多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一种与内分泌系统功能紊乱及生殖功能障碍相关的疾病。研究表明，中国育龄期女性PCOS患病率为8.6%，青春期女性为10.26%，且中国是PCOS年龄标准化发病率增长最快的国家之一[1]。PCOS临床上多表现为月经失调、痤疮、肥胖和不孕等症状[1]。目前，西医多采用对症治疗，通过调节月经周期、改善肥胖和促排卵等方式进行治疗[2-3]。而中医通过系统整体观进行多靶点调控，并且临床疗效显著[4-5]。

周亚平师从国医大师夏桂成教授，擅长妇科疾病的中医治疗，在40余载的行医过程中对于PCOS治疗形成了独到的见解，补肾种子方是其治疗PCOS的核心方。PCOS是一种病因复杂的代谢性疾病，与代谢物的变化密切相关，而代谢组学在PCOS中得到了广泛应用[6-7]。因此，本研究通过构建PCOS大鼠模型，验证补肾种子方对PCOS进展的抑制作用，并初步探讨其作用机制，为PCOS的诊疗提供科学依据。

1 对象与方法

1.1 实验动物

48只6周龄SPF级SD雌性大鼠，体重（180±20）g，购于江苏大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SYXK（苏）2018-0012，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2023-0081，实验动物合格证号：202262871。饲养条件：温度（22±3）℃，相对湿度45%～65%，采用12 h光照和12 h黑暗的周期适应性饲养。本研究经江苏大学实验动物管理和使用委员会批准（UJS-IACUC-2022101302）。

1.2 主要仪器与试剂

Tek ELx800全自动酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；TG16-W离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DHG台式鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；BSA124S-CW型电子天平（德国Sartorius AG集团）；离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Vanquish型超高效液相（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Orbitrap Exploris 120型高分辨质谱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；PS-60AL型超声仪（深圳市雷德邦电子有限公司）。

补肾种子方由菟丝子30 g、生地黄15 g、月季花6 g、陈皮10 g、川芎10 g、当归10 g、甘草5 g、防风10 g、泽兰叶10 g、怀牛膝10 g、炒白芍10 g、鹿角片10 g、莪术10 g、淫羊藿10 g、黄芪10 g共15味中药组成，原药材均购自江苏大学附属医院。人的处方用量为2.77g/kg，按照人的体重60kg、人鼠折算系数6.25计算，本研究中补肾种子方低剂量为人的等效剂量（17.29 ml/kg），中剂量为低剂量的2倍（34.58 ml/kg），高剂量为低剂量的4倍（69.17 ml/kg）。将生药装入一次性布袋中，每次煎煮5副，按照每副药加水500 ml计算，共加入2 500 ml清水，浸泡30 min，将浸泡好的中药装入煎药机，武火烧开后转用文火30 min，浓缩至240 ml，即为补肾种子方高剂量。

来曲唑片（批号：H19991001，江苏恒瑞医药股份有限公司）；羧甲基纤维素钠（批号：629Y023，北京索莱宝科技有限公司）；炔雌醇环丙孕酮片（商品名：达英-35，批号：J20140114，拜耳医药保健有限公司）；睾酮（testosterone，T）酶联免疫吸附试验法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（批号：JL11473，上海将来实业股份有限公司）；黄体生成素（luteinizing hormone，LH）ELISA试剂盒（批号：JL11706，上海将来实业股份有限公司）；卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）ELISA试剂盒（批号：JL13251，上海将来实业股份有限公司）；雌二醇（estradiol，E2）ELISA试剂盒（批号：JL11525，上海将来实业股份有限公司）；孕酮（progesterone，P）ELISA试剂盒（批号：JL15546，上海将来实业股份有限公司）；甲醇（批号：67-56-1，德国CNW Technologies公司）；乙腈（批号：75-05-8，德国CNW Technologies公司）；乙酸铵（批号：631-61-8，美国SIGMA-ALDRICH公司）；氨水（批号：1336-21-6，美国Fisher Chemical公司）。

1.3 实验分组及处理

大鼠适应性饲养1周后将其分为正常组（8只）、造模组（40只）。根据参考文献[8]制备PCOS大鼠模型：将1 ml/kg来曲唑溶于1%羧甲基纤维素钠中，连续灌胃21 d诱导PCOS模型，正常组给予等量1%羧甲基纤维素钠。通过观察造模后10 d大鼠动情周期的变化判断是否造模成功[正常组大鼠仍出现规律的动情周期（周期4～5 d），造模组大鼠动情周期发生紊乱]。本研究中，40只大鼠全部造模成功，将造模成功的大鼠按照随机数字表法分为模型组，阳性对照组，补肾种子方低、中、高剂量组，每组8只。补肾种子方低、中、高剂量组分别进行灌胃补肾种子方17.29、34.58、69.17 ml/kg；阳性对照组灌胃达英-35 0.2 ml/kg，正常组和模型组灌胃相应体积的生理盐水，灌胃体积为10 ml/kg，早晚（08∶00和17∶00）各1次，连续给药28 d。

