肉芽肿性乳腺炎（granulomatous mastitis，GM）是一种慢性乳腺炎症性疾病，其病理特征为乳腺组织中出现肉芽肿性慢性炎症反应[1]。传统的治疗方法包括使用激素和手术等，但往往存在疗效不佳、复发率高及副作用大等问题[2]。因此，探索新的治疗靶点和策略对于改善GM患者的预后具有重要意义。

炎症反应是GM发病机制中的核心环节。多种细胞因子和信号通路被激活，导致乳腺组织被炎症细胞浸润、损伤。JAK/STAT3信号通路在炎症反应中发挥重要作用[3]。JAK/STAT3通路的传导始于多种炎症因子如白细胞介素（interleukin，IL）-6、γ 干扰素与受体结合，诱导受体二聚化并激活与之偶联的JAK激酶。活化的JAK激酶磷酸化受体的酪氨酸残基，招募并磷酸化STAT3蛋白[4]。磷酸化的STAT3可促进IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNFα）等多种炎症因子转录和表达，但JAK/STAT3这一经典通路在GM中的作用尚需进一步明确[5]。

芦可替尼为一种选择性JAK1/2抑制剂，已获批用于类风湿性关节炎、特异性皮炎等自身免疫性炎症性疾病的治疗，其通过阻断JAK/STAT3通路抑制炎症反应的潜力在多种自身免疫性炎症性疾病中得到验证[6-7]。然而，芦可替尼是否可以通过调控JAK/STAT3通路改善GM的炎症反应，目前鲜有文献报道。因此，本研究拟通过建立GM大鼠模型，探讨芦可替尼对GM模型大鼠的作用，评估JAK/STAT3信号通路作为GM治疗靶点的潜力。

1 对象与方法

1.1 实验动物

24只SPF级5～6周龄雌性SD大鼠购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（湘）2019-0004，实验动物合格证号为ZS-202309 120038；实验动物使用许可证号为430727 211101258348。实验动物均饲养于湖南中医药大学科技创新实验动物中心SPF房，实验单位使用许可证号为SYXK（湘）2019-0009。

1.2 主要仪器与试剂

Pannoramic MIDI数字玻片扫描仪（匈牙利3DHIS TECH公司）；RM2255石蜡切片机（德国徕卡公司）；ChemiDoc MP伯乐化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）；Varioskan LUX多功能酶标仪（美国ThermoFisher Scientific公司）。

芦可替尼（货号：HY-50856，美国MedChemExpress公司）；弗氏完全佐剂（美国Sigma-Aldrich Company公司，货号：F5881）；GAPDH、STAT3抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：10494-1-AP、60199-1-Ig）；JAK、p-JAK2、p-STAT3（华安生物技术有限公司，货号：ET1607-35、ET1607-34、ET1603-40）；二抗山羊抗兔IgG（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：E-AB-1003）；特超敏ECL发光液（白鲨生物科技有限公司，货号：BL520B）；通用型组织固定液（中性）（赛维尔生物科技有限公司，货号：G1101-500MML）。

1.3 实验分组及处理

24只SPF级雌性SD大鼠适应性喂养7 d后，按照体重区组随机分组，分为正常对照组、模型组、芦可替尼组，每组8只。除正常对照组外，其余各组大鼠进行GM造模。造模方法参照文献[8]。收集湖南中医药大学第一附属医院乳腺科手术的GM患者的病灶组织，病灶组织与生理盐水以1∶1比例在组织研磨仪中低温研磨得到组织匀浆，再将组织匀浆与完全弗氏佐剂1∶1混匀，制成油包乳混悬液备用。使用动物呼吸麻醉机麻醉大鼠后，将混悬液统一注射至每只大鼠左侧第三对乳房，建立GM大鼠模型。正常对照组和模型组灌胃生理盐水、芦可替尼组灌胃芦可替尼90 mg/（kg·d）[9]；1次/d，干预14 d，最后1天禁食禁饮，次日清晨使用呼吸麻醉剂麻醉大鼠后腹主动脉取血处死。本研究经湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会批准（HN-LL-GZR-2024-029、ZYFY20231101-05），患者知情同意。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 苏木精-伊红染色检测乳腺组织病理表现 用4%多聚甲醛固定后的组织洗净，梯度乙醇脱水。包埋、切片、脱蜡，复水，苏木精染色5 min后自来水洗净。使用分色剂分化后，自来水洗净并进行返蓝处理。将切片置于乙醇中进行递增浓度脱水，伊红染色。染色完成后，脱水、透化、封片处理。随机选取视野，观察乳腺组织病理表现。

