口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）作为头颈部肿瘤最常见的病理类型，5年生存率仅为50%，且复发率高达40%～50%[1-2]；这与OSCC高度异质性的分子特征密切相关[3-4]。近年来，分子伴侣介导的蛋白折叠系统在肿瘤中的作用备受关注[5]。其中HSP90家族，参与蛋白质折叠和成熟、细胞周期控制等[6-7]。HSP90α（由HSP90AA1基因编码）作为可分泌型亚型，通过双重机制促进恶性进展：①稳定突变型p53等促转移因子；②激活TLR4-NF-κB通路，诱导免疫抑制微环境形成[8]。已有研究报道，HSP90α在OSCC组织中的表达升高，且与患者生存率相关[9]。本研究通过生物信息学分析与实验验证，探索HSP90AA1与OSCC发生、发展的关系，并探寻其与OSCC化疗效果的关系。

1 研究方法

1.1 生物信息学分析

1.1.1 数据获取 从TCGA数据库（http：//sangerbox.com/home.html）中获取OSCC肿瘤组织（330例）及正常组织（32例）的RNA-seq和临床数据。样本量评估显示，在0.05的显著性水平和0.8的统计功效下，针对中等效应量（r=0.5）的检测，每组至少需要32个样本[10]。样本具体特征为：男228例，女102例；年龄19～90岁；口腔部位包括颊癌22例、口底癌60例、舌体癌126例、牙槽嵴癌17例、舌根癌23例、硬腭癌7例、唇癌3例及其他部位72例。

1.1.2 HSP90AA1的表达及对预后的影响 比较OSCC肿瘤组织与正常组织的表达差异，并筛选出32个正常组织对应的肿瘤组织样本进行配对检验，进一步验证其差异性。根据HSP90AA1的表达水平，以中位数作为分组阈值，高于中位数的样本被归为高表达组，低于中位数的样本被归为低表达组，每组各165个样本。使用survival包进行比例风险假设检验并进行拟合生存回归Kaplan-Meier曲线。

1.1.3 HSP90AA1相关性共表达基因及核心网络分析运用Pearson相关性分析对变量进行两两分析，设定r＞0.6且P＜0.001为筛选条件，识别与HSP90AA1显著相关的基因[11]。分析结果经热图可视化展示，STRING v12.0数据库用于构建蛋白质蛋白质相互作用网络，置信度设定为＞0.7以确保网络的可靠性[12]。通过Cytoscape的MCODE插件识别核心子网络，并利用基因本体（gene ontology，GO）对核心网络模块进行功能注释。

1.1.4 差异基因分析及功能富集 使用DESeq2包对预处理后的表达矩阵进行差异表达分析，计算每个基因的对数倍变化（Log2FC）和P值，筛选出满足|Log2FC|＞1且P.adj＜0.05的差异基因[13]。使用R语言的ggplot2包绘制火山图，直观展示差异基因的分布情况。对筛选出的上调基因进行功能富集分析，包括GO和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。

1.2 细胞功能验证

1.2.1 细胞来源 人舌癌细胞系CAL27购自国家生物医学实验细胞资源库（1101HUM-PUMC000338）。

1.2.2 主要试剂与仪器DMEM培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：PM150210B）；HSP90AA1 siRNA（广州锐博生物科技有限公司，货号：siB112503026314-1-5）；NC_siRNA（广州锐博生物科技有限公司，货号：siN0000001）；CCK-8试剂（日本同仁化学研究所，货号：GK04）；酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司，型号：Varioskan LUX）；细胞培养箱（美国赛默飞世尔科技公司，型号：Forma 3110）；PBS溶液（武汉尚恩生物技术有限公司，货号：SNB-001）；HSP90AA1抑制剂17-AAG（美国MedChemExpress公司，货号：HY-10211）。

1.2.3 细胞培养CAL27细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、5%CO2 的细胞培养箱中培养。培养24 h后，待细胞生长至对数生长期且细胞密度达到70%～80%时，进行后续的转染等操作。

