高度近视易引发青光眼、视网膜脱离等致盲性并发症，且缺乏有效治疗手段[1-3]。中医认为近视与阴阳失调及肝肾亏虚相关，特定偏颇体质可加剧近视程度[4]。儿童青少年高度近视患者的偏颇体质以阳虚质为主，其中肾阳虚质者的近视程度更深[5-7]。肾阳虚质与下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴功能失调及相关血清激素如游离三碘甲状腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）、游离甲状腺素（free tetraiodothyronine，FT4）、睾酮（testosterone，T）和雌二醇（estradiol，E2）紊乱有关[8-9]。前期研究显示，过量糖皮质激素可抑制近视豚鼠HPA轴功能，显著降低其屈光度[10-12]。然而，近距离用眼等环境因素诱发的高度近视相比低度近视是否呈现HPA轴功能抑制特征，目前研究尚不深入。研究表明，HPA轴相关激素失衡可通过缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）和基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）参与近视巩膜重塑[13-15]。本研究构建负透镜诱导型近视豚鼠模型，探讨HPA轴相关激素失衡及HIF-1α、MMP-2表达变化对近视的影响，为儿童青少年高度近视的预警和防控提供新思路。

1 对象与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性三色豚鼠70只，约2周龄，110～130 g，睫状肌麻痹后屈光度均为3.00～6.00 D，购自济南金丰实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（鲁）2023-0008，实验动物使用许可证号：SCXK（鲁）2024-0009，实验动物合格证号：370825251100042418。豚鼠饲养于山东中医药大学附属眼科医院实验中心，饲养温度为20～24 ℃，保持12 h/12 h昼夜节律。本研究经山东中医药大学附属医院动物伦理委员会批准（AWE-2022-055）。

1.2 主要仪器与试剂

戊巴比妥钠（货号：F0749）购于山东西亚化学工业有限公司；1%复方托吡卡胺滴眼液、0.4%盐酸奥布卡因滴眼液（货号：MP2086、MP2078）购于参天制药（中国）有限公司；FT3、FT4、T、E2 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒（货号：MK8617A、MK8613A、MK0001QA、MK8605A）购于上海酶科生物科技有限公司；逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒（货号：R433、Q711）购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；β-actin抗体（货号：AC026）购于武汉爱博泰克生物科技有限公司；HIF-1α、MMP-2抗体（货号：bsm-62518R、bs-4599R）购于北京博奥森生物技术有限公司。

酶标仪（型号：DNM-9602）购于北京普朗新技术有限公司；实时荧光定量PCR仪（型号：Roche Light-Cycler 480）购于美国Roche公司。

1.3 实验分组及处理

所有豚鼠适应性饲养2 d后，选取10只为正常组，不做任何处理；其余60只右眼配戴带有-6.00 D透镜的3D打印豚鼠头套建立近视模型，共配戴6周，左眼不戴镜作为自身对照[16]。根据负透镜诱导6周后的屈光度分布，将60只近视豚鼠分为低、中、高度近视组。动物近视模型研究中虽缺乏统一国际近视分类标准，但将-6.00 D作为高度近视阈值已被广泛采纳[17-18]。因此，本研究近视豚鼠的分级为-3.00 D＜屈光度≤-0.50 D为低度近视组，-6.00 D＜屈光度≤-3.00 D为中度近视组，屈光度≤-6.00 D为高度近视组。采用随机数字表法从低、中、高度近视组中各挑选10只，与正常组豚鼠一起进行后续统计分析。

1.4 样本处理

将戊巴比妥钠粉末溶于纯水，配置成5%液体，以0.4 ml/100 g浓度确定每只豚鼠麻醉剂量。豚鼠行腹腔注射深度麻醉后，使用一次性无菌注射器在其心尖搏动最明显部位（左锁骨中线3～4肋间隙）进针采集血液1.5 ml。血液常温静置2 h后，以4 ℃，3 000 r/min离心10 min（离心半径为6 cm），收集并分装血清，储存于-80 ℃冰箱备用。取豚鼠眼球，于冰上用眼科手术器械在角膜缘后约2 mm处剪开眼球，分离视网膜和巩膜组织，放入冻存管中并用液氮速冻，-80 ℃保存备用。以上动物处理过程均符合3R原则。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 眼生物参数测量 分别测量负透镜诱导前及负透镜诱导6周后豚鼠右眼的屈光度和眼轴长度。测量屈光度前，豚鼠在暗室中使用1%复方托吡卡胺滴眼液散瞳，每次1滴，间隔5 min，3次后等待30～40 min，使用Striatech验光仪测定屈光度，重复测量3次取其平均值。测量眼轴前，在豚鼠结膜囊内滴0.4%盐酸奥布卡因滴眼液行表面麻醉，将A型超声探头垂直于角膜平面，对准瞳孔中央，得到清晰稳定的图像时记录数据，连续测量10次后取平均值。

