下咽癌是头颈部恶性肿瘤的重要组成部分，虽然其发病率相对较低，但致死率高[1]。而且，由于下咽癌发病部位隐匿，早期症状不典型，多数患者确诊时已处于中晚期，5年生存率仅25%～40%[2]。顺铂是治疗下咽癌的一线化疗药物，但其耐药性严重影响治疗效果，导致患者预后不良[3]。顺铂耐药的形成，与肿瘤细胞生物学行为及炎症微环境、免疫应答状态的改变密切相关[4]。细胞焦亡作为程序性炎症性坏死，与凋亡不同，以细胞肿胀、膜完整性破坏及促炎因子释放为特征，在肿瘤发展中具有双面作用，其激活或抑制状态可能影响肿瘤细胞存活与化疗敏感性，但其在下咽癌顺铂耐药中的调控机制尚未明确[5-6]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在肿瘤诸多生物学过程中作用关键，但其在下咽癌顺铂耐药中的研究较少[7]。有研究发现，LncRNA ZNF384-AS可激活程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1），增强舌鳞状细胞癌细胞顺铂耐药性[8]。还有研究显示，铂类化疗与PD-L1抑制剂联合治疗的协同机制可能与细胞焦亡有关[9]。本研究将体外培养顺铂耐药细胞株FaDu/DDP进行探讨，为改善下咽癌顺铂化疗敏感性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞

人下咽癌细胞系FaDu购自美国Manassas公司，批号：CCL-138。

1.2 试剂与仪器

顺铂（美国Sigma公司，批号：D1151000）；胎牛血清、RPMI-1640培养基（美国Gibco公司，批号：10099141C、31800022）；脂质体2000试剂盒（美国Invitrogen公司，批号：11668019）；ZNF384-AS小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）质粒及其阴性对照质粒、PD-L1过表达质粒及对照空载质粒（江苏集萃药康生物公司）；CCK-8试剂盒、放射免疫沉淀测定裂解液（radio）（中国凯基生物公司，批号：KGA317、KGP2100）；膜联蛋白Ⅴ/碘化丙啶（Annexin Ⅴ/propidium iodide，Annexin Ⅴ/PI）双染法检测试剂盒（美国BD公司，批号：556547）；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）细胞毒性检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A020-2-2）；ZNF384-AS、PD-L1引物由上海生工生物工程公司提供；Trizol试剂（美国Thermo公司，批号：15596026）；反转录试剂盒、PCR试剂盒（日本TaKaRa公司，批号：RR047A、RR820A）；PD-L1抗体、切割后半胱天冬酶-1（cleaved-Caspase-1）抗体、Gasdermin家族成员D（Gasdermin D，GSDMD）抗体、白细胞介素-18（interleukin-18，IL-18）抗体、IL-1β 抗体及内参抗体（美国Abcam公司，批号：ab237726、ab2302、ab215203、ab215387、ab9722、ab8226）。iMARK型酶标仪、CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国BIO RAD公司）；FACSCantoⅡ型流式细胞仪（美国BD公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 细胞培养 用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，悬浮细胞，于37 ℃、5%CO2 条件下培养，每日观察细胞形态及生长状态。待细胞生长至80%左右进行传代培养，传代时采用1∶3比例接种，避免细胞密度过高导致接触抑制，取对数生长期（生长状态良好、折光率高、无明显漂浮死细胞）的细胞进行正式实验。

1.3.2 顺铂耐药细胞株FaDu/DDP的构建 采用大剂量顺铂冲击刺激+小剂量顺铂维持刺激法构建下顺铂耐药细胞株FaDu/DDP，加入10 μg/ml的含顺铂培养基刺激细胞24 h，洗板更换为不含顺铂的培养基，待剩余细胞生长至50%以上再进行下次诱导，期间若细胞增殖缓慢，可适当延长培养时间，最长不超过72 h，避免过度饥饿影响细胞活性。每次诱导间隙，可加入低浓度（1 μg/ml）顺铂刺激细胞维持耐药性，维持培养时间不超过48 h，防止低浓度长期刺激导致细胞凋亡。每次诱导前检测细胞IC50 值，使得耐药细胞IC50 与初始对照细胞IC50 的比值达到2～5以上，这类细胞命名为FaDu/DDP。本研究中诱导周期为12轮，并撤药培养5～10代，确保耐药表型稳定遗传。

