慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）的特征是不完全可逆的气流受限，呼吸困难、咳嗽等症状是其主要表现[1]。流行病学数据显示，COPD在40岁以上群体中的患病率高达12.64%[2-3]。COPD的病理基础主要是长期炎症反应，经典的迷走神经对炎症反应的调控是通过胆碱能抗炎通路实现，该通路为迷走神经释放递质乙酰胆碱激活α7烟碱型乙酰胆碱受体，抑制炎症细胞[4-6]。下丘脑是机体内分泌调节的关键区域，也是多种神经调控网络的重要节点[7-9]。其中，Orexin神经元是下丘脑内的重要细胞群，有Orexin A和Orexin B两种亚型，Orexin A是更稳定的多功能神经肽，在神经调控中起主导作用；Orexin B在部分生理过程中只起辅助作用[10-12]。课题组前期研究发现，在COPD模型中，下丘脑Orexin神经元的合成和轴突分泌异常改变[13]。这提示Orexin可能参与了COPD的过程。针灸是中医的传统疗法，具有多靶点调节优势如改善肺通气功能、减轻气道重塑、降低急性发作频率等[14-17]；且能减轻肺部炎症[18]。然而，其抗炎是否与中枢神经系统的调控相关仍有待探讨。本研究通过免疫荧光和病毒示踪技术，验证下丘脑Orexin神经元与迷走神经背核（dorsal motor nucleus of vagus，DMV）区胆碱能神经元之间的解剖连接、电生理技术证明Orexin神经元对迷走神经功能影响。通过化学遗传学调控Orexin神经元活性，结合电针干预，明确其对COPD小鼠肺部炎症的调控作用。两部分实验共同揭示Orexin神经元在针刺COPD抗炎中的中枢机制。

1 对象与方法

1.1 实验动物

60只4周龄SPF级雄性C57BL/6健康小鼠，20～25 g，由河南斯克贝斯生物科技公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2021-0013，实验动物使用许可证号：SYXK（皖）2020-001，实验动物合格证号：410000000000006404。饲养条件为室温（22±2）℃、湿度（50±10）%，采用12 h/12 h明暗光照适应性饲养1周，自由饮食。本研究经安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准（AHUC-mouse-2023099）。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 实验仪器

PAB-S200被动吸烟动物染毒系统、Ani-Res2005动物肺功能分析系统（北京贝兰博科技公司）；SDZ-Ⅱ型华佗牌电子针疗仪（吴江市申领医疗器械有限公司）；CM1950冷冻切片机（德国Leica有限公司）；FV1000激光共聚焦显微镜（日本OLYMPUS有限公司）；RWD-202微量注射泵（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；PowerLab生物信号记录系统（澳大利亚ADInstruments有限公司）等。

1.2.2 实验试剂

小鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附试验法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（货号：RX202412M，泉州市睿信生物科技公司）；小鼠白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA试剂盒（货号：RX203063M，泉州市睿信生物科技有限公司）；化学遗传病毒PT-1573（rAAV-Orexin-CRE-WPRE-pA）（血清型2/R，货号：PT-1573，武汉枢密科技有限公司）；化学遗传病毒PT-0042 [rAAV-EF1α-DIO-hM3D（Gq）-mCherry-WPREs]（血清型2/9，货号：PT-0042，武汉枢密科技有限公司）；化学遗传病毒PT-0043[rAAV-EF1α-DIOhM4D（Gi）-mCherry-WPREs]（血清型2/9，货号：PT-0043，武汉枢密科技有限公司）；Orexin A一抗（货号：AB255294，英国Abcam公司）；Orexin B一抗（货号：AB255293，英国Abcam公司）等。

1.3 实验分组与处理

1.3.1 免疫荧光设计

取12只小鼠，利用免疫荧光技术，观察Orexin神经元细胞，观察DMV区乙酰胆碱转移酶（choline acetyltransferase，ChAT）和Orexin受体（Orexin receptors，OXR）共表达及观察特异性Orexin神经元示踪病毒向DMV区的纤维投射荧光。