1.2.4 细胞分组和转染 按每孔1×105 个细胞的密度接种于6孔板中，设置3个复孔。细胞分为NC_siRNA组和siRNA组（转染HSP90AA1 siRNA），siRNA组包括3个不同序列，分别为HSP90AA1_siRNA1、HSP90AA1_siRNA2、HSP90AA1_siRNA3。分别在转染后24、48 h收集细胞，用于后续的实验检测。

1.2.5 RT-qPCR检测 收集转染后细胞并提取RNA。通过RT-qPCR验证HSP90AA1 mRNA表达水平，配置反应体系为20 μl的反应溶液，其中TB Green Premix Ex Taq Ⅱ10 μl、正向引物0.8 μl、反向引物0.8 μl、ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μl、DNA模板2 μl，灭菌水6 μl。反应条件为95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40个循环。引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成，HSP90AA1正向引物：5’-CTGGTGGACAACAAGATGAAGG-3’，反向引物：5’-GCTTCACCTTCTTGGCATACC-3’，目的片段大小120 bp；GAPDH正向引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’，反向引物5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，目的片段大小100 bp。

1.2.6 细胞增殖检测 转染HSP90AA1_siRNA1 24 h后的CAL27细胞，设置3个复孔，继续培养24、48、72 h，加入CCK8试剂，孵育4 h后，使用酶标仪测量OD450 值，以接种细胞初始检测值作为对照进行归一化计算。

1.2.7 克隆形成检测 将转染HSP90AA1_siRNA1 24 h后的CAL27细胞，按照500个/孔接种于6孔板中，设置3个复孔，培养7 d，使用多聚甲醛溶液固定细胞，0.1%结晶紫染色液染色。将染色后的细胞置于显微镜下观察。

1.2.8 药物单用及联用的效果评价 将CAL27细胞分为药物单用组和联合给药组，设置3个复孔，药物单用组包括17-AAG组（浓度分别为0、0.5、1.0、10.0 μmol/L）和紫杉醇（Paclitaxel，PTX）组（浓度分别为0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μmol/L），联合给药组为17-AAG+PTX组（1.0 μmol/L的17-AAG联合0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μmol/L的PTX），以0.01%二甲基亚砜作为空白对照，上述药物处理24 h后，加入CCK8试剂进行细胞活力检测，计算细胞存活率。对于药物联合应用效果的评估，采用协同指数（combination index，CI）进行计算。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（）表示，比较采用t检验；生存分析采用log-rank检验；计数资料用例数表示。CI采用Chou-Talalay方法进行计算，CI＜1表示有协同作用[14]。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HSP90AA1在OSCC中的表达情况及其对预后的影响

肿瘤组织HSP90AA1表达量高于正常组织（P＜0.05），见图1。HSP90AA1高表达患者生存率低于HSP90AA1低表达患者（P＜0.05），见图2。

图1 肿瘤组织和正常组织中HSP90AA1表达水平

A：肿瘤组织和正常组织中HSP90AA1表达差异；B：配对样本中HSP90AA1表达差异。aaP＜0.01。

图2 HSP90AA1表达对OSCC患者生存期的影响

OSCC：口腔鳞状细胞癌。

2.2 HSP90AA1相关性共表达基因及核心网络

与HSP90AA1表达呈正相关性的前3位基因是AHSA1、PAPOLA和FCF1，主要与细胞增殖、蛋白质合成与降解、细胞周期调控等生物学过程相关。见图3。

图3 HSP90AA1相关性共表达基因及核心网络

A：Pearson相关性基因热图；B：相关性基因主要调控的生物学过程。

2.3 差异基因表达及富集分析结果

共筛选出具有显著性差异基因1 726个，其中上调基因652个，下调基因1 074个。上调的差异基因主要参与神经活性配体-受体相互作用、视黄醇代谢、细胞色素P450外源性物质的代谢、类固醇激素生物合成等生物学过程和信号通路。见图4。

