慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是一个全球性问题，亚太地区则是全球HBV负担最重的地区。据调查，亚太地区有2.575亿HBV感染者[1-2]。HBV感染所致的慢性乙型肝炎被认为是发生肝硬化和肝细胞癌的重要驱动因素[3]。目前，治疗慢性HBV感染的主要药物是恩替卡韦、替诺福韦、聚乙二醇干扰素等[4-6]。尽管这些药物具有一定的治疗效果，但其具有各种副作用（如乏力、肌痛、消化道症状等），极大地限制了他们在临床实践中的应用[7]。因此，有必要寻找有效的慢性乙型肝炎治疗替代方案。

丹酚酸A（salvianolic acid A，SalA）是丹参中多酚化合物之一，现代药理学研究表明，SalA对心、肺、肝、骨、脑具有良好的保护作用[8]；但其对于慢性乙型肝炎的作用机制尚不明确，有待进一步研究。本研究拟探讨SalA在慢性乙型肝炎中的抗炎作用机制，旨在为SalA治疗慢性乙型肝炎提供理论依据和应用基础。

1 对象与方法

1.1 实验动物

6～8周龄SPF级健康成年雄性SD大鼠50只，体重160～180 g，购自上海实验动物研究中心[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2020-0008，实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2020-0026，实验动物合格证号：20250215（批次：2025-02-15）]。大鼠饲养于SPF级屏障环境中，温度（22±2）℃，湿度40%～60%，经历12 h光/暗循环适应性饲养1周，自由摄食饮水。本研究经江汉大学科技伦理委员会批准（JHDXKJLL2025--136）。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 丹酚酸A（纯度≥98%，批号：S230515，上海源叶生物科技有限公司）；恩替卡韦（批号：ETV 2203-7H9，正大天晴药业集团股份有限公司）；重组HBV颗粒（基因型C，血清型adr，货号：VR-2083U，美国典型培养物保藏中心）；BCA测定试剂盒（货号：P0012，上海碧云天生物科技有限公司）；NOX2抗体（兔抗大鼠，货号：ab129068，英国艾博抗公司）；NLRP3抗体（小鼠抗大鼠，货号：sc-66846，美国圣克鲁斯生物技术公司）；AIM2抗体（兔抗大鼠，货号：DF12223，美国亲和生物公司）；β-actin抗体（小鼠抗大鼠，货号：AA128，上海碧云天生物科技有限公司）。

1.2.2 主要仪器酶标检测仪（Eppendorf iMarkTM 微孔板读板机，德国艾本德公司）；蛋白电泳系统（Bio-Rad电泳槽，美国伯乐公司）。

1.3 实验分组及处理

本研究参照肝靶向药物生物利用度研究，基于Sun等[9]报道的SD大鼠灌胃SalA绝对生物利用度（12.3%），通过体表面积换算，选择10～20 mg/kg剂量范围覆盖人等效治疗窗（0.2～0.4 mg/kg），同时验证其量效关系。恩替卡韦0.5 mg/kg参照《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》[10]动物模型推荐剂量，相当于成人1.0 mg/d的体表面积换算剂量。

将50只大鼠按照随机数字表法分为对照组、模型组、阳性药组、低剂量组、高剂量组，每组10只。分组后，各组大鼠在HBV感染前继续适应性饲养3 d，以消除操作应激对免疫状态的影响。除对照组大鼠尾静脉注射等体积生理盐水外，其余各组大鼠均注射含重组HBV颗粒的溶液（浓度1×107 copies/ml），注射体积为15 ml/kg。造模成功后，对照组和模型组分别灌胃同等剂量的生理盐水；阳性药组灌胃恩替卡韦溶液（0.5 mg/kg，以生理盐水配制）；低、高剂量组分别灌胃10、20 mg/kg的SalA，1次/d，连续3周。

给药结束后，大鼠经腹腔注射氯胺酮（75 mg/kg）联合地西泮（5 mg/kg）诱导深度麻醉，行腹主动脉取血并实施安乐死，随后进行原位肝脏灌注。全血以2 000 r/min的速率离心10 min（离心半径为10 cm），取血清冻存；对肝脏组织进行研磨、过滤，将细胞悬液离心后用30%的Percoll处理收集，从Percoll梯度界面收集肝脏单个核细胞。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 Western blot法 将各组提取的蛋白质用8%～12% 的SDS-PAGE分离并转移到聚偏氟乙烯膜上。用5%BSA溶液封闭膜。然后，将膜切成不同的印迹，分别用特异性一抗[NOX2（1∶1 000）、NLRP3（1∶800）、AIM2（1∶1 500）、β-actin（1∶5 000）]在4 ℃下孵育过夜（12 h）；随后将膜与HRP偶联的山羊抗鼠或兔抗山羊IgG二抗（1∶5 000）室温孵育1 h；然后将其与增强化学发光底物一起孵育，曝光于胶片。使用β-actin作为内部对照，以确认加载的蛋白质量相等。实验至少重复3次。使用Image J定量印迹图。