1.3.1.1 Orexin神经元 取小鼠脑组织用4%多聚甲醛固定，经梯度脱水、二甲苯透明化，石蜡切片为4 μm薄片。切片脱蜡复水后置于缓冲液中水浴加热15 min，漂洗后滴加10%兔血清，封闭1 h；漂洗后滴加一抗（Anti-Orexin A 1∶500；Anti-Orexin B 1∶500），孵育后漂洗，滴加山羊抗兔二抗（1∶10 000），孵育后染核封片，显微镜观察样品。

1.3.1.2 ChAT与OXR共表达 取脑组织石蜡切片，重复上述操作，一抗为Anti-ChAT（1∶500）、Anti-Orexin Receptor 1（1∶300）、Anti-Orexin Receptor 2（1∶300），二抗为FITC标记的山羊抗兔IgG（1∶100）、Cy3标记的山羊抗兔IgG（1∶100），封片观察。

1.3.1.3 DMV区Orexin纤维顺行示踪 将携带荧光标记基因的病毒载体注射至小鼠下丘脑区域，表达4周后，在DMV区域显微镜观察荧光信号。

1.3.2 急性实验设计与分组

通过计算机随机数字表法（由SPSS 27.0的随机数模块实现）对小鼠进行分组，18只正常小鼠分为空白组、PT-0042组和PT-0043组。空白组：常规饲养，PT-0042组：下丘脑注射Orexin神经元激活病毒（100nl），PT-0043组：下丘脑注射Orexin神经元抑制病毒（100nl）。表达4周后，腹腔注射氯氮平-N-氧化物（Clozapine N-oxide，CNO）激活病毒，观察迷走传出神经的频率、幅度、面积。

1.3.3 慢性实验设计与分组

30只小鼠使用随机数字表法分为空白组、模型组、电针组、PT-0042+电针组和PT-0043+电针组，每组6只。空白组不做处理，其余各组使用香烟烟熏法构建模型，电针组在造模的基础上施以电针干预，PT-0042+电针组和PT-0043+电针组在造模的基础上分别注射PT-0042（100 nl）、PT-0043（100 nl），表达4周后，腹腔注射CNO激活病毒，电针干预2周。取材观察抗炎效应。

1.4 COPD小鼠模型构建

小鼠置于被动吸烟烟雾染毒箱中，采用黄山牌香烟（焦油量11 mg，烟碱量1.0 mg，一氧化碳量13 mg），每日早晚各烟熏1次，1 h/次，每次燃烧10支香烟，持续12周。模型评价采用国际公认的COPD小鼠模型评价方法[19]。以肺组织病理形态改变，肺功能下降和炎症因子升高，符合临床COPD患者评价指标为模型构建成功标准[20]。

1.5 电针干预

根据《实验针灸学》[21]提供的腧穴定位方法，选取小鼠双侧肺俞、足二里，肺俞向内下方斜刺2 mm，足二里垂直进针3 mm，电针仪频率设置为2 Hz/10 Hz，强度设为1 mA，1次/d，20 min/次，以引起小鼠下肢轻微震动为宜，干预14 d[22]。

1.6 化学遗传干预

用化学遗传的方法在体调控（激活/抑制）下丘脑Orexin神经元，急性实验观察其对迷走神经放电的影响，慢性实验观察对针刺抗炎效应的影响。使用带Orexin启动子病毒（PT-1573、PT-0042、PT-0043）。

1.6.1 急性实验观察迷走神经放电情况

取PT-0042/PT-0043组小鼠各6只，异氟烷麻醉后，迷走神经背核注射逆行标记病毒PT-1573，于下丘脑注射PT-0042/PT-0043，注射量均为100 nl[23]。4周后，腹腔注射CNO，激活病毒，记录迷走神经电生理数据。

1.6.2 慢性实验观察针刺抗炎效应

取PT-0042+电针组和PT-0043+电针组小鼠各6只，迷走神经背核注射PT-1573，下丘脑注射PT-0042/PT-0043，注射量均为100 nl。4周后，腹腔注射CNO，30 min后，针刺20 min，连续处理2周，取材观察抗炎等效应。

