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Menkes病（Menkes disease，MD，OMIM#30940）是一种罕见的致死性铜代谢障碍X-连锁隐性遗传病，是由于ATP7A发生致病性变异导致的[1]；国外报道的发病率为1/300 000～1/35 000[2-3]。典型表现为进行性神经变性、癫痫、发育迟缓及毛发结缔组织异常，患儿多3岁前死亡[2]。目前无有效治疗，早期补充组氨酸铜可改善神经症状。本研究通过基因检测发现1例MD患儿存在未报道的新无义变异（c.1199C＞G，p.Ser400Ter），并结合文献总结了其临床、影像及基因突变特征，以提高临床认知。

1 资料与方法

1.1 临床资料

患儿男，2岁6个月，因“2岁余仍竖头不稳、无语言能力”入院。系第2胎第2产，足月顺产，出生体重3 150 g，无宫内窘迫及窒息史。母亲孕3产3：第1胎为4岁健康女童，第3胎为11月龄健康男童，均无异常。父母非近亲结婚。患儿生后3个月起出现喂养困难，无抽搐史。查体：神志清，精神反应尚可。颅面部查体（图1～2）：腭弓高耸、前囟闭合，特殊面容（头扁平、眼距宽、鼻梁塌陷、双耳大而松弛），伴头发色浅稀疏、卷曲质脆；胸廓呈漏斗状，皮肤白皙松弛；心腹无阳性体征，关节松弛。神经系统：眼神欠灵活，可追光追物，交流少、易哭闹但可逗笑，通贯掌；运动发育显著落后（不能抬头、独坐，双手抓物笨拙）；双上肢肌力Ⅲ级、下肢肌力Ⅱ级，四肢肌张力普遍低下，跟膝腱反射正常引出。辅助检查：铜蓝蛋白0.14 g/L（参考值0.2～0.6 g/L）；24 h尿铜0.509 μmol/L（参考值0～0.625 μmol/L）；血乙酰基肉碱增高；眼底检查显示视神经颜色稍淡，杯盘比0.4～0.5；头颅磁共振示双侧额叶容积小，脑沟裂增宽加深，双侧脑室旁斑片状异常信号灶，脑白质容积少，双侧脑室扩张、变形，双侧小脑半球脑沟裂增宽、加深，提示脑发育不良，脑室旁白质软化；膀胱超声示膀胱憩室；试听诱发电位示双侧Ⅰ、Ⅲ波，Ⅰ～Ⅲ峰间期、Ⅰ～Ⅴ峰间期明显延长，双侧P100波缺失；双侧听性脑干反应潜伏期Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波明显延长，反应阈值50 dB；长程视频脑电图未见异常；发育商评估中度异常。

本研究通过首都医科大学附属首都儿童医学中心医学伦理委员会的批准（SHERLL2022026），患儿监护人均知情同意并签署知情同意书。

1.2 实验方法

采集患儿及家系的静脉全血2 ml（EDTA抗凝），经血液基因组柱式中量DNA提取试剂盒（DP329-TA，Tiangen，中国）提取患儿及父母的外周血基因组中DNA后，基于DNBSEQ-T7（Mgi Tech Co.，Ltd，深圳，中国）进行高通量测序（质控标准：Rawdata＞10G，Q30≥85%）。

家系分析采用Sanger测序进行验证：根据ATP7A基因变异所在的位点序列设计引物（正向引物：5’-CTCTTCTTGAATGTGGTGTGATGA-3’；反向引物：5’-CTGGCTACCTCCATAGGACATAT-3’）进行PCR扩增；采用20 μl PCR反应体系于MiniAmp PCR仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]中进行扩增，体系包含：2*GC缓冲液10 μl（大连宝生物有限公司TaKaRa产品），5 mmol/L Dntp 1 μl，10 ng/μl正、反向引物各1 μl，TaqDNA聚合酶2U（北京天为时代），100 ng/μl DNA 1 μl，加去离子水至20 μl体积。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，53退火30 s，72 ℃链延伸2 min，扩增30个循环；最后72 ℃补充延伸10 min。扩增产物用ABI3730Xl测序仪（ThermoScientific公司）测序，基因序列分析与对比采用DNASTAR软件完成。

1.3 ATP7A蛋白质同源性预测及蛋白结构域分析

使用NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/ncbi_index/）查找基因序列，包括人ATP7A基因编码氨基酸序列（＞NP_001269153.1）及其他3种不同动物的蛋白序列：小鼠（＞NP_001103227.1）、黑猩猩（＞XP_016799061.1）、狗（＞XP_038306264.1）。通过在线软件Clustal Omega进行多物种ATP7A蛋白序列分析。使用PSIPREDv4.0预测人ATP7A蛋白质二级结构，并利用Smart数据库预测ATP7A蛋白质结构域。

