过敏性紫癜（Henoch-Schönlein purpura，HSP）是儿童时期常见的系统性血管炎，以紫癜、关节炎、消化道黏膜出血和肾损害为主要临床表现[1]；其中，50%～75%的患者消化道受累，出现腹痛、呕吐、便血等消化道症状，称为腹型过敏性紫癜（abdominal Henoch-Schönlein purpura，AHSP）[2]。14%～36%的AHSP患者腹痛发生于典型皮肤紫癜之前，易与急性胃肠炎、阑尾炎、消化道溃疡等急腹症相混淆，从而延误治疗或导致不必要的外科手术[3]。AHSP的误诊率高，且常并发心肌损伤、肾炎、肠套叠等疾病，严重危害健康，故探索AHSP伴并发症的生物标志物用于早期诊疗尤为迫切[4]。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2021年6月至2022年12月于首都医科大学附属北京儿童医院中医科住院的139例AHSP患儿，另选取同期职工健康子女50名作为对照组。AHSP患儿按照是否有并发症分为伴并发症组（65例）、不伴并发症组（74例）。伴并发症组男39例，女26例；年龄（8.36±3.86）岁；并发症：心脏受累23例（35.4%），肾损伤17例（26.2%），肠套叠10例（15.4%），心脏与肾脏同时受累6例（9.2%），肝脏受累6例（9.2%），阴囊及睾丸受累3例（4.6%）。不伴并发症组男43例，女31例；年龄（8.62±3.00）岁。对照组男25例，女25例；年龄（8.92±4.21）岁。三组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经首都医科大学附属北京儿童医院医学伦理委员会批准（2020-k-261）。

1.2 诊断标准

参照欧洲风湿病联盟/儿科风湿病国际试验组织/欧洲儿科风湿病学协会标准[5]的相关内容制定，必要标准为可触性紫癜，且至少有以下一项：①急性弥漫性腹痛、呕吐等消化道症状，且非药物治疗难以缓解；②消化道出血或大便隐血阳性；③腹部B超显示不同部位、不同程度的肠壁水肿或腹腔渗出。

并发症诊断标准参照欧洲风湿病联盟/儿科风湿病国际试验组织/欧洲儿科风湿病学协会标准[5]、《儿童心肌炎诊断建议（2018年版）》[6]、《诸福棠实用儿科学》[7]制定。

1.3 纳入及排除标准

纳入标准：①符合AHSP诊断标准；②年龄＜18岁；③患儿和/或家属知情同意。排除标准：①合并其他风湿免疫性疾病；②合并其他原发性疾病或基础性疾病；③临床资料不全。

1.4 实验方法

1.4.1 仪器与试剂

BY-R20离心机购于北京白洋医疗器械有限公司；10 kDa超滤装置购于美国Pall公司；Oasis HLB固相萃取柱购于美国Waters公司；SPD131D真空离心浓缩仪、DIONEX UltiMate 3000 RSLCnano液相色谱仪、Orbitrap Exploris 480质谱仪均购于美国Thermo Fisher ScientificTM 公司。

二硫苏糖醇（D0632）、碘乙酰胺（I6125）、预冷乙醇（459836-1L）、尿素（U1250）、硫脲（88810）、三羟甲基氨基甲烷（648311）、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（T3253）、NH4HCO3（A6141）均购于美国Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶（v5280）购于美国Promega公司；甲酸（543804）购于德国Merck公司；乙腈（9011-01）购于美国J.T.Baker公司。

1.4.2 尿样采集 采集受试儿童入院当日清晨中段尿液10 ml，在4 ℃下离心30 min（相对离心力3 000×g，离心半径为9.4 cm，5 340 r/min），取上清液，分装并于-80 ℃冷藏。尿样在4 ℃下解冻后再次离心30 min（相对离心力12 000×g，离心半径为9.4 cm，10 690 r/min）以充分去除微小杂质，取上清液备用。

1.4.3 尿样处理

1.4.3.1 蛋白还原与烷基化 取4 ml上清液，加入二硫苏糖醇20 mmol/L二硫苏糖醇，95 ℃水浴还原10 min。避光条件下加入50 mmol/L碘乙酰胺，室温烷基化处理45 min，以稳定半胱氨酸残基。