1.3.3 顺铂敏感性检测 待FaDu/DDP细胞恢复正常生长状态时，将细胞以5×103 个/孔的密度接种于96孔板，并设置正常FaDu细胞作对照，给予0.000、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000 μg/ml的含顺铂培养基，培养24 h后检测细胞活力，计算IC50 值。

1.3.4 质粒转染基因沉默与过表达 将FaDu/DDP细胞随机分为空白组、阴性对照组（同时转染siRNA阴性对照质粒和空载质粒）、ZNF384-AS敲低组（转染ZNF384-AS siRNA）、ZNF384-AS敲低+PD-L1过表达组（同时转染ZNF384-AS siRNA和PD-L1过表达质粒），按照脂质体2000说明书操作：分组混合质粒，质粒与脂质体比例为1.0∶2.5，两者分别用无血清培养基稀释后静置5 min，混合后室温孵育20 min。转染后6 h更换为含10%胎牛血清的完全培养基，48 h后收集各组细胞验证转染效率。

1.3.5 RT-qPCR检测基因表达 收集各组细胞，添加Trizol试剂提取总RNA，反转录合成cDNA，再进行荧光定量PCR扩增，ZNF384-AS正向引物5’-GCAGGCAAGAATAGAACAAGA-3’，反向引物5’-GGTGCTCAAGGGAAGGATT-3’；PD-L1正向引物5’-CTGTGAAAGTCAATGCCCCATAC-3’，反向引物5’-TCATTTGGAGGATGTGCCAGA-3’。反应体系（20 μl）：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物各0.8 μl，cDNA模板2 μl，ddH2O 6.4 μl。反应条件为：95 ℃预变性60 s，95 ℃变性15 s，58℃退火30 s，共42个循环。采用2-△△Ct 法，以GAPDH为内参，计算ZNF384-AS、PDL1 mRNA相对表达水平。

1.3.6 CCK-8检测细胞活力 将各组细胞以5×103 个/孔的密度接种于96孔板，分别培养24、48、72 h，添加含有10 μl CCK-8试剂的培养基，继续孵育2 h，上酶标仪检测450 nm处各孔的吸光度值，计算细胞活性=[（实验孔OD-空白孔OD）/（对照孔OD-空白孔OD）×100%]，空白孔中无细胞，仅添加培养基。实验复孔数为6。

1.3.7 流式细胞术检测细胞焦亡 收集各组细胞制备成1×106 个/ml细胞悬液，室温固定15 min，加入通透剂0.1%Triton X-100反应10 min，PBS洗涤后，用结合缓冲液重悬，添加cleaved-Caspase-1试剂，避光下室温反应20 min，再添加10 μl PI染液，避光下室温反应15 min，上流式细胞仪检测cleaved-Caspase-1（+）/PD-L1（+）占总细胞的百分比，即为细胞焦亡率。实验复孔数为6。

1.3.8 LDH释放实验检测LDH释放量 将各组细胞以5×103 个/孔的密度接种于96孔板，培养24 h后更换为含有1%胎牛血清的培养基，根据试剂盒说明书操作，检测上清液和细胞裂解液中LDH含量，计算LDH释放率=上清液LDH含量/（上清液LDH含量+细胞裂解液LDH含量）×100%。实验复孔数为6。