1.4.2 RT-qPCR检测乳腺组织中JAK2、STAT3 mRNA表达 提取乳腺组织总RNA，使用紫外分光光度仪测定RNA的纯度及浓度，使用无酶水配平浓度得到相应模板。使用cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA，反应体系：cDNA Synthesis Supermix 10 μl、模板RNA 2 μl、gDNA purge 1 μl、无酶水7 μl。反转录条件：50 ℃反应15 min，85 ℃反应5 s。使用qPCR试剂盒进行扩增，反应体系：正向引物2 μl、反向引物2 μl、ROXⅡ0.4 μl，qPCR Super Mix Plus 10 μl，cDNA模板2 μl，无酶水3.6 μl。扩增条件：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性20 s，60 ℃退火45 s，45个循环。以GAPDH为内参，按照2-ΔΔCt 法进行定量分析，实验所需引物由武汉市皮诺飞生物科技有限公司设计合成。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4.3 Western blot法检测乳腺组织中JAK/STAT3信号通路相关蛋白表达 剪取适量组织，加入含有蛋白酶抑制剂的裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度并使用裂解液调平浓度。随后电泳，转膜，快速封闭液封闭，按说明书稀释一抗（GAPDH：1∶25 000；STAT3：1∶500；p-STAT3：1∶1 000；JAK：1∶2 000；p-JAK2：1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，室温孵育二抗（二抗山羊抗兔IgG：1∶20 000）2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，显影。以GAPDH作为内参，采用Image J软件分析条带灰度值。

1.4.4 免疫组织化学染色法检测乳腺组织中p-STAT3蛋白阳性表达 将乳腺组织石蜡切片进行梯度脱水，采用柠檬酸抗原修复缓冲液进行高压热修复抗原，滴加3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶。BSA封闭后，依次进行一抗（p-STAT3：1∶500）、二抗（二抗山羊抗兔IgG：1∶1 000）孵育，苏木精染核30 s，乙醇分化，流水返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固，最后使用玻片扫描软件进行扫片。

1.4.5 酶联免疫吸附试验法检测血清IL-1β、IL-6、IL-10含量 将100 μl待测血清样本、各浓度的标准品加入到酶标板底部，37 ℃孵育90 min，甩净液体，加入生物素化抗体工作液100 μl，37 ℃孵育60 min，洗涤液清洗酶标板3次，加入HRP酶结合物工作液100 μl，37 ℃孵育30 min，洗板5次，加入底物溶液90 μl，37 ℃避光孵育15 min，加入终止液50 μl，使用酶标仪检测450 nm处的光密度值。

2 结果

2.1 各组乳腺组织病理表现

正常对照组乳腺组织结构排列整齐，无炎症细胞浸润，乳腺管腔无扩张；模型组乳腺小叶结构紊乱，可见明显的肉芽肿炎性病灶生成，并伴有大量炎症细胞浸润；芦可替尼组未见明显肉芽肿病理结构，炎症细胞浸润程度明显减轻。见图1。

图1 各组乳腺组织病理表现（苏木精-伊红染色）

2.2 各组乳腺组织JAK2、STAT3 mRNA相对表达量比较

与正常对照组比较，模型组JAK2、STAT3 mRNA相对表达量升高（P＜0.01）；与模型组比较，芦可替尼组JAK2、STAT3 mRNA相对表达量降低（P＜0.01）。见图2。

