急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）以冠状动脉急性缺血缺氧导致心肌坏死为特征，起病急、病情危重、病死率高。我国心血管病患者约3.3亿，其中AMI患者达250万，其发病率呈逐年上升趋势，每年新发病例＞100万，死亡率＞30%[1-2]。鉴于其严重性和负担日增，早期诊断、早期治疗、预后评估对改善患者结局至关重要。微RNA（microRNA，miRNA）作为高度保守的内源性单链非编码RNA，已成为血管疾病中极具潜力的生物标志物和治疗靶点[3-4]。在动脉粥样硬化、急性冠脉综合征、心力衰竭及心肌纤维化等多种心血管疾病中均观察到miRNA表达谱的显著改变[5-7]。这些miRNA通过调控血管内皮功能、细胞增殖、凋亡与自噬等过程参与心血管疾病的发生和发展[7-8]。因此，系统筛选鉴定AMI关键差异表达miRNA具有重要的临床意义。本研究拟应用转录组学结合生物信息学方法筛选AMI患者外周血关键差异表达miRNA并进行验证，为其早期诊断、早期治疗提供新的生物学标志物及靶点。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2025年1月至6月喀什地区第一人民医院心内科收治20例AMI患者作为AMI组，按性别、年龄1∶1匹配20例冠状动脉造影正常者作为对照组。AMI诊断依据《2025年ACC/AHA急性冠脉综合征管理指南》[9]，符合缺血性胸痛、特征性心电图动态演变或心肌标志物升高中任意两项。纳入标准：①符合AMI诊断标准；②18岁＜年龄＜80岁；③签署知情同意书。排除标准：①存在严重心功能不全；②近3个月有不稳定型心绞痛、脑卒中；③合并严重肝、肾功能不全；④罹患急性疾病或处于慢性疾病急性加重期；⑤近期存在创伤、感染、手术等应激状态；⑥妊娠期或哺乳期妇女或拒绝参与者。

本研究经喀什地区第一人民医院医学道德伦理委员会审核批准，伦理批件号为[2024]快审研第（19）号，研究对象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 样本收集 于患者入院时（0 h）立即采集两管肘前静脉血（每管4～6 ml）。其中第1管血样静置20 min后，以3 000 r/min离心10 min分离血清，用于检测肌钙蛋白等心肌损伤标志物；第2管全血样本采集后立即置于液氮中速冻，随后转移至-80℃超低温冰箱保存，用于后续转录组学测序分析。整个采集处理过程严格执行标准化操作规范，以保证样本质量满足后续实验分析要求。

1.2.2 文库构建和测序 采用RNA提取试剂盒（生产商：北京转基生物科技有限公司，货号：ER501-01）提取血液样本总RNA后，进行小RNA（18～40 nt）富集，连接3’和5’端测序接头，经反转录和RT-qPCR扩增构建双链cDNA文库。纯化筛选18～40 bp片段后，质检合格的文库按比例混合，使用Illumina HiSeqTM 4000平台进行双端测序，获取mRNA原始数据。

1.2.3 miRNA表达及差异分析 采用TPM对miRNA表达量进行归一化处理，TPM=（miRNA计数片段×1 000 000）/所有miRNA计数片段的总和[10]。对于生物学重复的样品，采用DESeq2进行两个组之间的差异表达分析[11]。对于无生物学重复的样品，采用edgeR TMM算法标准化处理后进行差异表达分析[12]。

1.2.4 富集分析 采用clusterProfiler软件包对差异表达基因进行系统功能注释。基于基因本体（gene ontology，GO）数据库进行功能富集分析，筛选校正P＜0.05的显著富集条目；同时采用京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）进行通路富集分析，通过超几何检验鉴定显著富集通路（校正P＜0.05）。

1.2.5 RT-qPCR检测方法 采用RNA提取试剂盒（生产商：北京转基生物科技有限公司，货号：ER501-01）提取血液总RNA，经质检合格后使用反转录试剂盒（生产商：北京转基生物科技有限公司，货号：AU341）合成cDNA；随后RT-qPCR扩增在StepOne PlusTM 系统上进行：20 μl反应体系含SYBR Green Master Mix 10 μl、10 μmol/L正反向引物各0.8 μl及cDNA模板2 μl，ddH2O 6.4 μl；程序：95 ℃预变性30 s，40个循环（95 ℃变性10 s，60 ℃退火/延伸30s）；最终通过2-ΔΔCt法对目标miRNA进行相对定量分析。各基因的引物序列见表1。实验独立重复至少3次。