1.3.9 Westorn blot法检测蛋白表达 收集各组细胞，添加RIPA裂解液提取总蛋白，测定浓度后，定量取50 μg水浴变性，配制10%电泳凝胶，跑胶后转膜，取出聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride membrane，PVDF）膜浸于5%脱脂牛奶中封闭2 h，分别添加PD-L1（1∶1 000）、cleaved-Caspase-1（1∶1 000）、GSDMD（1∶500）、IL-18（1∶500）、IL-1β（1∶1 500）及内参β-actin（1∶1 000），4 ℃下摇床孵育过夜，次日再添加相应的蛋白二抗，37 ℃下摇床孵育30 min，最后滴加ECL试剂显色，留取蛋白条带图像，用Image J软件测定灰度值，以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值比值表示目的蛋白相对表达量。实验复孔数为6。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FaDu/DDP的鉴定及ZNF384-AS、PD-L1表达情况

与FaDu细胞比较，FaDu/DDP细胞出现不同程度空泡和细胞核增大，细胞间出现侵袭性伪足。与FaDu细胞比较，不同浓度顺铂处理后FaDu/DDP细胞活力降低（P＜0.05）。FaDu细胞IC50 为（1.19±0.11）μg/ml，FaDu/DDP细胞IC50 为（3.75±0.32）μg/ml。与FaDu细胞比较，FaDu/DDP细胞IC50、ZNF384-AS、PD-L1 mRNA及蛋白表达均升高（P＜0.05）。见图1。

图1 FaDu和FaDu/DDP细胞形态、对顺铂敏感性及ZNF384-AS、PD-L1的表达情况（n=6）

A：镜下细胞形态（100×）；B：细胞对顺铂敏感性；C：PD-L1蛋白条带；D：各组PD-L1蛋白表达柱状图；E：ZNF384-AS、PD-L1 mRNA水平。与FaDu细胞比较，aP＜0.05。

2.2 各组细胞ZNF384-AS、PD-L1表达比较

与空白组比较，ZNF384-AS敲低组PD-L1mRNA及蛋白、ZNF384 mRNA表达均降低（P＜0.05）；与ZNF 384-AS敲低组比较，ZNF384-AS敲低+PD-L1过表达组PD-L1 mRNA及蛋白表达均升高（P＜0.05）。见图2。

图2 各组细胞ZNF384-AS、PD-L1表达的比较（n=6）

A：PD-L1蛋白条带；B：各组PD-L1蛋白表达柱状图；C：ZNF384-AS、PD-L1 mRNA水平。与空白组比较，aP＜0.05；与ZNF384-AS敲低组比较，bP＜0.05。

2.3 各组细胞活力比较

与空白组比较，ZNF384-AS敲低组24、48、72 h时细胞OD450nm 值均降低（P＜0.05）；与ZNF384-AS敲低组比较，ZNF384-AS敲低+PD-L1过表达组24、48、72 h时细胞OD450nm 值均升高（P＜0.05）。见图3。

图3 各组细胞活力的比较（n=6）

与空白组比较，aP＜0.05；与ZNF384-AS敲低组比较，bP＜0.05。

2.4 各组细胞焦亡率及LDH释放率比较

与空白组比较，ZNF384-AS敲低组细胞焦亡率和LDH释放率均升高（P＜0.05）；与ZNF384-AS敲低组比较，ZNF384-AS敲低+PD-L1过表达组细胞焦亡率和LDH释放率均降低（P＜0.05）。见图4。

图4 各组细胞焦亡情况（n=6）

A：细胞焦亡流式图；B：细胞焦亡率；C：LDH释放率。与空白组比较，aP＜0.05；与ZNF384-AS敲低组比较，bP＜0.05。

2.5 各组细胞焦亡相关蛋白表达水平比较

与空白组比较，ZNF384-AS敲低组cleaved-Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β 蛋白相对表达量均升高（P＜0.05）；与ZNF384-AS敲低组比较，ZNF384-AS敲低+PD-L1过表达组cleaved-Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β 蛋白相对表达量均降低（P＜0.05）。见图5。