1.4 致病性分析

根据美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）的序列变异解释指南对变异位点进行致病性分析[4]。

2 结果

2.1 基因结果

该患儿检出ATP7A基因无义变异c.1199C＞G（p.Ser400Ter），患儿母亲为ATP7A基因杂合子（图3），该变异导致ATP7A蛋白在400位氨基酸处发生截短，提前终止，且经ExAC、gnomAD、千人基因组、NCBI ClinVar及华表数据库验证为未收录的新发变异（PM2-Supporting）。

2.2 家系分析结果

家系分析发现，该变异来源于母亲（图4），其他表型正常的家庭成员未见该变异的携带，符合MD的X连锁隐性遗传的规律。患儿母亲为杂合携带者（c.1199C＞G），父亲基因结构与功能正常，证实为新生变异。

2.3 突变位点保守性分析及蛋白结构域分析

对人、小鼠、黑猩猩、狗4种脊椎动物的ATP7A氨基酸序列对比和跨物种保守性分析，显示变异对应的氨基酸位点均在物种间高度保守（图5），提示该位点对基因的表达调控非常重要。

ATP7A基因编码丝裂原活化蛋白激酶相互作用激酶（mitogen-activatedproteinkinaseinteractingkinases，MNK）。通过PSIPRED v4.0预测ATP7A蛋白二级结构显示，c.1199C＞G（p.Ser400Ter）突变影响的氨基酸位点位于α 螺旋区（图6）；Smart数据库结构域分析进一步证实，该突变发生于ATP7A蛋白第380～407位的铜结合结构域（图7A）。该结构域异常导致铜代谢障碍。图7B示ATP7A蛋白晶体结构及图7C功能域定位分析显示，此无义突变造成ATP7A蛋白从MBD4结构域中部开始发生截短，致使其后所有功能结构域缺失。

2.4 致病性分析

根据ACMG指南，该变异符合致病性标准（PVS1+PM2-Supporting+PP4）：PVS1证据源于无义变异导致蛋白编码提前终止，造成关键功能域缺失，严重影响蛋白功能；PM2-Supporting证据基于该变异在多个人群数据库中均未见收录；PP4证据则体现为患儿临床表现与ATP7A基因变异所关联的MD高度吻合。

2.5 治疗及随访

患儿确诊后因国内组氨酸铜未上市，仅予康复治疗；经15个月随访，患儿神经系统呈进行性退行性改变，表现为运动及语言功能显著倒退，病程无癫痫发作，患儿最终于3岁9月龄死亡（死因不明）。

3 讨论

ATP7A基因定位于染色体Xq13.3-q21.1，全长约150 kb，包含23个外显子，其编码产物是由1 500个氨基酸组成的MNK蛋白[5]。MNK蛋白是一种铜离子转运的跨膜蛋白，主要功能是将铜离子输送至铜依赖酶以促进其生物合成，并排出细胞内过剩的铜离子，从而维持体内铜稳态[6]。MNK蛋白晶体结构包括以下关键功能域：①6个同源的富半胱氨酸金属结合域（MBD1-6）；②8个疏水性跨膜结构域（TM1-8）；③3个细胞质结构域（N结构域、P结构域、A结构域）；④COOH末端[7-8]。

ATP7A基因变异通过影响MNK蛋白功能导致铜离子吸收及转运障碍，引发血清铜及铜蓝蛋白降低；其核心机制为铜依赖酶功能障碍（如赖氨酸氧化酶、细胞色素c氧化酶等），进而表现为神经退行性变、毛发卷曲色浅、动脉病变、骨骼异常及特殊面容等[9]。ATP7A变异可致3种表型：经典型的MD、枕角综合征及中间型[10]。MD首次由美国哥伦比亚大学的Menkes等[11]在1962年进行了描述，经典型MD以毛发稀疏/卷曲、癫痫、神经退行性变及结缔组织病为特征，多于3岁前死亡，绝大多数患者为男性，其母亲则为杂合子或携带者。本例患儿表现典型MD特征（进行性神经损伤、肌张力低下、毛发色脆易断、膀胱憩室、特征性脑萎缩及铜蓝蛋白降低），但病程无癫痫发作；结合ATP7A新发无义变异（c.1199C＞G），确诊为经典型MD。