1.4.2 酶联免疫吸附试验法 采用酶联免疫吸附试验法测定肝脏组织中白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNFα）、γ 干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）的含量，肝脏组织中的细胞因子值以细胞因子/总蛋白（pg/mg）表示。

1.4.3 组织学评估 将肝左叶石蜡切片固定于4%中性福尔马林中，在乙醇和二甲苯的连续稀释溶液中脱水，然后包埋在石蜡中并切成5 μm的切片。将石蜡切片安装在载玻片上，透明化、水化并用苏木精-伊红试剂染色。根据评分系统测量组织学评分：0分为无明显炎症迹象，肝小叶结构完整，未见炎症细胞浸润；1分为偶见少量炎症细胞（以淋巴细胞为主）浸润，局限于汇管区；2分为汇管区及肝小叶内低水平炎症细胞浸润，伴局部肝细胞水肿；3分为广泛炎症细胞浸润（淋巴细胞、中性粒细胞混合），肝细胞点状坏死，局部血管充血；4分为全层炎症细胞浸润，肝索结构破坏，广泛肝细胞坏死，汇管区纤维化。使用摄像系统在显微镜下观察并拍照。

1.5 统计学方法

采用GraphPad Prism 21统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示，比较采用t检验或单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SalA对乙型肝炎大鼠肝组织的影响

造模过程中，模型组、阳性药组及低、高剂量组均未出现动物死亡。

对照组肝小叶结构完整，肝细胞排列有序，细胞质染色均匀，未见炎症细胞浸润或病理损伤；模型组肝细胞质染色加深，局部细胞水肿，汇管区可见出血灶及大量炎症细胞（以淋巴细胞为主）浸润；低剂量组肝细胞轻度水肿，炎症细胞浸润较模型组局限，未见明显出血灶；高剂量组肝细胞形态接近正常，汇管区偶见少量炎症细胞浸润，血管充血现象减少。与对照组比较，模型组组织学评分升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、高剂量组组织学评分降低（P＜0.05）。见图1。

图1 各组大鼠肝组织病理变化

A：对照组大鼠肝组织病理变化（100×）；B：模型组大鼠肝组织病理变化（100×）；C：阳性药组大鼠肝组织病理变化（100×）；D：低剂量组大鼠肝组织病理变化（100×）；E：高剂量组大鼠肝组织病理变化（100×）；F：各组大鼠组织学评分（n=10）。与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。

2.2 SalA对大鼠炎症因子分泌的影响

与对照组比较，模型组IL-1β、IL-6、IFN-γ 及TNFα 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、高剂量组IL-1β、IL-6、IFN-γ 及TNF-α 水平降低（P＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠炎症因子表达水平（n=10）

与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。IL：白细胞介素；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IFN-γ：γ 干扰素。

2.3 SalA对NOX2/NLRP3/AIM2通路相关蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组NOX2、NLRP3和AIM2蛋白表达水平升高（P＜0.05）。与模型组比较，低、高剂量组NOX2、NLRP3、AIM2蛋白表达水平降低（P＜0.05）。见图3。

图3 各组大鼠NOX2/NLRP3/AIM2通路相关蛋白表达水平

A：蛋白印迹图；B：各组大鼠NOX2蛋白相对表达水平（n=10）；C：各组大鼠NLRP3蛋白相对表达水平（n=10）；D：各组大鼠AIM2蛋白相对表达水平（n=10）。与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。

3 讨论

慢性肝病的常见病因包括慢性HBV和丙型肝炎病毒感染、代谢功能障碍相关脂肪性肝病。丹参中最丰富的化合物是丹酚酸，包括SalA和SalB，SalA被认为是活性最高的化合物[11-13]。研究显示，SalA能有效降低糖尿病动物的血糖和血脂水平，并通过改善线粒体功能、降低氧化应激和缓解慢性炎症来改善早期动脉粥样硬化合并2型糖尿病[14]。有研究显示，SalA具有显著的保肝作用[15]。本研究结果显示，SalA可减轻HBV引起大鼠的肝脏组织损伤，缓解炎症浸润。