图5 各组细胞焦亡相关蛋白表达（n=6）

A：细胞焦亡相关蛋白条带；B：各组细胞焦亡相关蛋白表达柱状图。与空白组比较，aP＜0.05；与ZNF384-AS敲低组比较，bP＜0.05。

3 讨论

顺铂是一种经典的铂类化疗药物，具有广谱的抗肿瘤活性，临床常与5-氟尿嘧啶、紫杉醇等药物组成联合化疗方案，用于下咽癌患者的辅助化疗。这种联合化疗方案在一定程度上可缩小肿瘤体积、降低肿瘤分期，并提高患者的局部控制率和总生存率。然而，40%～60%的患者接受顺铂治疗过程中会出现原发性或获得性耐药，致使治疗有效率大幅降低，预后极差[10]。因此，探索下咽癌顺铂耐药的分子机制有着重要临床意义。

人类基因组中有98%属于非编码基因，其中lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子，与肿瘤的发生、发展密切相关。越来越多证据表明，lncRNA在肿瘤化疗耐药中发挥重要作用[11-12]。锌指蛋白384（zinc finger protein 384，ZNF384）属于锌指蛋白家族，在卵巢癌、肝癌等多种恶性肿瘤中，发挥原癌基因的功能[13-14]。ZNF384-AS作为其反义lncRNA，转录区域与ZNF384基因存在互补重叠，推测ZNF384-AS可能参与癌症的发生、发展过程。本研究大剂量顺铂冲击刺激+小剂量顺铂维持刺激法，构建下咽癌顺铂耐药细胞株FaDu/DDP，ZNF384-AS在FaDu/DDP细胞中高表达，提示ZNF384-AS可能参与下咽癌顺铂耐药过程。

PD-L1是一种Ⅰ型跨膜蛋白，主要表达与肿瘤细胞、肿瘤浸润免疫细胞及一些正常组织细胞表面，在肿瘤免疫逃逸过程中，PD-L1可与T细胞表面的程序性死亡受体1特异性结合，激活下游免疫抑制信号通路，使得T细胞无法有效识别和杀伤肿瘤细胞[15]。研究表明，PD-L1异常高表达介导的免疫逃逸，与顺铂耐药的形成密切相关[16]。本研究中，与正常FaDu细胞比较，FaDu/DDP细胞中PD-L1表达升高，这与既往研究相符[17]。有研究显示，肝细胞癌中转录因子ZNF384可激活信号转导和转录活化因子-1，从而影响PD-L1的表达[18]。高慧莉[8]的研究发现，ZNF384-AS可调控其下游转录因子ZNF384表达，激活PD-L1转录，增强舌鳞状细胞癌细胞免疫逃逸能力，从而调控细胞对顺铂的耐药性。为进一步验证ZNF384-AS、PD-L1在下咽癌顺铂耐药中的关系，通过敲低ZNF384-AS并过表达PD-L1进行干预，结果显示，敲低ZNF384-AS后PD-L1表达也受到抑制，同时FaDu/DDP细胞活力也明显下降，然而PD-L1过表达后能够部分逆转ZNF384-AS敲低所引发的细胞活力下降。提示下咽癌顺铂耐药中也存在ZNF384-AS调控PD-L1机制，与上述文献报道相似。

细胞焦亡由Gasdermin蛋白介导的细胞死亡方式，与顺铂耐药存在紧密且双向的关系。顺铂作为DNA损伤剂，可诱导肿瘤细胞发生应激反应，正常情况下这种应激可触发细胞焦亡通路，促使肿瘤细胞死亡[19]。然而当肿瘤细胞发生顺铂耐药时，细胞焦亡将受到抑制，通过多种途径抑制Caspase-1的激活，阻碍GSDMD的切割，减少IL-18、IL-1β 等炎症因子的释放，营造免疫抑制性微环境，进一步帮助肿瘤细胞逃避顺铂的杀伤和免疫系统的攻击[20]。本研究发现，与空白组比较，ZNF384-AS敲低组细胞焦亡率、LDH释放率、细胞焦亡相关蛋白cleaved-Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β 表达均升高；而PD-L1过表达后细胞焦亡则受到抑制。提示敲低ZNF384-AS可抑制PD-L1表达，实现对细胞焦亡的促进，这可能是减轻下咽癌顺铂耐药的重要机制。