1.5.2 ELISA法检测激素水平 负透镜诱导6周后，按照ELISA试剂盒说明书检测豚鼠血清FT3、FT4、T和E2 浓度，在450 nm波长下检测各孔吸光度，并绘制标准曲线，计算每孔实际浓度。

1.5.3 RT-qPCR法检测视网膜HIF-1α mRNA和巩膜MMP-2 mRNA表达 负透镜诱导6周后，提取视网膜及巩膜组织样本的RNA，反转录成cDNA，采用RT-qPCR检测豚鼠视网膜HIF-1α mRNA和巩膜MMP-2 mRNA表达水平。PCR反应体系：2×SYBR qPCR Master Mix 10 μl，正、反向引物各0.4 μl，稀释5倍后的cDNA模板5 μl，RNase Free H2O 4.2 μl，总反应体系为20 μl；PCR反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s；60 ℃退火；延伸30 s，循环40次。以GAPDH为内参基因，应用公式2-△△Ct 计算HIF-1α、MMP-2 mRNA相对表达水平。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表1。

表1 引物序列

注HIF-1α：缺氧诱导因子-1α；MMP-2：基质金属蛋白酶-2。

1.5.4 Western blot法检测视网膜HIF-1α 和巩膜MMP-2蛋白表达 负透镜诱导6周后，按照每20 mg组织加入2 000 μl RIPA裂解液的比例加入裂解液提取样本蛋白，离心后取上清用BCA法检测蛋白浓度。制备好蛋白样品后，依次配胶、上样、电泳、转膜、脱脂奶粉封闭1 h、TBST洗涤3次后加入β-actin抗体（1∶640 000）、HIF-1α 抗体（1∶2 000）、MMP-2抗体（1∶2 000），4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗涤3次后加入山羊抗兔二抗（1∶10 000）4 ℃摇床孵育1 h，TBST洗涤3次后滴加ECL超敏化学发光液进行曝光、显影。用Image J软件对曝光的条带进行灰度分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析，Graph-Pad Prism 10.1.2软件作图。计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；多个时间点比较采用重复测量方差分析。相关性分析采用双变量Pearson分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 负透镜诱导6周后低、中、高度近视豚鼠数量

负透镜诱导6周后，低度近视23只、中度近视25只、高度近视12只，占比分别为38.3%、41.7%和20.0%。

2.2 各组豚鼠右眼屈光度和眼轴长度比较

诱导前，各组豚鼠右眼屈光度和眼轴长度差异无统计学意义（P＞0.05）。与诱导前比较，低、中、高度近视组豚鼠诱导6周后右眼屈光度降低，眠轴增长（P＜0.05）。诱导6周后，与正常组比较，低、中、高度近视组豚鼠右眼屈光度降低，眼轴增长（P＜0.05）；与低度近视组比较，中、高度近视组豚鼠右眼屈光度降低，眼轴增长（P＜0.05）；与中度近视组比较，高度近视组豚鼠右眼屈光度降低，眼轴增长（P＜0.05）。见表2～3。

表2 各组豚鼠右眼屈光度比较（D，）

注 与正常组比较，aP＜0.05；与低度近视组比较，bP＜0.05；与中度近视组比较，cP＜0.05。

表3 各组豚鼠右眼眼轴长度比较（mm，）

注 与正常组比较，aP＜0.05；与低度近视组比较，bP＜0.05；与中度近视组比较，cP＜0.05。

2.3 各组豚鼠激素水平比较

与正常组比较，中度近视组豚鼠FT3、FT4 水平降低（P＜0.05）；高度近视组豚鼠FT3、FT4、T水平降低，E2 水平升高（P＜0.05）。与低度近视组比较，高度近视组豚鼠FT3、FT4、T水平降低，E2 水平升高（P＜0.05）。见表4。