图4 差异基因表达及富集分析结果

A：差异分析火山图；B：GO富集分析结果；C：KEGG富集分析结果。GO：基因本体；KEGG：京都基因和基因组数据库；BP：生物学过程；CC：细胞组成；MF：分子功能。

2.4 细胞转染结果

与NC_siRNA组比较，H SP90AA1_siRNA1组、HSP90AA1_siRNA2组和HSP90AA1_siRNA3组转染后24、48 h HSP90AA1 mRNA相对表达量降低（P＜0.05），其中HSP90AA1_siRNA1抑制作用最明显，进行后续实验。见图5。

图5 细胞转染后HSP90AA1 mRNA相对表达量（n=3）

与NC_si RNA组比较，aaP＜0.01。

2.5 HSP90AA1基因敲低对细胞增殖和克隆形成能力的影响

与NC_siRNA组比较，HSP90AA1_siRNA1组培养48、72 h增殖能力降低（P＜0.05）；与NC_siRNA组比较，HSP90AA1_siRNA1组克隆形成面积降低（P＜0.05）。见图6。

图6 HSP90AA1基因敲低对CAL27细胞增殖和克隆形成能力的影响（n=3）

A：两组细胞活力比较；B：两组克隆形成面积比较。与NC_siRNA组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01。

2.6 药物单用及联用的作用效果

与0 μmol/L比较，1.0、10.0 μmol/L 17-AAG细胞活力降低（P＜0.05）；与PTX组比较，17-AAG+PTX组（0.50、1.00、2.00、4.00 μmol/L）细胞活力降低（P＜0.05）；CI为0.68时联合用药起到协同杀伤细胞的效果。见图7。

图7 药物单用及联用的作用效果（n=3）

A：不同浓度17-AAG处理对CAL27细胞增殖的影响；B：PTX单用及联用对CAL27细胞增殖的影响。与0 μmol/L比较，aP＜0.05。

3 讨论

OSCC是头颈部常见的恶性肿瘤，部分蛋白质与肿瘤进展相关，如人类表皮生长因子受体2和HSP[15-16]。HSP的主要功能是保护细胞免受环境应激引起的损伤，并在细胞分化和凋亡信号通路中发挥作用[17-19]。HSP90家族主要有4种亚型，其中HSP90α 和HSP90β存在于细胞质内，而GRP94和TRAP1属于两个辅助细胞器的同工型。与HSP90β 比较，HSP90α 可以分泌于细胞外。在细胞外环境中，HSP90α 可保护细胞免受压力触发的凋亡和促进细胞迁移，这两者在组织修复和肿瘤进展中至关重要[20]。本研究结果显示，肿瘤组织HSP90AA1表达量高于正常组织，HSP90AA1高表达患者生存率低于HSP90AA1低表达患者；与HSP90AA1表达相关性共表达基因主要与细胞增殖、蛋白质合成与降解、细胞周期调控等方向的生物学过程相关；上调的差异基因主要参与了神经活性配体-受体相互作用、视黄醇代谢及类固醇激素生物合成等生物学过程和信号通路。提示HSP90AA1可能通过调控这些生物学过程影响OSCC的进展[21-22]。有研究显示，HSP9OAA1可能参与肿瘤微环境调控[23-24]；此方向需结合多组学数据深入探讨。

本研究结果显示，敲低HSP90AA1基因后细胞增殖和克隆能力减弱。同时，本研究结果显示，17-AAG可增强PTX疗效，这一发现为克服0SCC化疗抵抗提供了直接证据，为实现从“生物标志物发现”到“治疗靶点验证”的研究提供了实验依据。

综上所述，HSP90AA1可能作为预防和治疗0SCC转移的新靶点，进一步研究将有助于制订预防和治疗的策略。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1] BADWELAN M，MUADDI H，AHMED A，et al.Oral squamous cell carcinoma and concomitant primary tumors，what do we know?A review of the literature[J].Curr Oncol，2023，30（4）：3721-3734.