目前，人类基因变异数据库中ATP7A的基因变异约有655例报道，约1/3为新发突变[2]。该基因突变类型多样，包括移码、剪接位点、无义和大片段缺失变异等，其中无义突变占20%～30%[10,12-14]。无义突变、移码突变及大片段的插入和缺失通常导致编码的蛋白截短，丧失重要的蛋白功能域，为严重类型的变异，与MD严重的表型相关[15]。国内研究显示c.2179G＞A（p.Gly727Arg）为热点变异（黄琼辉等[16]报道了2/8例、王娜等[17]报道了2/15例、Cao等[18]报道了5/24例），但对于有相同基因型的患儿临床表型也存在差异。既往报道的ATP7A基因变异多伴癫痫发作（58.8%）及早期死亡（中位生存期40个月）[10]。本例检出ATP7A外显子4无义变异c.1199C＞G（p.Ser400Ter），该变异仅编码400个氨基酸的截短蛋白，致MBD4后的所有结构域（MBD5-6，TM1-8及N、A和P域）缺失，导致铜转运功能障碍和异常的蛋白转运，进而呈现出较严重的表型。轻型的枕角综合征多与剪接位点或内含子变异相关：①剪接变异可致1个或多个外显子的跳跃，虽不改变全部转录产物（保留少量正常转录本），但仍表现为轻型表型[19]。②还有病例发现缺失外显子3和4，导致编码的蛋白从外显子5终止，但是患儿的表型为轻型[10]；研究发现，该患儿的ATP7A转录产物仍然能够识别下游的一个翻译起始点ATG，编码一个截短的蛋白（仅缺失MBD1-4，保留了MBD5以后的序列），仍然具有部分功能，与轻型表型相关。③COOH末端等非关键结构域缺失亦关联轻型表型[20]。因此，基因型-表型相关性需结合大样本转录/蛋白水平验证，来准确评估变异效应，但是变异效应的研究仍然不能全面诠释相同基因型的表型差异，可能还有其他的遗传或环境的因子参与修饰表型严重程度。

MD患儿的癫痫症状发生率高，但存在临床异质性：多数患儿（包括经典型与轻型）均伴发癫痫，仅少数患儿未表现癫痫发作，此类患儿通常预后更佳，表现为轻度精神发育迟滞、脑电图和磁共振成像异常程度较轻。值得注意的是，血浆铜水平与神经损伤严重程度呈负相关——脑电图异常严重者血浆铜更低，反映了大脑铜离子利用效率的遗传与生化异质性[21]。本例患儿虽无癫痫发作，但存在显著运动和语言发育落后，符合经典型MD重表型特征。其缺乏癫痫的临床特殊性，可能源于ATP7A基因p.Ser400Ter截短变异的分子特性：突变截短位置（第400位）位于MNK蛋白的MBD4金属结构域，可能保留了部分铜转运能力，延缓神经系统损伤[22]。目前，针对非癫痫型MD的机制研究仍较匮乏，以检索式“Menkes disease” AND（“without epilepsy” OR “non-epileptic”）在PubMed、万方数据知识服务平台、中国知网中未检出相关文献，凸显此类表型病例的研究价值。

大多数未经治疗的MD患儿多数在3岁前死亡，因此早期诊断和早期干预治疗十分重要。研究表明，早期予以胃肠外组氨酸铜治疗可提高存活率并改善神经系统变性的进展[23]；Guthrie等[24]研究发现，与组氨酸铜对照，伊利司莫铜（一种铜络合物）的使用，有效阻止了Menkes小鼠有害的神经退行性变化，从而提高了实验鼠的存活率。Guzman等[25]研究通过优化配方（Cu-Hiinj1：3）与配套质控方法，显著提升组氨酸铜注射液的稳定性与生产可行性，突破MD治疗中的药物屏障，有望为全球患者提供更安全、稳定的治疗选择。目前，国内MD的治疗仍是针对抗癫痫、支持、康复训练等的对症治疗。

本研究经高通量测序联合Sanger验证及家系分析，确诊1例携带ATP7A基因新发无义变异c.1199C＞G（p.Ser400Ter）患儿，明确该变异遗传自表型正常的母亲。此发现不仅为患儿家庭提供精准遗传咨询及产前诊断依据，有效降低再发风险，同时拓展了中国人群ATP7A基因突变谱。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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【作者机构】	首都医科大学附属首都儿童医学中心神经内科；德州市妇幼保健院首都儿科研究所德州儿童医学中心儿科；首都儿科研究所医学遗传研究室
【分类号】	R741
【基金】	首都卫生发展科研专项（首发2022-2G-2102）北京市高层次公共卫生技术人才建设项目（学科骨干-03-50）。

不伴癫痫发作的Menkes病一家系的临床与遗传学分析

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