1.4.3.2 蛋白沉淀与浓度测定 将烷基化样本加入6倍体积预冷乙醇，混匀后-20 ℃过夜沉淀蛋白。4 ℃离心收集沉淀，重悬于裂解液（8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、50mmol/L三羟甲基氨基甲烷和25mmol/L二硫苏糖醇）中。采用Bradford法测定蛋白浓度，保证样本均一性。

1.4.3.3 蛋白酶解与肽段脱盐 每个样本取100 μg蛋白，经超滤装置处理，用尿素缓冲液（8 mol/L尿素，0.1 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）和25 mmol/L NH4HCO3 洗涤2次，按酶与蛋白1∶50加入胰蛋白酶，37 ℃酶解14 h。酶解肽段经Oasis HLB固相萃取柱脱盐后，经真空离心浓缩仪干燥，-80 ℃保存备用。

1.4.4 液相色谱-质谱技术

利用液相色谱仪分离肽段，色谱柱为Acclaim PepMap RSLC C18（500 mm×75 μm，2 μm，100Å），流动相A为0.1%甲酸，流动相B为80%乙腈、0.1%甲酸，梯度洗脱。洗脱条件：0～20 min，5%→30%B；20～25 min，30%B；25～30 min，30%→5%B；30～35 min，5%B。流速为1.5 μl/min，柱温为35 ℃。

使用数据依赖采集模式进行质谱分析，生成数据非依赖采集方法的可变隔离窗口，确保质谱分析的高精度与稳定性。将色谱柱洗脱的肽段在+2.4 kV电压下离子化，质谱仪在高灵敏度模式下，设置全扫描范围350～1 500 m/z（分辨率120 000），MS/MS扫描（分辨率30 000），HCD碰撞能量30%。

1.4.5 蛋白鉴定与质控

基于数据非依赖采集质谱技术对样本进行非标记定量质谱鉴定，插入9例评估蛋白质酶解过程质量的质控样本（QC-DIG）及8例基于数据非依赖采集技术的质控样本（QC-DIA）作为质控组，统计每组样本鉴定蛋白数并取均值，确保实验稳定性和结果可靠性。

图1 样本鉴定的蛋白数

QC-DIG：评估蛋白质酶解过程质量的质控样本；QC-DIA：基于数据非依赖采集技术的质控样本。

1.4.6 数据处理

采用Tyanova等[8]研究方法识别并剔除潜在血细胞污染样本：选取30种特异性血细胞标志蛋白作为污染评估指标，计算其在各样本中的定量总和（Sum A）与该样本所有鉴定蛋白定量总和（Sum B）的比值后进行Log2 转换，记为Log2Ratio；均值与标准差记为AVG（Log2Ratio）及SD（Log2Ratio）；剔 除Log2Ratio ≥AVG（Log2Ratio）+2×SD（Log2Ratio）的样本。

低鉴定蛋白剔除步骤为：①计算该样本的鉴定蛋白数，记为Count A；②计算质控组蛋白数均值，记为AVG（Count B），求Count A与AVG（Count B）的比值Ratio；③求临床样本Ratio的均值AVG（Ratio）和标准差SD（Ratio），剔除Count A ≤A VG（Ratio）-2×SD（Ratio）的临床样本。

使用连续K近邻法填补缺失值后，三组样本筛选差异蛋白，需满足：①蛋白定量均值差异倍数≥1.5或＜0.67；②蛋白定量值经Log2 对数转化，组间比较P值＜0.05[9]。

1.5 生物信息学分析

t分布随机近邻嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）主要用于高维数据的低维可视化，以揭示数据的自然聚类结构[10]。正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）是蛋白质组学常用的监督学习技术，可有效提取组间差异信号[11]。t-SNE及OPLS-DA采用微生信平台、SMICA 14.0软件分析，进行100次置换检验以验证结果的稳健性，并绘制Venn图可视化。

基于DAVID数据库对差异蛋白进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）分析采用STRING数据库与Cytocape 3.10软件。

1.6 统计学方法

采用SPSS 27.0及R 4.3.1统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，若方差齐，多组间比较采用单因素方差分析；反之，则选取韦尔奇检验。计数资料采用例数和百分率表示，比较采用χ2 检验。通过Pearson相关性分析和变异系数（coefficient of variation，CV）评估质控样本的稳定性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本蛋白鉴定

