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苗药金果榄为防己科植物青牛胆Tinospora sagittata（Oliv.）Gagnep.的干燥块根，用于治疗急性咽喉炎、扁桃体炎等[1-2]。因其显著的疗效使其需求量大幅度增加，过度采挖造成野生资源趋于匮乏，导致其混伪品较多，金果榄同属多种植物的块根与其外形相似，在部分地区作该药用[3-6]；金果榄的常见混伪品雪里开，为毛茛科植物单叶铁线莲块根；在湖南、贵州等地将金果榄作山慈姑使用[7-8]。目前金果榄相关的鉴定研究较少，仅有少数文献对青牛胆与其近缘和混伪品种进行了性状鉴定及显微鉴别，但传统鉴定方法存在主观性强、专业程度要求高等弊端，导致鉴定混乱和临床使用品种混乱[6，9]。

DNA条形码技术通过物种DNA片段实现物种快速精准识别，能规避传统鉴定缺陷，具有样品用量小、不受个体形态和发育阶段影响、操作简便、重复性高等特点[10]。陈士林团队建立的植物类药材DNA条形码鉴定体系（ITS2+psbA-trnH）[11-12]被纳入《中华人民共和国药典》[1]。其中作为主体的序列ITS2属非编码区，序列短，种间差异显著高于种内差异，引物通用性、扩增成功率和鉴定成功率高[12-15]。刘安莉等[16]利用青牛胆叶绿体全基因组构建系统发育树能够将该药与其易混品山慈菇和同属植物区分，但叶绿体全基因组长度大、测序复杂且成本高。本研究利用ITS2序列对金果榄及其混伪品进行DNA条形码技术研究，旨在实现其精准高效鉴定，并为金果榄种质资源保护和分类研究提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

以金果榄、雪里开和山慈菇的原植物新鲜叶片和中药材等9种样品为实验对象，1～9号样品均经贵州中医药大学王悦云教授鉴定。新鲜叶片样品用硅胶快速脱水干燥保存，中药材用水洗净、酒精擦拭晾干后用硅胶保存。10～42号ITS2序列来源于National Center of Biotechnology Information（NCBI）数据库，研究材料共42个个体，见表1。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取、PCR扩增、电泳检测与测序取硅胶干燥的叶片或中药材的约20 mg，加入液氮溶液用研磨仪研磨成粉末状，使用植物DNA提取试剂盒（通用型）（北京擎科生物科技股份有限公司，货号：TSP101～1AO24C01）提取总DNA。采用ITS2序列通用引物（ITS2F：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’；ITS3R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’）[1]在PCR仪上进行扩增，PCR扩增反应体系共40 μl，包含2×T8 High-Fidelity Master Mix 20 μl，正反引物各2 μl，DNA模板1 μl，ddH2O 15 μl），扩增程序为预变性98 ℃，2 min；变性98 ℃，10 s、退火55 ℃，10 s、延伸72 ℃，20s，共37个循环；延伸72 ℃，5 min。结束后4 ℃保存。将2 μl扩增好的PCR产物加上6 μl溴酚蓝试剂，以DL 2 000 bp DNA marker作为分子量标记，用1%的琼脂糖凝胶在300 V的电压下反应12 min电泳检测，通过观察电泳胶图确定扩增条件是否单一，是否弥散，有无非特异性条带。将PCR扩增产物委托擎科生物科技股份有限公司双向测序得到峰图。

1.2.2 序列处理与数据分析采用PCR扩增效率和测定成功率评价序列扩增情况。测序后所得的峰图文件利用CodonCode Aligner V 4.0.4（CodonCode Co.，USA）校对拼接，去除低质量序列及引物区；采用Clustal X 2.1对ITS2序列进行多重比对，参数取默认值，将比对结果导入GeneDoc中生成多重序列比对图；所有序列通过MEGA 11计算GC含量及基于Kimura 2-Parameter（K2-P）模型计算遗传距离，比较序列在种间、种内变异的大小，并绘制Barcoding gap[17]；最后采用邻近法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，Bootstrap设置为1 000次[18]。

2 结果

2.1 样品ITS2序列特征

由PCR产物电泳检测结果（图1）可知，9份实验样品ITS2序列PCR产物扩增条带单一，并无弥散现象，也无特异性条带。9份实验样品均扩增成功并测序获得9条ITS2序列，其PCR扩增与测序成功率均为100%。1～5号金果榄原植物和药材的样品长度为433～441 bp，GC含量为28%～29%；6～8号雪里开原植物和药材的样品长度为457～462 bp，GC含量为60%；9号独蒜兰的样品长度为493 bp，GC含量为58%。

2.2 ITS2序列的多重比对

通过对青牛胆序列与其他科属植物序列进行比对后可以看出（图2），青牛胆种内序列较为稳定，变异非常小。青牛胆与同属其他植物序列之间存在部分的插入、缺失、转换和颠换现象。如青牛胆ITS2序列的112、116、123、124、175、196、246、249、251、265位分别为A、C、T、C、A、G、G、G、T、G，而青牛胆属其他植物在该位点的碱基分别为G或T、T或G、C或G、T或A、G或T、A或C、A或T、A或C、A或缺失、A或C，发生了转换、颠换或缺失现象。