1.7 观察指标与检测方法

1.7.1 电生理记录

异氟烷（流量0.8 L/min，浓度1.5%）麻醉固定小鼠，将迷走神经剥离，远中枢端结扎，石蜡油浸润，神经勾挂于电极勾，尾部放置参考电极。LabChart软件记录迷走神经放电原始信号，采样率设置为4 kHz，高通和低通滤波器的截止频率分别设定为0.1 Hz和70 Hz，以滤除低频漂移和高频噪声，对迷走传出神经的放电频率、幅度和面积进行记录。

1.7.2 肺通气功能检测

小鼠腹腔注射2%戊巴比妥（75 mg/kg）麻醉。随后切开颈部、暴露气管并实施插管，采用Ani-Res2005小动物呼吸功能检测仪对各组小鼠进行肺功能测定。分析各组小鼠的用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、0.05秒用力呼气量（forced expiratory volume in 0.05 second，FEV0.05）、0.1秒用力呼气量（forced expiratory volume in 0.1 second，FEV0.1），以及FEV0.05/FVC、FEV0.1/FVC。

1.7.3 小鼠肺组织病理学观察

取小鼠右肺下叶并用生理盐水冲洗干净，采用4%多聚甲醛固定，酒精梯度脱水，石蜡包埋切片，厚度为4 μm。切片进行脱蜡和再水化操作，HE染色。借助光学显微镜对肺组织的病理变化进行显微观察。

1.7.4 肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中TNF-α、IL-1β 含量检测

小鼠开胸后用止血钳夹住右总支气管，注射器抽取1 ml生理盐水从气管插管处推入左肺，反复灌洗3次后抽取BALF，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上清液，TNF-α、IL-1β 含量测定严格按照试剂盒说明书操作。

1.8 统计学方法

采用SPSS 27.0统计学软件进行数据分析，使用GraphPad Prism 7.0软件作图，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；相关性分析采用Pearson相关系数。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 下丘脑区Orexin神经元的免疫荧光检测

下丘脑外侧核区域存在明显的Orexin A和Orexin B的荧光表达。见图1。

2.2 DMV区Orexin纤维顺行示踪

DMV区检测到了Orexin神经元的病毒标记纤维投射。见图2。

2.3 DMV区ChAT与OXR共表达

OXR与ChAT在DMV区呈现明显的共定位信号。见图3。

2.4 各组迷走传出神经电生理数据比较

与空白组比较，PT-0042组迷走传出神经放电频率、幅度和面积增加（P＜0.05），PT-0043组迷走传出神经放电频率、幅度和面积下降（P＜0.05）。见图4。

2.5 各组肺功能指标比较

与空白组比较，模型组FEV0.05、FEV0.1、FVC、FEV0.05/FVC、FEV0.1/FVC降低（P＜0.05）；与模型组比较，电针组FEV0.05、FEV0.1、FVC、FEV0.05/FVC、FEV0.1/FVC升高（P＜0.05）；与电针组比较，PT-0042+电针组FEV0.05、FEV0.1、FVC、FEV0.1/FVC升高（P＜0.05），PT-0043+电针 组FEV0.05、FEV0.1、FVC、FEV0.05/FVC、FEV0.1/FVC降低（P＜0.05）。见图5。

2.6 各组肺组织病理形态

空白组小鼠肺泡结构完整，肺泡壁无增厚，肺泡腔无扩大，肺组织未见炎症细胞浸润；模型组小鼠肺组织有广泛炎症细胞浸润，肺泡腔扩大，肺泡结构不完整；电针组小鼠肺组织炎症反应有较明显改善，肺泡结构较为完整；PT-0042+电针组肺泡结构完整，肺泡壁无增厚，肺泡腔无明显扩大，肺组织未见明显炎症细胞浸润；PT-0043+电针组小鼠肺泡结构不完整，肺泡壁明显增厚，肺泡腔明显扩大，肺组织见炎症细胞浸润。见图6。

2.7 各组TNF-α、IL-1β 含量比较

与空白组比较，模型组TNF-α、1L-1β 含量升高（P＜0.05）；与模型组比较，电针组TNF-α、1L-1β 含量降低（P＜0.05）；与电针组比较，PT-0042+电针组TNF-α、1L-1β 含量降低（P＜0.05），PT-0043+电针组TNF-α、1L-1β 含量升高（P ＜0.05）。见图7。

