动力学模拟技术，初步揭示了附子“多成分-多靶点-多通路”诱发心脏毒性的潜在机制。结果显示，乌头碱、一枝蒿丙素、草乌甲素、去甲乌药碱、光翠雀碱、异飞燕草碱、14-O-芳酰新碱及黄草乌碱丙等核心毒性成分，可能通过Akt1、IL-6、SRC、EGFR、STAT3、BCL-2、ESR1等关键靶点，调控PI3K-Akt、钙信号、EGFR等通路，诱导炎症反应、氧化应激积累、钙稳态破坏和细胞凋亡等，相关结果为深入阐明附子心脏毒性机制提供了理论依据。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Exploring the mechanisms of Aconiti Lateralis Radix Praeparata-induced cardiotoxicity based on network toxicology,molecular docking,and molecular dynamics simulations

DING Zhiqiang1 SUN Zhiyue1 HE Xingyan1 DENG Mengting1 ZHU Xi1 CHEN Baorong1 FANG Hongcheng2 LI Zhifang2

1.Shenzhen Clinical College of Integrated Chinese and Western Medicine,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangdong Province,Shenzhen 518104,China;2.Department of Cardiovascular Diseases,Shenzhen Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Guangdong Province,Shenzhen 518104,China

[Abstract] Objective To explore the potential mechanisms by which toxic components of Aconiti Lateralis Radix Praeparata-induced cardiotoxicity through network toxicology,molecular docking,and molecular dynamics simulation,thereby providing theoretical support for its safe clinical application.Methods Toxic compounds in Aconiti Lateralis Radix Praeparata were identified via Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine,and potential targets were predicted.Cardiotoxicity-related targets from GeneCards,OMIM,and DisGeNET databases were intersected with Aconiti Lateralis Radix Praeparata targets.A proteinprotein interaction network was constructed to screen core targets,and pathway enrichment analysis was conducted in combination with gene ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.Finally,the binding stability of toxic components to key targets was verified through molecular docking and molecular dynamics simulation.Results A total of 29 toxic compounds were identified from Aconiti Lateralis Radix Praeparata,with 262 predicted toxic targets.Key toxic compounds included aconitine,bullatine C,crassicauline A,demethylcoclaurine,denudatine,isodelphinine,14-O-veratroylneoline,and vilmorrianine C.The number of targets associated with cardiotoxicity was 1 892 in GeneCards,482 in OMIM,and 861 in DisGeNET.After integrating and removing duplicates based on weighting criteria,a total of 2 391 unique targets were identified.Subsequent intersection analysis revealed 113 common targets.The proteinprotein interaction network further screened out 37 key targets closely related to cardiotoxicity,and Akt1,IL-6,SRC,EGFR,STAT3,BCL2,and ESR1 were selected as core targets.Analysis of gene ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes revealed that these targets were mainly enriched in pathways such as PI3K-Akt,calcium signaling,EGFR and ErbB.The results of molecular docking showed that core toxic components such as aconitine and demethylcoclaurine could form strong binding with core targets such as Akt1 and IL-6.Molecular dynamics simulations further verified the binding stability of the complex.Conclusion This study reveals the potential mechanism of Aconiti Lateralis Radix Praeparata-induced cardiotoxicity,involving processes such as inflammatory response,oxidative stress,calcium homeostasis disruption and apoptosis.

[Key words] Aconiti Lateralis Radix Praeparata;Cardiotoxicity;Network toxicology;Molecular docking;Molecular dynamics simulations;Pharmacological mechanisms

[中图分类号] R285.5

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）08（c）-0047-07

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.24.09

[基金项目] 广东省中医药局科研项目（20231297）；深圳市自然科学基金面上项目（JCYJ20230807141402005）；深圳市“医疗卫生三名工程”资助项目（SZZYSM202106006）。

[作者简介] 丁志强（2000-），男，广州中医药大学深圳中西医结合临床医学院2023级中医专业在读硕士研究生，主要从事中西医结合防治心血管疾病研究工作。

[通讯作者] 李志芳（1979-），女，博士，副教授，硕士生导师，主要从事中西医结合防治心血管疾病研究工作。

（收稿日期：2025-06-12）

（修回日期：2025-07-01）