[2] PAYUNGWONG T，ANGKULKRERKKRAI K，CHAIBOONCHOE A，et al.Comparison of mutation landscapes of pretreatment versus recurrent squamous cell carcinoma of the oral cavity：The possible mechanism of resistance to standard treatment[J].Cancer Rep，2024，7（3）：e2004.

[3] LI J，LI S J，SHU M Y，et al.Unravelling the heterogeneity of oral squamous cell carcinoma by integrative analysis of single-cell and bulk transcriptome data[J].Cell Mol Med，2024，28（3）：14.

[4] KIM Y J，ONG C M，LIU A Z，et al.Multi-omics analysis deciphers intercellular communication in oral squamous cell carcinoma[J].Nature，2024，8（1）：272.

[5] LIU S，CAO Y，CHEN Z，et al.HSP90 co-regulates the formation and nuclear distributionof the glycolytic output complex to promote resistance and poor prognosis in gastric cancer patients[J].J Transl Med，2025，23（1）：172.

[6] FREILICH R，ARHAR T，ABRAMS J L，et al.Protein-protein interactions in the molecular chaperone network[J].Acc Chem Res，2018，51（1）：940-949.

[7] WEI H Y，ZHANG Y Y，JIA Y L，et al.Heat shock protein 90：biological functions，diseases and therapeutic targets [J].MedComm，2024，5（2）：e470.

[8] ZUO Y，DANG R，PENG H，et al.LL37-mtDNA regulates viability，apoptosis，inflammationand autophagy in lipopolysaccharide-treatedRLE-6TNcellsbytargetingHsp90AA1[J].Open Life Sci，2024，19（1）：1075-1088.

[9] USMAN M，ILYAS A，SYED B，et al.Serum HSP90-Alpha and Oral Squamous Cell Carcinoma：A Proteomic Approach [J].Protein Pept Lett，2021，28（10）：1157-1163.

[10] MAXWELLSE，KELLEYK，RAUSCHJR.Samplesizeplanning for statistical power and accuracy in parameter estimation[J].Annu Rev Psychol，2008，59：537-563.

[11] SUNW，XIEG，JIANGX，et al.Epigeneticregulationofhumanspecific gene expression in the prefrontal cortex [J].BMC Biol，2023，21（1）：123.

[12] ZUEHLKEAD，BEEBEK，NECKERSL，et al.Regulationand function of the human HSP90AA1 gene[J].Gene，2015，570（1）：8-16.

[13] ZHU K，XU A Q，XIA W L，et al.Integrated analysis of the molecular mechanisms in idiopathic pulmonary fibrosis [J].Int J Med Sci，2021，18（15）：3412-3424.

[14] CHOU T C.Drug Combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method [J].Cancer Res，2010，70（2）：440-446.

[15] SHAH N J，AGGEN D H，ZHENG J，et al.HER2 mutation and bladder cancer（BC）：Prevalence and clinical outcomes [J].J Clin Oncol，2024，42（4）：574.

[16] HAO Q G，SUN F G，YAN C H，et al.Progress on the role and mechanism of MT1-MMP in tumor metastasis [J].Yi Chuan，2022，44（9）：745-755.

[17] TAUSIF Y M，THEKKEKKARA D，SAI T E，et al.Heat shock protein paradigms in cancer progression：future perspectives[J].3 Biotech，2024，14（4）：96.

[18] YUN C W，KIM H J，LIM J H，et al.Heat shock proteins：agents of cancer development and therapeutic targets in anti-cancer therapy[J].Cells，2019，9（1）：60.

[19] ASGHARZADEHF，MORADI-MARJANEHR，MARJANEH M M，et al.The Role of Heat Shock Protein 40 in Carcinogenesis and Biology of Colorectal Cancer [J].Curr Pharm Des，2022，28（18）：1457-1465.

[20] JAYD，LUOY，LIW，et al.ExtracellularHeatShockProtein-90（eHsp90）：Everything You Need to Know [J].Biomolecules，2022，12（7）：911.