1.4 观察指标及检测方法

在末次给药结束后次日，禁食不禁水。大鼠眼底静脉丛采血4 ml，3 000 r/min离心20 min（离心半径为15 cm），收集上层血清，将其分装用于生殖激素和代谢组学检测分析。生殖激素水平检测参照ELISA试剂盒说明书进行，代谢组学检测按照公司流程进行。

1.4.1 代谢组学数据采集

1.4.1.1 样品制备 取100 μl血清置于400 μl提取液的EP管中，涡旋振荡30 s；冰水浴超声10 min后，静置1 h，然后使用4 ℃离心机12 000 r/min离心15 min（离心半径为8.6 cm）；取180 μl上清液上机检测。同时，所有样本吸取等体积上清液至进样瓶作为QC样本。

1.4.1.2 上机检测 使用Vanquish超高效液相色谱仪对标本进行色谱分离，Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），A相为25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L氨水，B相为乙腈。洗脱程序：0～0.25 min，95%B，0.25～3.50 min，95%→65%B，3.50～4.00 min，65%→40%B，4.00～4.50 min，40% B，4.50～4.55 min，40%→95%B，4.55～6.00 min，95%B，样品盘温度为4 ℃，进样体积为2 μl，柱温25 ℃，流速0.5 ml/min。

质谱仪在控制软件控制下进行一级、二级质谱数据采集。鞘层气流量为50 Arb（正、负离子模式），辅助气流量为15 Arb（正、负离子模式），毛细管温度为320 ℃（正、负离子模式），全质谱分辨率是60 000（正、负离子模式），质谱/质谱分辨率为15 000（正、负离子模式），碰撞能量为10/30/60（正、负离子模式），喷雾电压是3.8 kV（正离子模式）或-3.4 kV（负离子模式）。

1.4.2 数据处理

使用ProteoWizard（V3.0）软件将原始数据转换为mzXML格式，将mzXML格式数据利用R包进行处理，将处理后的数据与二级质谱数据库进行匹配注释。研究显示，二级质谱打分值＜0.3的代谢物假阳性高，结果不准确[9]；因此，本研究打分值的阈值设定为0.3。使用SIMCA软件（V13.0）对注释数据进行多元统计及主成分分析（principal component analysis，PCA）；代谢组学测试数据中心化换算后进行正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA），然后对数据进行自适换算处理。以VIP值＞1且P＜0.05为标准筛选差异代谢物，利用MetaboAnalyst 5.0数据库（https://www.metaboanalyst.ca/）将差异代谢物进行代谢通路分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清生殖激素水平比较

与正常组比较，模型组血清FSH、T、LH水平升高，E2、P水平降低（P＜0.05）。与模型组比较，补肾种子方低、中剂量组血清FSH、T水平降低，E2、P水平升高（P＜0.05）；补肾种子方高剂量组血清FSH、T、LH水平降低，E2、P水平升高（P＜0.05）。与补肾种子方低剂量组比较，补肾种子方高剂量组血清FSH、T、LH水平降低，E2、P水平升高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组血清生殖激素水平比较（±s）

注 正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01；与补肾种子方低剂量组比较，cP＜0.05，ccP＜0.01。FSH：卵泡雌激素；E2：雌二醇；P：孕酮；T：睾酮；LH：黄体生成素。

2.2 血清代谢组学分析

本研究选择正常组、模型组、补肾种子方高剂量组进行血清代谢组学分析。

2.2.1 PCA分析

结果显示，二组样本分群，血清代谢物存在差异。见图1。

图1 PCA得分图

A：正离子模式；B：负离子模式。PCA：主成分分析。

2.2.2 OPLS-DA分析

结果显示，正常组和模型组明显分离（正离子模式：R2X=0.412，R2Y=0.997，Q2=0.909；负离子模式：R2X=0.408，R2Y=0.996，Q2=0.91），见图2；补肾种子方干预后，补肾种子方高剂量组和模型组明显分离（正离子模式：R2X=0.374，R2Y=0.988，Q2=0.736；负离子模式：R2X=0.288，R2Y=0.988，Q2=0.645），见图3。