HBV感染可诱发肝脏的急性和慢性炎症反应。急性炎症反应负责清除病毒，而慢性炎症反应促进疾病的发病[16-17]。NLRP3炎症小体在抑制体内HBV感染中发挥着重要作用。研究表明，NLRP3炎症小体与抗病毒防御密切相关[18-20]。HBV不能激活NLRP3炎性小体，但能抑制脂多糖诱导的HBV宿存大鼠NLRP3炎性小体的激活。本研究结果显示，SalA能抑制IL-1β、IL-6、IFN-γ 和TNF-α 细胞因子的分泌，改善HBV大鼠的炎症水平，并降低NOX2/NLRP3/AIM2通路相关蛋白的表达水平。提示SalA对HBV的治疗作用与调控NOX2/NLRP3/AIM2通路可能有关。

尽管本研究揭示了SalA通过NOX2/NLRP3/AIM2通路改善HBV相关炎症机制，但仍存在一定的局限性，如当前HBV大鼠模型基于基因型C（亚洲主要流行株），但未涵盖其他基因型（A/D型）的生物学差异，后续研究应建立肝脏免疫微环境动态监测体系，实现抗炎疗效与免疫监视功能的精准平衡。

综上所述，NLRP3炎症小体在HBV感染中的具体调控十分复杂。NOX2/NLRP3/AIM2通路可能参与调节HBV大鼠炎症，而SalA可能通过NOX2/NLRP3/AIM2通路改善HBV大鼠的炎症水平和肝损伤，这对慢性乙型肝炎治疗具有重要的意义。NLRP3炎症小体在乙型肝炎中的调节及深层作用机制尚需进一步研究。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1] MAK L Y，LIU K，CHIRAPONGSATHORN S，et al.Liver diseases and hepatocellular carcinoma in the Asia-Pacific region：burden，trends，challenges and future directions [J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2024，15（1）：34-462.

[2] WORLD HEALTH ORGANIZATION.Hepatitis C rapid diagnostic tests for professional use and/or self-testing，2021 update：TSS-16[M].Geneva：WHO，2021.

[3] DING X，LEI Q，LI T，et al.Hepatitis B core antigen can regulate NLRP3 inflammasome pathway in HepG2 cells[J].J Med Virol，2019，91（8）：1528-1536.

[4] YU X，LAN P，HOU X，et al.HBV inhibits LPS-induced NLRP3 inflammasome activation and IL-1β production via suppressing the NF-κB pathway and ROS production [J].J Hepatol，2017，66（4）：693-702.

[5] JEN I A，KUO T B J，LIAW Y P.Sex-specific associations of Notch signaling with chronic HBV infection：a study from Taiwan Biobank[J].Biol Sex Differ，2024，15（1）：69.

[6] PENG J X，WANG L Z，WANG Q T，et al.Tenofovir versus entecavir on the prognosis of hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma：a reconstructed individual patient data meta-analysis[J].Front Pharmacol，2024，15：1393861.

[7] 崔振桃，成娟.基于FAERS数据库的药物相关乙型肝炎病毒再激活信号挖掘与分析[J].药物流行病学杂志,2025，34（6）：640-649.

[8] ZHAO M，MU F，LIN R，et al.Chinese Medicine-Derived Salvianolic Acid B for Disease Therapy：A Scientometric Study[J].Am J Chin Med，2024，32（10）：417-523.

[9] SUN J，SONG J，ZHANG W，et al.Some pharmacokinetic parameters of salvianolic acid A following single-dose oral administration to rats[J].Pharm Biol，2018，56（1）：399-406.

[10] 中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）[J].实用肝脏病杂志，2023，26（3）：后插1-后插22.

[11] ROBINSON A，WONG R，GISH R G.Chronic Hepatitis B VirusandHepatitisDVirus：NewDevelopments[J].Clin Liver Dis，2023，27（1）：17-25.

[12] ASKARI A，NOSRATABADI R，KHALEGHINIA M，et al.Evaluation of NLRC4，NLRP1，and NLRP3，as Components of Inflammasomes，in Chronic Hepatitis B Virus-Infected Patients[J].Viral Immunol，2016，29（9）：496-501.

[13] QIN T，RASUL A，SARFRAZ A，et al.Salvianolic acid A&B：potential cytotoxic polyphenols in battle against cancer via targeting multiple signaling pathways [J].Int J Biol Sci，2019，15（10）：2256-2264.

[14] MA Q，YANG Q，CHEN J，et al.Salvianolic Acid A Ameliorates Early-Stage Atherosclerosis Development by Inhibiting NLRP3 Inflammasome Activation in Zucker Diabetic Fatty Rats[J].Molecules，2020，25（5）：1130.