表4 各组豚鼠激素水平比较（）

注 与正常组比较，aP＜0.05；与低度近视组比较，bP＜0.05。FT3：游离三碘甲状腺原氨酸；FT4：游离甲状腺素；T：睾酮；E2：雌二醇。

2.4 屈光度与激素水平的相关性分析

屈光度与FT3、FT4、T水平均呈正相关，与E2 水平呈负相关（P＜0.05）。见图1。

图1 屈光度与激素水平的相关性分析

FT3：游离三碘甲状腺原氨酸；FT4：游离甲状腺素；T：睾酮；E2：雌二醇。

2.5 各组豚鼠视网膜HIF-1α mRNA和巩膜MMP-2 mRNA相对表达量比较

与正常组比较，低、中、高度近视组豚鼠视网膜HIF-1α mRNA和巩膜MMP-2 mRNA相对表达量升高（P＜0.05）。与低、中度近视组比较，高度近视组豚鼠视网膜HIF-1α mRNA和巩膜MMP-2 mRNA相对表达量升高（P＜0.05）。见图2。

图2 各组豚鼠视网膜HIF-1α mRNA和巩膜MMP-2 mRNA相对表达量比较（n=10）

与正常组比较，aP＜0.05；与低度近视组比较，bP＜0.05；与中度近视组比较，cP＜0.05。HIF-1α：缺氧诱导因子-1α；MMP-2：基质金属蛋白酶-2。

2.6 各组豚鼠视网膜HIF-1α 蛋白和巩膜MMP-2蛋白相对表达量比较

与正常组比较，低、中、高度近视组豚鼠视网膜HIF-1α 蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；中、高度近视组豚鼠巩膜MMP-2蛋白相对表达量升高（P＜0.05）。与低、中度近视组比较，高度近视组豚鼠视网膜HIF-1α 蛋白和巩膜MMP-2蛋白相对表达量升高（P＜0.05）。与低度近视组比较，中度近视组豚鼠巩膜MMP-2蛋白相对表达量升高（P＜0.05）。见图3。

图3 各组豚鼠视网膜HIF-1α 和巩膜MMP-2蛋白条带及蛋白相对表达量比较（n=10）

与正常组比较，aP＜0.05；与低度近视组比较，bP＜0.05；与中度近视组比较，cP＜0.05。HIF-1α：缺氧诱导因子-1α；MMP-2：基质金属蛋白酶-2。

3 讨论

负透镜诱导近视模型模拟的是近距离用眼导致的远视性离焦环境，且由于豚鼠眼球的解剖结构和屈光系统与人类高度相似，因此豚鼠负透镜诱导模型被广泛用于近视相关病理机制的研究[19]。本研究结果显示，负透镜诱导6周后，低、中、高度近视组豚鼠的数量占比分别为38.3%、41.7%和20.0%，提示在相同诱导环境或刺激下，屈光度变化速度存在个体化差异。

本研究结果显示，与低度近视组比较，高度近视组豚鼠FT3、FT4、T水平降低，E2 水平升高，且屈光度与FT3、FT4 和T水平均呈正相关，与E2 水平呈负相关。提示HPA轴相关激素紊乱与儿童青少年长时间近距离用眼导致的高度近视发生密切相关。临床研究表明，近视患者血清E2、T等HPA轴相关激素水平较非近视者发生显著变化[20-21]。前期研究也发现，外源性增加糖皮质激素的豚鼠HPA轴功能受到明显抑制，其屈光度较普通近视豚鼠降低，且更易发展为高度近视，提示HPA轴相关激素紊乱是高度近视进展的关键环节[10-12]。因此，在儿童青少年时期开展HPA轴相关血清激素的监测，可作为早期发现及预警高度近视的重要依据；同时，在近视发生早期可考虑从改善体质和平衡激素水平的角度防控近视进展。

近年来，HIF-1α-MMP-2信号轴介导的“巩膜缺氧学说”被认为是参与近视发展的关键途径[15，22]。视网膜和巩膜中的HIF-1α 表达上调可通过视网膜-脉络膜-巩膜信号转导通路促进巩膜中MMP-2等基因的表达，加速后极部巩膜细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重塑进程，诱导近视性眼轴增长[23-24]。有研究发现，在形觉剥夺型近视幼兔视网膜及巩膜中HIF-1α 均显著上调[25]；抗缺氧药物红景天苷可下调透镜诱导型近视豚鼠视网膜和脉络膜HIF-1α 的表达，延缓近视发展[26]。前期研究也证实，通过抑制HIF-1α 信号通路，可下调纤维化相关因子表达，有效改善豚鼠脉络膜纤维化，抑制近视发展[27]。此外，FT3可通过调控成纤维细胞HIF-1α 水平影响纤维连接蛋白合成[13]；E2 的升高和T的降低亦可发挥协同作用上调MMP-2表达促进巩膜ECM降解[28-30]。本研究结果显示，高度近视组豚鼠视网膜HIF-1α mRNA和蛋白及巩膜MMP-2 mRNA和蛋白相对表达量升高，提示视网膜HIF-1α 和巩膜MMP-2表达的上调可能是HPA轴相关激素紊乱导致近视屈光度降低和眼轴延长的关键分子基础。