表1 基因引物序列

1.2.5 评估血管内皮功能 验证冻存后人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的核心功能——小管生成能力。实验分成对照组（未转染细胞），miRNA阴性对照组（转染无关序列的模拟物）及let-7e-5p组（HUVEC转染let-7e-5p模拟物）。具体操作步骤如下：①铺胶。冰上加20 μl Matrigel/孔，37 ℃凝固1 h；②接种。消化HUVEC，调至高密度（约2.5×105/ml），每孔加1 ml细胞悬液；③转染。约70%密度时，按体系转染let-7e-5p mimic；④培养和观察。转染后37 ℃培养24 h，显微镜拍照；⑤分析。Image J定量小管数，与对照组比较计算相对血管生成能力。实验独立重复至少3次。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 9.0统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，若组间数据方差齐性，两组比较采用独立样本t检验；若方差不齐，则选用非参数Mann-Whitney U检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 筛选AMI中差异表达miRNA

转录组学分析鉴定出44个差异表达miRNA，包括26个上调miRNA和18个下调miRNA。通过火山图（图1）展示了这些差异表达miRNA的分布特征，其中上调miRNA以红色标记，下调miRNA以绿色标记。聚类热图（图2）进一步展示表达特征，具体miRNA列表见表2。

图1 差异miRNA火山图

图2 差异miRNA聚类图

AMI：急性心肌梗死。

表2 差异表达miRNA

2.2 差异表达基因的GO功能和KEGG富集分析

GO功能分析结果显示，AMI组差异miRNA显著参与蛋白质磷酸化、磷酸化、细胞内信号转导、小GTP酶介导的信号转导及离子转运等生物学过程（图3），差异有统计学意义（校正P＜0.05）。KEGG分析揭示其主要参与细胞黏附分子、钙信号通路、CAMP信号通路、Rap1信号通路及心肌细胞肾上腺素能信号传导（图4），差异有统计学意义（校正P＜0.05）。

图3 GO富集分析

GO：基因本体。

图4 KEGG富集分析

KEGG：京都基因和基因组数据库。

2.3 RT-qPCR验证差异表达miRNA

RT-qPCR验证结果显示，与对照组比较，AMI组let-7e-5p和miR-1-3p表达上调（P＜0.05），而let-7b-5p、let-7c-5p和miR-10527-5p下调（P＜0.05），与转录组学结果一致。见图5。

图5 RT-qPCR检测差异表达miRNA表达水平

AMI：急性心肌梗死。

2.4 let-7e-5p对血管内皮功能的影响

与对照组及miRNA阴性对照组比较，let-7e-5p组血管内皮小管形成能力显著下降，提示血管内皮功能受损（图6）。

图6 let-7e-5p对血管内皮功能的影响（100×）

3 讨论

AMI是心血管急危重症，具有较高的发病率与死亡率，构成重大公共卫生问题。尽管AMI诊断和治疗策略有了很大的改进，但其仍然是最致命的心脏病类型之一。研究表明，循环中miRNAs通过影响血管内皮功能、细胞凋亡等过程参与AMI发生和发展[7,13]。因此，AMI中系统筛查miRNAs可能为其早期诊断和治疗提供潜在生物标志物和新的靶点。

本研究通过转录组学测序发现AMI中存在44个差异表达miRNA（26个上调，18个下调）。其靶基因在蛋白质磷酸化、胞内信号转导、小GTP酶介导的信号转导及离子传输等过程中显著富集。KEGG分析显示，差异基因主要参与细胞黏附分子、钙信号、环腺苷酸信号、Rap1信号和心肌肾上腺素能信号通路。筛选表达量前5位的miRNA，经RT-qPCR验证与转录组学测序结果一致：AMI组let-7e-5p和miR-1-3p表达升高（P＜0.05），而let-7b-5p、let-7c-5p和miR-10527-5p表达降低（P＜0.05）。既往研究表明，let-7e-5p在心力衰竭、非ST段抬高型心肌梗死等患者中表达升高，与本研究结果一致[14-15]。同时，miR-1-3p的上调结果与Badacz等[16]关于急性冠脉综合征患者中miR-1-3p显著增高，并可作为心血管事件独立预测因子的发现相符。然而，本研究发现let-7b-5p与let-7c-5p的下调与既往冠心病研究存在差异，推测可能与本研究纳入的维吾尔族人群（占90%）遗传特性相关[17-19]。此外，本研究发现miR-10527-5p在AMI中下调，其机制有待深入探索。