不伴并发症组、伴并发症组、对照组、QC-DIG、QC-DIA鉴定蛋白均数分别为2 697、2 608、2 341、2 708、2 908个。见图1。

2.2 质控结果

Pearson相关性分析显示，QC-DIG间的r值为0.75～0.90，QC-DIA间r值均＞0.89，质控样本重复性良好。QC-DIG的CV值为0.43，QC-DIA的CV值为0.28，样品预处理效果较好，结果稳定性较高。见图2。

图2 质控样本相关性分析

A：QC-DIG间的相关性分析；B：QC-DIA间的相关性分析。QC-DIG：评估蛋白质酶解过程质量的质控样本；QC-DIA：基于数据非依赖采集技术的质控样本。

2.3 样本剔除与缺失值填充

本研究共剔除17例受红细胞污染与蛋白鉴定数低的样本，保留172例高质量样本。去除缺失比例≥50%的蛋白质后，最终得到2 853个蛋白用于后续研究。

2.4 生物标志物分析

2.4.1 t-SNE分析结果

三组样本呈现出良好的分离趋势。见图3。

图3 三组t-SNE分析

HC：对照组。t-SNE：t分布随机近邻嵌入。

2.4.2 OPLS-DA分析结果

在OPLS-DA模型中，经Z-score处理后三组呈现良好的组间分离趋势，见图4A。置换检验后R2（0.690）＞Q2（0.192），模型拟合良好，见图4B。

图4 三组OPLS-DA分析

A：OPLS-DA得分图；B：置换检验图。OPLS-DA：正交偏最小二乘判别分析。

2.4.3 差异蛋白筛选2 853个蛋白中筛选出196个差异蛋白作为AHSP伴并发症组的特异性标志物。见图5。

图5 三组差异蛋白的Veen图

2.5 差异蛋白功能分析

与AHSP伴并发症相关的196个差异蛋白中有129个上调蛋白、67个下调蛋白。

2.5.1 上调蛋白的GO、KEGG富集分析

上调蛋白在细胞外区域表现出显著的富集特征，且涉及的蛋白数量最多；生物学过程的蛋白数量相对较少，显著性较弱。富集蛋白数排名前3位的条目为细胞外区域、细胞外外泌体、细胞外空间。见图6。

图6 上调蛋白GO富集分析

GO：基因本体。

上调蛋白仅富集到沙门菌感染、胰腺分泌、脂质与动脉粥样硬化、肌动蛋白细胞骨架调控4条通路，其中沙门菌感染显著性最强，胰腺分泌富集倍数最大。见图7。

图7 上调蛋白KEGG富集分析

KEGG：京都基因与基因组数据库。

2.5.2 下调蛋白GO、KEGG富集分析

下调蛋白细胞外区具备最强的富集显著性，另外，与细胞黏附相关富集条目较多，但其显著性相对较弱。见图8。

图8 下调蛋白GO富集分析

GO：基因本体。

下调蛋白共富集到细胞外基质-受体相互作用、Rap1信号通路、细胞黏附分子等6条通路。细胞外基质-受体相互作用通路显著性最强且富集倍数最高。见图9。

图9 下调蛋白KEGG富集分析

KEGG：京都基因与基因组数据库。

2.6 差异蛋白PPI分析

PPI分析筛选出HSP90AB1、HSPA4、CDH1、AZGP1等16个具有较高网络连接度（节点Degree值≥10）的关键差异蛋白。见图10。

图10 差异蛋白PPI分析

PPI：蛋白质蛋-白质相互作用。

3 讨论

AHSP为HSP的常见临床亚型，主要依赖临床特征进行诊断。AHSP患者的并发症表现常不典型，易被漏诊、误诊而延误病情，故筛选其生物标志物对早期诊断具有重要价值[12]。