图2 正常组和模型组OPLS-DA图

A：正离子模式；B：负离子模式。OPLS-DA：正交偏最小二乘法-判别分析。

图3 补肾种子方高剂量组和模型组OPLS-DA图

A：正离子模式；B：负离子模式。OPLS-DA：正交偏最小二乘法-判别分析。

2.2.3 差异代谢物筛选

正常组与模型组筛选出250个差异代谢物（其中124个上调，126个下调），模型组血浆代谢物与正常组存在差异；补肾种子方干预后，模型组与补肾种子方高剂量组筛选出114个差异代谢物（其中45个上调，69个下调），其中有34个代谢物向正常组回调，见表2。聚类热图显示，正常组和模型组差异代谢物明显区分，补肾种子方高剂量组接近于正常组，其可回调PCOS大鼠体内差异代谢物，见图4。

图4 差异代谢物聚类热图

表2 三组共有血清差异代谢物

2.2.4 代谢通路分析

相关性较高的通路有亚油酸代谢，初级胆汁酸生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，组氨酸代谢。见图5。

图5 差异代谢物相关代谢通路

3 讨论

PCOS是临床十分常见的生殖内分泌紊乱疾病[10]。本研究采用来曲唑建立PCOS大鼠模型并验证补肾种子方的药效和作用机制。本研究结果显示，与正常组比较，模型组血清FSH、T、LH水平升高，E2、P水平降低；补肾种子方干预后，激素水平发生了反转，推测补肾种子方通过调节PCOS大鼠的内分泌功能，改善病情。代谢组学分析发现，正常组、模型组及补肾种子方高剂量组之间共筛出34个差异代谢物，相关性较高的通路有亚油酸代谢，初级胆汁酸生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，组氨酸代谢。

亚油酸通过去饱和-延长途径生成花生四烯酸，作为类花生酸前体参与机体炎症、凝血等生理调节，其代谢平衡对维持健康至关重要[11-12]。本研究结果显示，模型组磷脂酰胆碱（16∶0/14∶0）相较于正常组升高，而补肾种子方高剂量组下降，提示补肾种子方可能通过亚油酸代谢来调节磷脂酰胆碱（16∶0/14∶0）水平对PCOS大鼠进行干预。然而补肾种子方是如何调控亚油酸表达量的变化，亚油酸又是如何通过磷脂酰胆碱（16∶0/14∶0）来抑制PCOS的进展尚未可知，下一步的研究可以从上述未知出发进行探索。此外，初级胆汁酸生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，组氨酸代谢在抑制PCOS进展过程中的作用值得进一步的探究。本研究结果显示，补肾种子方干预后3-甲基-2-氧基戊酸酯下调，提示补肾种子方可能通过缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成对3-甲基-2-氧基戊酸酯进行调节，从而对PCOS大鼠进行干预。而胆汁酸由胆固醇经过复杂的酶促反应转化而来，在调节能量平衡和糖代谢过程中发挥着关键作用[13-14]。

胆汁酸代谢与非酒精性肝病、2型糖尿病、肥胖等代谢性疾病密切相关。研究发现，PCOS患者的胆汁酸代谢发生变化，其机制可能是初级胆汁酸促进高雄激素血症，从而加重了PCOS的病程。本研究结果显示，补肾种子方可下调25-羟基胆固醇水平，其机制可能是通过初级胆汁酸生物合成途径对PCOS大鼠体内的糖代谢、能量代谢产生影响。肌肽合成的前体物质为组氨酸，肌肽甲基化可以衍生成鹅肌肽[15]。研究发现，雌性小鼠卵巢切除后，可抑制肝脏酶活性，当注射E2 后使其恢复，加快了组氨酸的分解[16]。Tian等[17]研究发现，改良桂神丸治疗PCOS的主要代谢途径是精氨酸生物合成、组氨酸代谢及精氨酸和脯氨酸代谢。本研究结果显示，模型组鹅肌肽水平升高，补肾种子方干预后，鹅肌肽向正常组回调，可能是通过调节组氨酸代谢途径而发挥作用。