3 讨论

近年来有关“神经-免疫”交互作用的研究证据逐渐被揭示，自主神经系统在机体的免疫应答中发挥重要作用，迷走和交感神经活动均可影响炎症反应的病理进程[24-25]。COPD在中医多属“本虚”，涉及肺、脾两脏，多选择肺俞与足二里配伍进行治疗[26-27]。肺俞为背俞穴，可宣肺化痰、通调上焦气机；足二里属足阳明胃经，具有补中益气之功，二者配伍共奏培土生金之效，针对COPD肺脾两虚的核心病机。此外，有研究显示，下丘脑Orexin神经元可通过DMV-迷走传出神经通路对炎症发挥一定的调节作用[28-29]。结合课题组前期研究发现，COPD模型鼠下丘脑Orexin神经元的合成和轴突分泌异常改变，提示Orexin可能参与COPD的病理过程[13]。

本研究通过免疫荧光与电生理完成的解剖和功能性证据，进一步提示了下丘脑Orexin神经元可能通过向DMV的直接投射，并通过作用于DMV胆碱能神经元上的Orexin受体，参与调控迷走神经相关的中枢功能。这为进一步探索下丘脑Orexin在自主神经调控方面的作用提供了重要依据。本研究发现，下丘脑Orexin神经元在电针的抗炎作用中发挥关键作用，进一步证明Orexin神经元可能通过调节下游炎症信号通路DMV及迷走神经，抑制COPD模型小鼠的炎症反应。据此，猜测电针干预在实验中对小鼠的治疗作用可能是因为针刺激活下丘脑外侧区的Orexin神经元，发挥其抗炎作用。

与其他抗炎机制比较，Orexin通路的独特优势在于其靶向性与系统性。例如，胆碱能抗炎通路依赖迷走神经直接释放乙酰胆碱，而Orexin通过增强迷走神经活性放大胆碱能抗炎通路效应，形成协同作用；内源性阿片系统虽可镇痛，但会抑制呼吸功能；而Orexin通过受体增强呼吸驱动，规避了这一副作用[30-31]。此外，Orexin通过神经调节实现精准干预，相较于直接阻断NF-κB通路的抑制剂，更少干扰正常免疫防御功能。这些特点使得Orexin通路在治疗COPD中具有优势。

综上所述，本研究证实了Orexin神经元与DMV及迷走神经之间存在的解剖与功能链接关系。本研究发现，激活Orexin神经元可增强电针抗炎作用，而抑制则使疗效减弱，提示COPD的抗炎治疗或许与Orexin神经元有关，Orexin通路是介导电针治疗COPD的关键中枢机制。针刺刺激肺俞与足二里可能通过上调下丘脑Orexin神经元，促进迷走神经-胆碱能抗炎通路的活性，从而抑制肺部炎症反应。这一新发现补充了Orexin与COPD的关系，为COPD的治疗提供了潜在的新靶点。另外，Orexin神经元的亚型和其具体作用机制尚需深入探讨。未来研究可扩大样本规模，并结合多组学方法（如转录组、蛋白组）全面揭示Orexin信号在COPD中的调控网络。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Study on the anti-inflammatory effect of Orexin neurons on acupuncture in mice with chronic obstructive pulmonary disease

LI Yifan1 WANG Linfeng1 LIU Na1 ZHANG Xinfang2 ZHANG Mengting2 XIANG Shuiying1 GAO Heren1 LIU Zibing1,2

1.School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina,Anhui University of Chinese Medicine,Anhui Province,Hefei 230012,China;2.School of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Anhui University of Chinese Medicine,Anhui Province,Hefei 230012,China