本研究结果显示，三组t-SNE与OPLS-DA分析结果差异显著；共筛选出196个差异蛋白其中129个上调蛋白、67个下调蛋白。上调蛋白GO富集分析显示，细胞外区域富集程度最高。Fang等[13]运用液相色谱-质谱技术对IgA肾病和过敏性紫癜性肾炎的尿液进行分析时，同样观察到后者的差异蛋白集中于细胞外区。上调蛋白KEGG富集分析显示，胰腺分泌、脂质与动脉粥样硬化通路在相关报道鲜见，可能与AHSP合并胰腺/心肌损伤有关。下调蛋白GO富集分析显示，细胞黏附相关生物学过程富集程度最高。足细胞通过黏附作用维持肾小球滤过膜完整性，提示细胞黏附功能紊乱与AHSP肾脏并发症密切相关[14]。同时结果显示，细胞外区富集最为显著，可能与IgA免疫复合物沉积及血管炎导致的血浆蛋白渗漏有关。下调蛋白KEGG富集分析显示，下调蛋白富集于细胞外基质受体相互作用通路，该通路通过单核细胞/巨噬细胞调控炎症细胞因子的表达，促进炎症反应[15]。

本研究基于PPI分析筛选出16个差异蛋白，主要参与炎症免疫调节、细胞黏附、应激反应等过程。既往研究发现，白蛋白与D-二聚体水平为AHSP的危险因素，但二者的特异性欠佳[16]。AZGP1是重要的免疫调节蛋白，Zhu等[17]利用蛋白质组学及ELISA法证实了过敏性紫癜性肾炎患儿尿液中AZGP1的诊断价值。AZGP1的市售ELISA试剂盒在4 ℃及-20 ℃下分别能存放1周及6个月，且检测成本较低，具有良好的稳定性及临床转化潜力。

综上所述，本研究对儿童AHSP伴并发症的差异蛋白进行深度分析，同时结合高通量技术筛选出生物标志物。但是，目前ELISA法仅适用于实验室定量分析，相关蛋白仍缺乏成熟的即时检测技术。未来可开展临床试验以验证候选标志物的诊断性能，优化检测方法，推动其临床转化应用。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1]XU L，LI Y，WU X.IgA vasculitis update：epidemiology，pathogenesis，and biomarkers[J].Front Immunol，2022，13：921864.

[2]中华医学会儿科学分会免疫学组，中华儿科杂志编辑委员会，中国儿童风湿免疫病联盟.中国儿童IgA血管炎诊断与治疗指南（2023）[J].中华儿科杂志，2023，61（12）：1067-1076.

[3]占一姗.儿童急性阑尾炎与腹型过敏性紫癜鉴别诊断预测模型建立及预测标志物研究[D].南昌：南昌大学，2023.

[4]DU L，WANG P，LIU C，et al.Multisystemic manifestations of IgA vasculitis[J].Clin Rheumatol，2021，40：43-52.

[5]OZEN S，PISTORIO A，IUSAN S M，et al.EULAR/PRINTO/PRES criteria for Henoch-Schönlein purpura，childhood polyarteritis nodosa，childhood Wegener granulomatosis and childhood Takayasu arteritis：Ankara 2008.Part Ⅱ：Final classification criteria[J].Ann Rheum Dis，2010，69（5）：798-806.

[6]中华医学会儿科学分会心血管学组，中华医学会儿科学分会心血管学组心肌炎协作组，中华儿科杂志编辑委员会，等.儿童心肌炎诊断建议（2018年版）[J].中华儿科杂志，2019，57（2）：87-89.

[7]王天有，申昆玲，沈颖.诸福棠实用儿科学[M].9版.北京：人民卫生出版社，2022.

[8]TYANOVA S，TEMU T，SINITCYN P，et al.The Perseus computational platform for comprehensive analysis of（prote）omics data[J].Nat Methods，2016，13（9）：731-740.

[9]AGUILAN J T，KULEJ K，SIDOLI S.Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics[J].Mol Omics，2020，16（6）：573-582.

[10]KOBAK D，BERENS P.The art of using t-SNE for singlecell transcriptomics[J].Nat Commun，2019，10（1）：5416.

[11]BOCCARD J，RUTLEDGE D N.A consensus orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLS-DA）strategy for multiblock Omics data fusion[J].Anal Chim Acta，2013，769：30-39.

[12]陈云，胡立杰，王婷婷，等.儿童腹型过敏性紫癜临床误漏诊分析[J].临床误诊误治，2023，36（5）：11-14.