综上所述，血清HPA轴相关激素代谢紊乱是高度近视发生的关键因素，其机制可能是通过HIF-1α-MMP-2信号轴介导视网膜缺氧应激和巩膜ECM重塑。本研究为高度近视的早期预警和靶向治疗提供了新的思路，同时也提示内分泌-代谢调控网络在近视防治中的重要性。今后仍需进一步开展机制研究或临床验证，以进一步明确激素紊乱与近视的直接因果关系。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Study on the correlation between the degree of myopia and serum HPA axis related hormones in guinea pigs with negative lens-induced myopia

GU Rongxuan1 JIANG Ting1 JIANG Wenjun2 BI Hongsheng2
1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Shandong Province, Jinan 250014, China; 2.Affiliated Eye Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine Shandong Academy of Eye Disease Prevention and Therapy Shandong Provincial Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Therapy of Ocular Diseases,Shandong Province,Jinan 250002,China

[Abstract] Objective To investigate the correlation between the degree of myopia and serum hypothalamic-pituitaryadrenal (HPA)axis related hormone levels in guinea pigs with negative lens-induced myopia,and to explore its molecular mechanism.Methods Seventy 2-week-old SPF-grade male pigmented guinea pigs aged two weeks were selected.Ten guinea pigs were selected as normal group and no treatment was given;while the remaining 60 guinea pigs right eyes were fitted with 3D-printed guinea pig head covers with-6.00 D lenses to establish myopia models,which were worn for a total of 6 weeks.According to the diopter,they were divided into low myopia group (23 rats),moderate myopia group (25 rats),and high myopia group (12 rats),and a random number table method was used to select 10 rats from each of low,moderate,and high myopia groups for subsequent experiments.The diopter and axial length of the right eye of guinea pigs before induction and 6 weeks after negative lens induction were compared;the levels of serum free triiodothyronine(FT3),free thyroxine(FT4),testosterone (T),and estradiol (E2) were detected by enzyme-linked immunosorbent assay;the expressions of HIF-1α mRNA in the retina and MMP-2 mRNA in the sclera of guinea pigs were detected by RT-qPCR;and the protein expressions of HIF-1α in the retina and MMP-2 in the sclera of guinea pigs were detected by Western blot.Results After 6 weeks of induction,compared with the normal group,the diopter of the right eye in low,moderate,and high myopia groups of guinea pigs decreased,and the axial length of the eye increased (P＜0.05).Compared with normal group,the levels of FT3 and FT4 in guinea pigs of moderate myopia group decreased (P＜0.05);the levels of FT3,FT4,and T in guinea pigs of high myopia group decreased,while the level of E2 increased (P＜0.05).Diopter was positively correlated with the levels of FT3,FT4,and T,and negatively correlated with E2 level(P＜0.05).Compared with normal group,the relative expression levels of HIF-1α mRNA in the retina and MMP-2 mRNA in the sclera of guinea pigs in low,moderate,and high myopia groups increased(P＜0.05).Compared with normal group,the relative expression levels of HIF-1α protein in the retinas of guinea pigs in the low,moderate,and high myopia groups increased (P＜0.05);the relative expression level of MMP-2 protein in the sclera of guinea pigs in moderate and high myopia groups increased(P＜0.05).Conclusion The occurrence of high myopia is related to the disorder of serum HPA axis related hormones,and the mechanism may involve the up-regulation of HIF-1α expression in the retina and MMP-2 expression in the sclera.

[Key words] Lens-induced myopia;Hypothalamic-pituitary-adrenal axis;Hypoxia-inducible factor-1α;Matrix metalloproteinase-2;Guinea pig

[中图分类号] R778

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）09（b）-0029-07

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.26.07

[基金项目] 山东省重点研发计划项目（2021LCZX09）。

[作者简介] 谷容萱（1999.1-），女，山东中医药大学眼科与视光医学院2022级眼科学专业在读硕士研究生；研究方向：中西医眼科疾病、白内障、眼视光学。

[通讯作者] 毕宏生（1960.2-），男，博士，教授，主任医师，博士生导师；研究方向：中西医眼科疾病、白内障、眼视光学。

（收稿日期：2025-05-27）

（修回日期：2025-07-15）