综上所述，本研究揭示了ZNF384-AS通过激活PD-L1，参与调控下咽癌顺铂耐药及细胞焦亡过程的作用机制。然而，本研究仍存在一定的局限性，仅在细胞层面初步探讨了ZNF384-AS的功能，ZNF384-AS与PD-L1之间具体的调控机制还需继续探索。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Effects of lncRNA ZNF384-AS on Cisplatin resistance and pyroptosis in hypopharyngeal carcinoma by activating PD-L1 transcription

YANG Jiumei GOU Haocheng LIU Liangrong FAN Li ZHU Yufeng FENG Jun

Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery,Beijing Anzhen Hospital,Capital Medical University Nan Chong Branch Nan Chong Central Hospital,Sichuan Province,Nanchong 637000,China

[Abstract] Objective To explore the action mechanism of lncRNA ZNF384-AS participating in Cisplatin resistance and pyroptosis in hypopharyngeal carcinoma by activating programmed death ligand-1 (PD-L1) transcription.Methods The cisplatin-resistant cell strains (FaDu/DDP) of hypopharyngeal carcinoma were constructed by high-dose Cisplatin shock stimulation+low-dose Cisplatin maintenance stimulation.The expressions of ZNF384-AS and PD-L1 were detected by RT-qPCR and Western blot.FaDu/DDP cells were divided into blank group,negative control group,ZNF384-AS knockdown group,and ZNF384-AS knockdown+PD-L1 overexpression group.After transfection,cells activity was detected by CCK-8,pyroptosis rate was detected by flow cytometry,the release of lactate dehydrogenase(LDH)was detected by LDH release assay,and expressions of pyroptosis signaling pathway related proteins(cysteine protease 1[Caspase-1],Gasdermin family member D [GSDMD],interleukin 18 [IL-18],IL-1β) were detected.Results Compared with FaDu cells after treatment with different concentrations of Cisplatin,activity of FaDu/DDP cells was decreased (P＜0.05),IC50,mRNA and proteins of ZNF384-AS and PD-L1 were increased in FaDu/DDP cells (P＜0.05).Compared with blank group,mRNA and protein of and PD-L1,OD450nm at 24,48,and 72 h after intervention were decreased,pyroptosis rate,release rate of LDH,relative expression levels of cleaved-Caspase-1,GSDMD,IL-18,and IL-1β proteins were increased after knocking-down ZNF384-AS(P＜0.05).Compared with ZNF384-AS knockdown group,mRNA and protein of PD-L1,OD450nm at 24,48 and 72 h after intervention were increased,pyroptosis rate,release rate of LDH,relative expression levels of cleaved-Caspase-1,GSDMD,IL-18 and IL-1β proteins were decreased in ZNF384-AS knockdown+PD-L1 overexpression group (P＜0.05).Conclusion Knocking down ZNF384-AS can inhibitPD-L1 expression,increase caspase-1 mediated pyroptosis and reduce cisplatin resistance in hypopharyngeal carcinoma cells.

[Key words] Hypopharyngeal carcinoma;LncRNA ZNF384-AS;Programmed death ligand-1;Cisplatin resistance;Pyroptosis

[中图分类号] R739.63

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）10（b）-0012-06

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.29.03

[基金项目] 四川省医学科技创新研究会课题项目——细胞焦亡在下咽癌进展及耐药中的机制研究（KY-YCZD2024-266）。

[作者简介] 杨久梅（1989-），女，硕士；研究方向：喉癌的诊断和治疗。

（收稿日期：2025-06-09）

（修回日期：2025-08-07）