图2 各组乳腺组织JAK2、STAT3 mRNA相对表达量比较（n=5）

与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01。

2.3 各组乳腺组织JAK2/STAT3信号通路关键蛋白表达比较

与正常对照组比较，模型组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白比值升高（P＜0.01）；与模型组比较，芦可替尼组p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白比值降低（P＜0.01）。见图3～4。

图3 蛋白表达条带图

图4 各组乳腺组织JAK2/STAT3信号通路关键蛋白表达比较（n=5）

与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01。

2.4 各组乳腺组织p-STAT3蛋白阳性表达比较

与正常对照组比较，模型组p-STAT3蛋白阳性表达升高（P＜0.01）；与模型组比较，芦可替尼组p-STAT3蛋白阳性表达降低（P＜0.01）。见图5～6。

图5 各组乳腺组织中p-STAT3阳性表达面积（免疫组织化学染色）

图6 各组乳腺组织p-STAT3蛋白阳性表达比较（n=5）

与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01。

2.5 各组血清IL-1β、IL-6、IL-10含量比较

与正常对照组比较，模型组IL-1β、IL-6含量升高，IL-10含量降低（P＜0.01）；与模型组比较，芦可替尼组IL-1β、IL-6含量降低，IL-10含量升高（P＜0.01）。见图7。

图7 各组血清IL-1β、IL-6、IL-10含量比较（n=5）

与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01。IL：白细胞介素。

3 讨论

GM为一种自身免疫性疾病，也是一种非细菌性炎症性疾病[10]。GM病灶中存在炎症细胞浸润，因局部促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6长期释放，形成了慢性炎性微环境，这种慢性炎症反应导致乳腺导管破坏、乳房脓肿形成及疼痛反复发作[11]。因此，抑制GM过度的炎症反应是治疗GM的关键策略，也是保护乳房外形的一个重要的治疗原则[12-13]。

JAK/STAT3信号通路与免疫炎症密切相关，目前多种免疫炎症性疾病都将其作为一个重要的治疗靶点用以开发有效药物[14]。JAK/STAT3信号通路激活后诱导促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 及趋化因子等表达，这些炎症因子还可进一步激活JAK/STAT3信号通路，形成炎症正反馈环路，且在GM中可能存在JAK/STAT3信号通路的活化[15-16]。本研究结果显示，模型组乳腺小叶结构紊乱，出现境界清楚的肉芽肿病灶并伴有大量炎症细胞浸润，并且JAK2、STAT3 mRNA和JAK2、STAT3磷酸化水平升高，提示JAK/STAT3信号通路在GM中激活；芦可替尼干预后，JAK2、STAT3 mRNA和JAK2、STAT3磷酸化水平降低，提示芦可替尼抑制GM中的JAK/STAT3信号通路。同时进一步说明JAK/STAT3信号通路是治疗GM的一个重要靶点。

细胞炎症因子失衡不仅仅是GM发病的一个重要结果，也是GM发病的一个重要病因[17]。研究发现，IL-1β、IL-6等多种促炎因子参与了GM的发病[18-20]；同时，部分具有免疫调节和抗炎功能的细胞因子，如IL-10等抑炎因子在GM中降低[21]。这种促炎因子升高、抑炎因子下降的失衡状态，造成了持续的免疫激活和炎症反应，通过降低促炎因子的表达、升高抑炎因子的表达可减轻GM病灶中的炎症从而缩短GM病程[22]。本研究结果显示，模型组IL-1β、IL-6含量升高，IL-10含量降低，提示GM中存在促炎与抑炎因子的失衡；芦可替尼干预后，IL-1β、IL-6含量降低而IL-10含量升高，提示抑制JAK/STAT3信号通路可减轻GM中的炎症反应。这一发现不仅揭示了JAK/STAT3通路在GM炎症反应中的关键作用，也为今后靶向炎症通路治疗GM提供了理论依据和新的干预策略。