本研究还发现，let-7e-5p高表达组血管内皮小管形成能力显著下降，血管内皮功能受损。作为let-7家族关键成员，let-7e-5p通过靶向抑制NF-κB通路的关键负调控因子I κBβ，促进NF-κB的核转位和活化，增强血管内皮的炎症反应[20]。最新研究也发现，let-7e-5p通过靶向TAB2抑制NF-κB信号通路保护口腔黏膜免受损伤[21]。Mompeón等[13]报道let-7e-5p抑制剂转染HUVEC会使HUVEC的管状结构数量增加20%，与本研究结果相符。总之，let-7e-5p通过各种途径导致血管内皮功能紊乱，靶向抑制let-7e-5p有望成为改善病理性血管生成障碍的新策略。

综上所述，本研究通过转录组学结合生物信息学分析鉴定出let-7e-5p、miR-1-3p、let-7b-5p、let-7c-5p和miR-10527-5p等5个关键差异表达miRNA，其可能通过调控血管内皮功能等途径参与AMI的发生和发展。研究结果为AMI发病机制、诊断标志物及治疗靶点的探索提供了实验依据，后续将深入解析其作用机制及调控网络。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Screening and verification of key differentially expressed miRNAs in peripheral blood of acute myocardial infarction patients based on transcriptomics and bioinformatics

Tilakezi Tuersun YANG Heyin WEI Haiyan Tuerxunnayi Aihaiti

Department of Cardiology,the First People’s Hospital of Kashi,Xinjiang Uygur Autonomous Region,Kashi 844000,China

[Abstract] Objective To screen and validate key differentially expressed microRNA (miRNA) in peripheral blood of patients with acute myocardial infarction (AMI) using transcriptomics combined with bioinformatics methods.Methods Twenty patients with AMI admitted to the Department of Cardiology,the First People’s Hospital of Kashi from January to June 2025 were included as the AMI group,and 20 patients with normal coronary angiography results matched by gender and age 1 ∶1 were used as control group.Peripheral blood samples of all subjects were collected for transcriptome sequencing to screen differential miRNAs,and bioinformatics was used to analyze the function of their target genes.The key miRNAs were verified by RT-qPCR.Taking let-7e-5p as an example,the effect of let-7e-5p on vascular endothelial function was evaluated in vitro.Results A total of 44 differentially expressed miRNAs were identified (26 upregulated and 18 downregulated).Gene ontology analysis showed that the target genes were significantly enriched in biological processes such as protein phosphorylation,phosphorylation,intracellular signal transduction,small GTPase-mediated signal transduction,and ion transport.Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway enrichment analysis further showed that these target genes were mainly involved in cell adhesion molecules,calcium signaling pathway,cAMP signaling pathway,Rap1 signaling pathway,and adrenergic signaling in cardiomyocytes.The top five key miRNAs by expression level were screened: let-7e-5p,miR-1-3p,let-7b-5p,let-7c-5p,and miR-10527-5p.RT-qPCR validation demonstrated that compared to the control group,let-7e-5p and miR-1-3p were elevated (P ＜0.05),while let-7b-5p,let-7c-5p,and miR-10527-5p were reduced (P＜0.05)in the AMI group,consistent with the transcriptomic results.In vitro experiments showed that high expression of let-7e-5p inhibited vascular endothelial tube formation capability.Conclusion This study identified five key differentially expressed miRNAs: let-7e-5p,miR-1-3p,let-7b-5p,let-7c-5p,and miR-10527-5p.They may participate in the pathogenesis and progression of AMI by regulating pathways such as vascular endothelial function,and hold promise as potential biomarkers for the early diagnosis of AMI,providing novel therapeutic targets.

[Key words] Acute myocardial infarction;Transcriptomics;Bioinformatics;microRNA;Vascular endothelial function

[中图分类号] R541.4

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）10（a）-0044-06

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.28.08

[基金项目] 新疆维吾尔自治区自然科学基金项目（2023D01F14）。

[作者简介] 提拉柯孜·图尔荪（1992-），女，硕士；研究方向：冠心病临床与基础研究。

[通讯作者] 吐尔逊娜依·艾海提（1987-），女，硕士，副主任医师；研究方向：冠心病临床与基础研究。

（收稿日期：2025-06-30）

（修回日期：2025-07-29）