2.3 遗传距离分析

利用MEGA 11软件计算青牛胆与其混伪品各种之间和青牛胆种内个体间的K2-P值，结果见表2。青牛胆种内个体间ITS2序列的最大种内距离为0.040 0，种内平均距离为0.013 8，青牛胆与其混伪品的种间最小种间距离为0.282 6，种间平均距离为0.316 2。

2.4 Barcoding gap

通过绘制Barcoding gap结果见图3，ITS2条形码序列的种间、种内遗传距离无重叠，具有明显的Barcoding gap存在，种内距离集中在0～0.040，种间遗传距离集中在＞0.29的范围内，分布趋势明显，有利于青牛胆与其易混品种的物种鉴定。

2.5 系统发育分析

基于ITS2序列用MEGA 11构建青牛胆及其混伪品NJ系统发育树（图4）表明，青牛胆序列均能与其他种的序列分开聚为一大支，青牛胆属植物心叶青牛胆、中华青牛胆与其他种分开单独聚为1支，防己科植物木防己和蝙蝠葛单独分支，与不同科的山慈菇和雪里开分开，山慈菇的3个原植物独蒜兰、云南独蒜兰和杜鹃兰聚为1支与雪里开原植物单叶铁线莲分开，除独蒜兰、云南独蒜兰和心叶青牛胆外，其他各种均能单独聚为1支。

3 讨论

金果榄因其突出的药用价值，随着其市场需求越来越多，从而出现越来越多的混伪品和与其形态相似但功能完全不同的近缘品种[19]。故本研究对金果榄的原植物青牛胆与同属植物及混伪品的ITS2序列进行对比分析，评价该序列对样品DNA条形码鉴定能力。理想的DNA条形码的序列要足够短，且易于获得；既要有明显的种间变异可以区分不同物种，其种内的变异又要小[20]。本研究中实验样品的ITS2序列扩增率与测序率均为100%，提示该序列通用引物适合青牛胆及其易混品种，序列易于获得。序列多重对比结果表明，青牛胆种内序列之间变异较小，青牛胆与同属其他植物序列之间存在部分的插入、缺失、转换和颠换现象。遗传距离分析结果表明，青牛胆最大种内距离（0.040 0）远小于青牛胆与其混伪品的种间最小种间距离（0.282 6）。由构建的Barcoding gap可知，种间、种内遗传距离没有重叠，具有明显的Barcoding gap，提示青牛胆具备较好的种内稳定性，与其近缘种和混伪品间存在明显的种间差异性。因此，ITS2序列具备作为青牛胆及其易混品种鉴定的理想DNA条形码所需的条件。

系统发育树通过拓扑结构反映物种间的进化关系，单独聚为一支（单系性）是物种鉴定的重要依据之一[21]。基于ITS2序列的NJ树结果表明，所有青牛胆序列以均能与其他种的序列分开聚为一大支，既能准确将不同科属的各个体分开，也可以明显地将青牛胆及其近缘种和混伪品鉴别区分。其中青牛胆与中华青牛胆、心叶青牛胆这两个种明显分枝，提示属下青牛胆与另外两个种的亲缘关系较远。中华青牛胆属于落叶藤本，有气根，枝肉质，十字形开裂，而青牛胆为常绿藤本，茎、枝均非肉质，无气根，皮孔纵2裂，两者植物形态差异明显[22]。心叶青牛胆叶片与中华青牛胆的叶片性状相似，阔卵状近圆形、纸质的叶片而异同于青牛胆的披针状箭形、纸质至薄革质叶片[23]。其植物性状差异与NJ树结果一致，表明了ITS2序列中存在能够区分青牛胆与其同属植物的遗传信息，适合作为该属植物鉴定的序列。NJ树中NCBI下载的心叶青牛胆序列（MK216496.1）与不同科的山慈菇和雪里开聚为一大支，分析序列多重对比图发现，该条序列与青牛胆属的其他种的差异均较大，已经超出了其属间和种内差异的范围，不排除其上传序列样品种名有误。

综上所述，ITS2序列可以作为鉴别青牛胆及其近缘种和混伪品的有效手段，本研究为它们的鉴别提供了分子水平依据，为金果榄种质资源保护、评价及分类研究提供了数据支撑。然而，由于DNA条形码技术利用的序列较短，包含的遗传信息有限，物种特异性可能不足的缺陷页不容忽视，故未来还需扩大研究样本量来实现金果榄的高效、准确的鉴定。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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【作者机构】	贵州中医药大学第一附属医院
【分类号】	R282.5
【基金】	贵州省科技计划项目（黔科合基础-ZK[2022]一般474）贵州省“十四五”中医药、民族医药重点学科建设规划书[QZYYZDXK（JS）-2021-03]。

基于ITS2序列的苗药金果榄及其混伪品分子鉴定

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