综上所述，补肾种子方可调节PCOS大鼠生殖内分泌激素水平，进而改善PCOS大鼠的病情。代谢组学分析发现，补肾种子方可能调节亚油酸代谢，初级胆汁酸生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，组氨酸代谢等代谢通路。其中鹅肌肽、25-羟基胆固醇、磷脂酰胆碱（16∶0/14∶0）、3-甲基-2-氧基戊酸酯为这些代谢通路中的主要差异代谢物。补肾种子方能够治疗PCOS，且鹅肌肽、25-羟基胆固醇、磷脂酰胆碱（16∶0/14∶0）、3-甲基-2-氧基戊酸酯等氨基酸可能是补肾种子方治疗PCOS的效应分子。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Explore the mechanism of action of Bushen Zhongzi Formula in the treatment of polycystic ovary syndrome based on metabolomics

MAO Weiwei1 GUO Qi2 ZHOU Yaping3 YAO Yi3 TAO Wenhua3 ZHU Xiaoyi3 QIAN Hua3 LIU Chengdong3

1.Clinical Laboratory,Suzhou Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine,Jiangsu Province,Suzhou 215009,China;2.School of Medicine,Jiangsu University,Jiangsu Province,Zhenjiang 212013,China;3.Department of Traditional Chinese Medicine,Affiliated Hospital of Jiangsu University,Jiangsu Province,Zhenjiang 212000,China

[Abstract] Objective To explore the mechanism of action of Bushen Zhongzi Formula in the treatment of polycystic ovary syndrome(PCOS)based on metabolomics.Methods Forty-eight 6-week-old female SPF-grade SD rats were selected,after one week of adaptive rearing,they were divided into normal group (8 rats)and model group (40 rats).Rats in model group were administered Letrozole dissolved in 1% sodium carboxymethyl cellulose (CMC) via intragastric gavage at 1 ml/kg to induce PCOS model,while those in normal group received an equal volume of 1%CMC,the intragastric administration was continued for 21 consecutive days.The successfully modeled rats were divided into model group,positive control group,and Bushen Zhongzi Formula low-,medium-,and high-dose groups according to the random number table method,with 8 rats in each group.The positive control group was given Diane-35 via intragastric gavage at 0.2 ml/kg,Bushen Zhongzi Formula low-,medium-,and high-dose groups received intragastric administration of Bushen Zhongzi Formula at 17.29,34.58 ml/kg,and 69.17 ml/kg,respectively,model group and normal group were administered an equal volume of normal saline,all interventions lasted for 28 consecutive days.The levels of serum testosterone (T),luteinizing hormone (LH),follicle-stimulating hormone (FSH),estradiol (E2),and progesterone (P) in rats were detected by enzyme linked immunosorbent assay,the levels of metabolites in rat serum were detected by metabolomics technology,and metabolic pathway analysis was performed using the MetaboAnalyst 5.0 database.Results Compared with normal group,the levels of serum FSH,T,and LH in model group increased,while the levels of E2 and P decreased (P＜0.05).Compared with model group,the levels of serum FSH and T in Bushen Zhongzi Formula low-and medium-dose groups decreased,while the levels of serum E2 and P increased (P＜0.05);the levels of serum FSH,T,and LH in Bushen Zhongzi Formula high-dose group decreased,while the levels of serum E2 and P increased (P＜0.05).Metabolomic analysis revealed that 250 differential metabolites between normal group and model group,among which 124 were upregulated and 126 were downregulated;between model group and Bushen Zhongzi Formula high-dose group,114 differential metabolites were identified,with 45 being upregulated and 69 being downregulated;a total of 34 differential metabolites were common among the three groups.The pathways with a relatively high correlation include linoleic acid metabolism,primary bile acid biosynthesis,valine,leucine and isoleucine biosynthesis,and histidine metabolism.Conclusion Bushen Zhongzi Formula can regulate the levels of reproductive endocrine hormones in PCOS rats.Its mechanism of action may be related to linoleic acid metabolism,primary bile acid biosynthesis,valine,leucine and isoleucine biosynthesis,and histidine metabolism.Moreover,amino acids such as carnosine,25-hydroxycholesterol,phosphatidylcholine(16∶0/14∶0),and 3-methyl-2-oxovalerate may be the effectant molecules of Bushen Zhongzi Formula in the treatment of PCOS rats.

[Key words] Polycystic ovary syndrome;Bushen Zhongzi Formula;Reproductive hormones;Metabolomics;Letrozole

[中图分类号] R271

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）10（a）-0037-07

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.28.7

[基金项目] 江苏省中医药科技发展计划项目（MS2022149）。

[作者简介] 毛伟维（1993-），女，硕士，主要从事中医药研究工作。

[通讯作者] 刘承东（1990-），男，博士，主要从事妇科疾病临床及研究工作。

（收稿日期：2024-12-01）

（修回日期：2025-08-04）