[Abstract] Objective To demonstrate the anatomical basis and functional connectivity of the hypothalamic-dorsal motor nucleus of vagus(DMV)-vagal efferent pathway,and to observe the effect of regulating Orexin neurons in the hypothalamus region on the anti-inflammatory effect of acupuncture in mice with chronic obstructive pulmonary disease (COPD).Methods Twelve SPF-grade male C57BL/6J mice were selected to observe Orexin neuronal cells,the co-expression of choline acetyltransferase (ChAT) and Orexin receptor (OXR),and the fiber projection of Orexin neurons into the DMV region by immunofluorescence technique.Eighteen mice were divided into blank group,PT-0042 group (injected with Orexin neuron-activating virus),and PT-0043 group (injected with Orexin neuron-inhibiting virus) according to random number table method,with 6 mice in each group.The blank group was routinely raised,PT-0042 group and PT-0043 group regulated the activity of Orexin neurons by stereotactic injection of virus (both 100 nl)in the brain.The vagal efferent nerve discharge condition in each group of mice were compared.Thirty mice were divided into blank group,model group,electroacupuncture group,PT-0042+electroacupuncture group,and PT-0043+electroacupuncture group by random number table method,with 6 mice in each group.The blank group was not treated,the other groups were modeled using the cigarette smoking method;electroacupuncture group was given electroacupuncture intervention on the basis of modeling,PT-0042+electroacupuncture group and PT-0043+electroacupuncture group were given virus injection through stereotactic brain positioning and electroacupuncture intervention on the basis of modeling.The pulmonary ventilation function and the contents of tumor necrosis factor-α（TNF-α)and interleukin-1 β（IL-1β)in bronchoalveolar lavage fluid of each group were compared,and the pathological changes of lung tissue in each group of mice were observed.Results Fluorescence expression of Orexin A and Orexin B was detected in the hypothalamic region,and the co-expression of ChAT and OXR and the fiber projection fluorescence of Orexin neurons were detected in DMV area.Compared with blank group,the frequency,amplitude,and area of vagal efferent nerve discharge in PT-0042 group increased(P＜0.05),while those in PT-0043 group decreased (P＜0.05).Compared with blank group,forced expiratory volume in 0.05 second (FEV0.05),forced expiratory volume in 0.1 second (FEV0.1),forced vital capacity (FVC),FEV0.05/FVC,and FEV0.1/FVC in model group decreased (P＜0.05).Compared with model group,FEV0.05,FEV0.1,FVC,FEV0.05/FVC,and FEV0.1/FVC in electroacupuncture group increased(P＜0.05).Compared with electroacupuncture group,FEV0.05,FEV0.1,FVC,and FEV0.1/FVC in PT-0042+electroacupuncture group increased(P＜0.05);while FEV0.05,FEV0.1,FVC,FEV0.05/FVC,and FEV0.1/FVC in PT-0043+electroacupuncture group decreased (P＜0.05).The alveolar structure of mice in blank group was intact,and no inflammatory cell infiltration was observed in lung tissue.In model group,there was extensive infiltration of inflammatory cells in lung tissue and incomplete alveolar structure.The inflammatory response in lung tissue of mice in electroacupuncture group was significantly improved,and alveolar structure was relatively intact.The alveolar structure in PT-0042+electroacupuncture group was intact,and no obvious inflammatory cell infiltration was observed in lung tissue.The alveolar structure of mice in PT-0043+electroacupuncture group was incomplete,and inflammatory cell infiltration was observed in the lung tissue.Conclusion Hypothalamic-DMV-vagal efferent pathway demonstrates anatomical and functional connectivity.Activating Orexin neurons can enhance the anti-inf lammatory effect of electroacupuncture,while inhibiting Orexin weakens the anti-inflammatory effect.

[Key words] Chronic obstructive pulmonary disease;Orexin;Electroacupuncture;fèishù;zúsānlǐ

[中图分类号] R563.9

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）10（a）-0050-09

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.28.09

[基金项目] 安徽省自然科学基金项目（自然科学类）（2008085 MH267）；安徽省高等学校科学研究项目（自然科学类）（2022 AH040078）。

[作者简介] 李一帆（1997.4-），男，安徽中医药大学针灸推拿学院2022级针灸推拿专业在读硕士研究生，主要从事慢性阻塞性肺疾病的针刺治疗机制研究工作。

[通讯作者] 刘自兵（1974.7-），男，博士，教授，主要从事慢性阻塞性肺疾病的针刺治疗机制研究工作。

（收稿日期：2025-04-15）

（修回日期：2025-08-08）