[15] LI S，WANG R，SONG F，et al.Salvianolic acid A suppresses CCl4-induced liver fibrosis through regulating the Nrf2/HO-1，NF-κB/IκBα，p38 MAPK，and JAK1/STAT3 signaling pathways[J].Drug Chem Toxicol，2023，46（2）：304-313.

[16] RUAN Z，NIU L，HAN L，et al.In silico comparative molecular docking analysis and analysis of the anti-inflammatory mechanisms of action of tanshinone from Salvia miltiorrhiza [J].Exp Ther Med，2019，18（2）：1131-1140.

[17] WATASHI K，LIANG G，IWAMOTO M，et al.Interleukin-1 and tumor necrosis factor-α trigger restriction of hepatitis B virus infection via a cytidine deaminase activation-induced cytidine deaminase（AID）[J].J Biol Chem，2013，288（44）：31715-31727.

[18] LI P，LIU Y，HE Q.Anisodamine Suppressed the Growth of Hepatocellular Carcinoma Cells，Induced Apoptosis and Regulated the Levels of Inflammatory Factors by Inhibiting NLRP3 Inflammasome Activation[J].Drug Des Devel Ther，2020，14：1609-1620.

[19] LIU L，XIE S，LI C，et al.IFI16 induces inflammation in hepatitis B virus-associated glomerulonephritis by regulating the Caspase-1/IL-1β pathway [J].Diagn Pathol，2022，17（1）：39.

[20] DUBYAK G R，MILLER B A，PEARLMAN E.Pyroptosis in neutrophils：Multimodal integration of inflammasome and regulated cell death signaling pathways [J].Immunol Rev，2023，314（1）：229-249.

Explore the research on the mechanism of salvianolic acid A on hepatocyte inflammation in chronic hepatitis B based on the NOX2/NLRP3/AIM2 pathway

SHI Mingxia WU Minmin

Department of Laboratory,Wuhan Six Hospital,Hubei Province,Wuhan 430014,China

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of salvianolic acid A (SalA) on inflammation in chronic hepatitis B.Methods Fifty SPF SD rats were divided into control group,model group,positive drug group,low-dose group,and high-dose group by random number table method,with 10 rats in each group.In addition to the control group rats being injected with the same volume of normal saline via the tail vein,the rats in the other groups were injected with 15 ml/kg of solution containing recombinant hepatitis B virus particles (concentration 1×107 copies/ml)to establish chronic hepatitis B models.After successful modeling,the control group and model group were intragastally administered the same volume of normal saline;positive drug group was intragastally administered 0.5 mg/kg Entecavir,while low-dose and high-dose groups were intragastally administered 10 mg/kg and 20 mg/kg SalA,respectively,once a day for three consecutive weeks.The expression of proteins related to the NOX2/NLRP3/AIM2 pathway was detected by Western blot method,and the expression levels of interleukin (IL)-1β,IL-6,tumor necrosis factor-α (TNF-α),and interferon-γ (IFN-γ)were detected by enzyme-linked immunosorbent assay method;hematoxylin-eosin staining was used to evaluate the pathological damage of liver tissue.Results The liver lobule structure of control group was intact without inflammatory infiltration;model group presented hepatocyte edema and hemorrhage accompanied by a large number of inflammatory cell infiltrations;while hepatocyte edema and inflammatory cell infiltration were relieved to varying degrees in both low-dose and high-dose groups.Compared with control group,the histological score of model group increased (P＜0.05);compared with model group,the histological scores of low-dose and high-dose groups decreased (P＜0.05).Compared with control group,the levels of IL-1β,IL-6,IFN-γ,and TNF-α in model group increased(P＜0.05);compared with model group,the levels of IL-1β,IL-6,IFN-γ,and TNF-α in low-dose and high-dose groups decreased (P＜0.05).Compared with control group,the protein expression levels of NOX2,NLRP3,and AIM2 in model group increased(P＜0.05);compared with model group,the protein expression levels of NOX2,NLRP3,and AIM2 in low-dose and high-dose groups decreased(P＜0.05).Conclusion SalA improves the liver inflammatory response induced by hepatitis B virus by inhibiting the NOX2/NLRP3/AIM2 pathway.This study provides experimental evidence for the adjuvant treatment of chronic hepatitis B with natural medicines.

[Key words] Salvianolic acid;NOX2/NLRP3/AIM2 pathway;Chronic hepatitis B

[中图分类号] R285.5

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）08（c）-0094-06

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.24.17

[基金项目] 武汉市第六医院（江汉大学附属医院）院级科研基金项目（K20230328013）。

（收稿日期：2025-02-20）

（修回日期：2025-06-11）