综上所述，本研究初步证实了GM中JAK/STAT3信号通路与炎症反应具有相关性，JAK/STAT3信号通路可作为治疗GM的一个重要靶点，而芦可替尼可通过抑制JAK/STAT3信号通路减轻GM炎症反应，为其治疗GM提供了一定的实验依据。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Explore the effect of Ruxolitinib on the inflammatory response in granulomatous mastitis model rats based on JAK/STAT3 signaling pathway

AI Ping1 LIU Lifang2
1.DepartmentofSurgery,Wuhan TraditionalChineseMedicineHospital,HubeiProvince,Wuhan 430050,China;2.Department of Breast Surgery, the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Hunan Province, Changsha 410007,China

[Abstract] Objective To explore the effect of Ruxolitinib on the inflammatory response in granulomatous mastitis (GM)model rats based on the JAK/STAT3 signaling pathway.Methods Twenty-four 5-6-week-old SPF-grade female SD rats were selected and randomly grouped according to body weight blocks into normal control group,model group,and Ruxolitinib group,with 8 rats in each group.Except for normal control group,the GM rat models were established by injecting GM tissue homogenate into the rats of the other groups.The normal control group and model group were administered normal saline by gavage,while Ruxolitinib group was administered Ruxolitinib at a dose of 90 mg/(kg·d)once a day for 14 consecutive days.Hematoxylin-eosin staining was used to detect the pathological manifestations of breast tissue,and RT-qPCR was used to detect the expressions of JAK2 and STAT3 mRNA in breast tissue.The expression of JAK/STAT3 signaling pathway-related proteins in breast tissue was detected by Western blot,the positive expression of p-STAT3 protein in breast tissue was detected by immunohistochemical staining,and the contents of serum interleukin(IL)-1β,IL-6,and IL-10 was detected by enzyme-linked immunosorbent assay.Results The breast tissue structure of normal control group was neat,and there was no infiltration of inflammatory cells.The breast structure of model group was disordered,with granulomatous inflammatory lesions generated and inflammatory cell infiltration.No obvious granulomatous pathological structure was observed in Ruxolitinib group,and the degree of inflammatory cell infiltration was significantly reduced.Compared with normal control group,the relative expression levels of JAK2 and STAT3 mRNA and the protein ratio p-JAK2/JAK2,p-STAT3/STAT3 in model group increased (P＜0.01);compared with model group,the relative expression levels of JAK2 and STAT3 mRNA and the protein ratio p-JAK2/JAK2,p-STAT3/STAT3 in Ruxolitinib group decreased(P＜0.01).Compared with normal control group,the positive expression of p-STAT3 protein in model group increased (P＜0.01);compared with model group,the positive expression of p-STAT3 protein in Ruxolitinib group decreased (P＜0.01).Compared with normal control group,the contents of IL-1β and IL-6 in model group increased,while the content of IL-10 decreased (P＜0.01);compared with model group,the contents of IL-1β and IL-6 in Ruxolitinib group decreased,while the content of IL-10 increased (P＜0.01).Conclusion Ruxolitinib can alleviate GM inflammatory response by inhibiting the JAK/STAT3 pathway.

[Key words] Granulomatous mastitis;JAK/STAT3 signaling pathway;Ruxolitinib;Inflammatory response

[中图分类号] R269

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）09（b）-0014-06

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.26.04

[基金项目] 国家自然科学基金面上项目（82474519）；武汉市中医药科研项目（WZ24B01）；湖南省教育厅科学研究项目重点项目（23A0291）。

[作者简介] 艾萍（1986-），女，硕士；研究方向：中医药防治乳腺疾病。

[通讯作者] 刘丽芳（1963-），女，博士，主任医师，博士生导师；研究方向：中医药防治乳腺疾病。

（收稿日期：2025-04-28）

（修回日期：2025-07-16）