[21] WANG Y，LI Y，ZHANG Y，et al.Determination of core pathways for oral squamous cell carcinoma via the method of attract[J].J Oral Pathol Med，2023，52（4）：345-356.

[22] LI Y，ZHANG Y，WANG Y，et al.The RBP1-CKAP4 axis activates oncogenic autophagy and promotes cancer progression in oral squamous cell carcinoma [J].J Oral Pathol Med，2024，53（5）：456-467.

[23] PECORAROA，PAGANOM，RUSSOG，et al.Ribosomebiogenesis and cancer：overview on ribosomal proteins[J].Int J Mol Sci，2021，22（11）：5496.

[24] WANG Z，FAN L，XU H，et al.HSP90AA1 is an unfavorable prognostic factor for hepatocellular carcinoma and contributes to tumorigenesis and chemotherapy resistance [J].Transl Oncol，2024，50：102148.

Oncogenic mechanism of HSP90AA1 in oral squamous cell carcinoma and its role in chemotherapy

LIU Feifei1 CHEN Yawen1 WANG Hui1 HUANG Xin2▲
1.Department of Stomatology,Beijing Friendship Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050,China;2.Oral and Maxillofacial Surgery,Beijing Stomatological Hospital,Capital Medical University,Beijing 100070,China

[Abstract] Objective To explore the biological functions of HSP90AA1 in oral squamous cell carcinoma (OSCC) and its clinical therapeutic potential.Methods Clinical data of OSCC tumor tissues and normal tissues were obtained from the TCGA database.The expression characteristics of HSP90AA1 in OSCC were analyzed.The relationship between HSP90AA1 expression and prognosis was evaluated.The co-expressed genes and core network related to HSP90AA1 were analyzed.Meanwhile,functional enrichment analysis of differentially expressed genes was conducted.CAL27 cells were divided into NC_siRNA group and siRNA group to evaluate the effects of HSP90AA1 silencing on cell proliferation and clone formation ability.CAL27 cells were divided into the drug monotherapy group and combination administration group to evaluate the effects of the drug.Results The expression levels of HSP90AA1 in tumor tissues were higher than those in normal tissues (P＜0.05).The survival rate of patients with high HSP90AA1 expression were lower than those of patients with low HSP90AA1 expression(P＜0.05).The top three genes positively correlated with the expression of HSP90AA1 were AHSA1,PAPOLA,and FCF1,which were mainly related to biological processes such as cell proliferation,protein synthesis,and degradation,and cell cycle regulation.There were 652 differentially upregulated genes,mainly involved in biological processes and signaling pathways such as neuroactive ligand-receptor interaction and retinol metabolism etc.Compared with NC_siRNA group,the proliferation ability of HSP90AA1_siRNA1 group decreased after 48 hours and 72 hours of culture(P ＜0.05);compared with NC_siRNA group,the clone formation area in the HSP90AA 1_siR NA1 group decreased(P＜0.05).Compared with paclitaxel group,the cell viability in 17-AAG+paclitaxel groups(0.50,1.00,2.00,4.00 μmol/L)decreased(P＜0.05);when the combination index was 0.68,the combination administration achieved a synergistic effect in killing cells.Conclusion HSP90AA1 promotes OSCC progression by activating oncogenic pathways.Its inhibitors significantly enhance chemosensitivity,providing theoretical basis and preclinical evidence for developing HSP90-targeted combination therapies.

[Key words] HSP90;Oral squamous cell carcinoma;Prognosis;Bioinformatics

[中图分类号] R739.8

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）09（b）-0042-07

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.26.09

[基金项目] 北京市教育委员会科技计划项目（KM2017100 25020）。

[作者简介] 刘菲菲（1988.5-），女，硕士，主要从事口腔颌面外科及综合治疗工作。

▲通讯作者

（收稿日期：2025-04-18）

（修回日期：2025-07-10）