[13]FANG X，LU M，XIA Z，et al.Use of liquid chromatographytandem mass spectrometry to perform urinary proteomic analysis of children with IgA nephropathy and Henoch-Schönlein purpura nephritis [J].J Proteomics，2021，230：103979.

[14]FANG X，WU H，LU M，et al.Urinary proteomics of Henoch-Schönlein purpura nephritis in children using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Clin Proteomics，2020，17：1-11.

[15]MARANGIO A，BICCARI A，D’ANGELO E，et al.The study of the extracellular matrix in chronic inflammation：a way to prevent cancer initiation?[J].Cancers，2022，14（23）：5903.

[16]LIU L，LIU H，ZHU K，et al.Proteome analysis reveals novel serum biomarkers for Henoch-Schönlein purpura in Chinese children[J].J Proteomics，2023，276：104841.

[17]ZHU Z Q，ZHANG T，CHANG S，et al.AZGP1 as a potential biomarker of IgA vasculitis with nephritis in a children-based urinary proteomics study by diaPASEF[J].Mol Med Rep，2023，28（2）：157.

Explore biomarkers of abdominal Henoch -Schönlein purpura with complications in children based on urinary proteomics

JI Fengye1 ZHU Zhongyi2 WANG Ling1 CHENG Xiaoxiao1 ZHANG Haoran2 YANG Yan2 DU Lina2

1.Department of Paediatrics,Dongzhimen Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,China;2.Department of Traditional Chinese Medicine,National Children’s Medical Center Beijing Children’s Hospital Affiliated to Capital Medical University,Beijing 100045,China

[Abstract] Objective To explore the urinary protein characteristics of abdominal Henoch-Schönlein purpura (AHSP)with complications in children,and screen specific biomarkers.Methods A total of 139 children with HSP admitted to Department of Traditional Chinese Medicine,Beijing Children’s Hospital,Capital Medical University from June 2021 to December 2022 were selected,and 50 healthy children of hospital employees during the same period were selected as control group.Children with HSP were divided into complication group(65 cases)and without complication group(74 cases)according to whether they had complications or not.Urine of three groups were collected for liquid chromatography-mass spectrometry analysis,and differential proteins were screened.Results Among 2 853 proteins,196 differential proteins were screened out as specific markers for complication group.Among the 196 differentially expressed proteins,129 were up-regulated proteins and 67 were down-regulated proteins.The up-regulated proteins showed significant enrichment characteristics in the extracellular region and involved the largest number of proteins;it is enriched in four pathways including salmonella infection,pancreatic secretion,lipids and atherosclerosis,and actin cytoskeleton regulation.There were many items related to the enrichment of down-regulated proteins and cell adhesion,which were enriched in six pathways including extracellular matrix receptor interaction,Ras1 signaling pathway,and cell adhesion molecules,etc.Proteinprotein interaction analysis screened out 16 key differential proteins with high network connectivity,including HSP90AB1,HSPA4,CDH1,and AZGP1,etc.Conclusion The significant enrichment of extracellular region and extracellular matrix-related pathways may be associated with immune complex deposition,leakage of plasma proteins into the extracellular space,and pro-inflammatory responses induced by extracellular matrix degradation products.Differentially expressed proteins such as AZGP1 demonstrate favorable sample stability and low cost,making them potential candidate biomarkers for AHSP with complications.

[Key words] Children;Abdominal Henoch-Schönlein purpura;Complication;Urinary proteomics;Biomarkers

[中图分类号] R272

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）11（a）-0001-07

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.31.01

[基金项目] 北京市自然科学基金面上项目（7212169）；首都卫生发展科研专项项目（首发2022-2-2097）；北京市中医管理局第六批北京市级中医药专家学术经验继承工作项目（京中医科字〔2021〕169号）。

[作者简介] 纪丰烨（2001.1-），男，北京中医药大学东直门医院2024级中医儿科专业在读硕士研究生；研究方向：中西医结合防治儿童风湿免疫病。

[通讯作者] 杜丽娜（1986.8-），女，医学博士，副主任医师；研究方向：中西医结合防治儿童风湿免疫病。

（收稿日期：2025-06-22）

（修回日期：2025-08-27）