肾小球内皮细胞内皮-间充质转化（endothelialto-mesenchymal transition，EndMT）在糖尿病肾病（diabetes nephropathy，DN）进展中发挥重要作用[1-4]；但其具体调控机制尚需深入探究。脂肪干细胞（adipose stem cells，ADSCs）是生物工程中应用较广泛的一类多能干细胞，具有多向分化潜能，可分泌多种活性细胞因子；ADSCs及其分泌的外泌体在心血管疾病、神经系统疾病、肝肾疾病等方面展现出广泛的治疗潜力[5-6]。有研究显示，miRNA-21与DN的发生密切相关[7-8]。本研究旨在深入探讨ADSCs来源外泌体负载miRNA-21对DN模型大鼠EndMT的调控机制，为临床治疗提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 实验动物

选择3月龄SPF级SD雄性大鼠70只，体重170～190 g，购自新疆医科大学实验动物中心，实验动物合格证号：[SCXK（新）2022-0003]，实验动物生产许可证号：[SCXK（新）2023-0001]，实验动物使用许可证号：[SYXK（新）2021-0043]。70只大鼠中10只用于提取ADSCs，60只用于实验研究。实验动物饲养环境为12 h光暗交替，温度为（24±2）℃、相对湿度为（55±5）%、摄食饮水自由。本研究所有操作符合动物伦理委员会要求，经新疆医科大学第二附属医院伦理委员会批准。

1.2 主要仪器与试剂

透射电镜（HT7800）、纳米颗粒跟踪分析仪（Nano-Sight NS300）购自日本奥林巴斯公司。

链脲佐菌素溶液、RPMI-1640完全培养基（2024 0235、20231265）购自美国Sigma公司；脂质体Lipofectamine 2000转染试剂（20185263）购自美国R&D公司；TRIzol试剂、反转录和PCR试剂盒（20225364、20196354、20201352）购自江苏碧云天科技有限公司；HE染色试剂盒和TUNEL染色试剂盒（20234526、20241256）购自美国Sigma公司；RIPA蛋白提取试剂和BCA蛋白定量试剂盒（20250003、20241526）购自江苏碧云天科技有限公司；兔抗鼠E-钙黏附蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、铁死亡抑制蛋白1（ferroptosis inhibitory protein 1，FSP1）、GAPDH抗体（20204158、2021 4256、20210236、20204578）购自美国R&D公司。

1.3 研究方法

1.3.1 ADSCs及外泌体提取 大鼠处死，取出腹股沟脂肪组织，剪碎，1 200 g离心3 min，离心半径为10 cm；弃上清液，加入混合胶原酶，37 ℃消化；吸取上清液，1 500 g离心8 min，离心半径为10 cm。RPMI-1640完全培养基重悬，接种至6 cm培养皿中，37 ℃，5%CO2中培养。

选择对数生长期的ADSCs，并与miRNA-21过表达、低表达及空载体质粒进行脂质体转染，48 h后采用qRT-PCR法检测转染效率，筛选稳定、高效表达的ADSCs提取外泌体（exosomes，Exo），同时提取不转染任何质粒ADSCs的Exo（ADSCs-Exo）。

1.3.2 分组及处理 大鼠按照随机抓取法分为空白对照组、模型组、ADSCs-Exo组、ADSCs-Exo-NC组、ADSCs-Exo-过表达组及ADSCs-Exo-低表达组，每组10只。ADSCs-Exo组、ADSCs-Exo-NC组、ADSCs-Exo-过表达组及ADSCs-Exo-低表达组分别在造模前1周尾静脉注射相应Exo，剂量为10 mg/kg，1次/d，连续1周[5]。

1.3.3 DN模型 空白对照组不做任何处理，常规饲养；其余5组复制DN模型。DN模型采用高糖高脂饮食4周，具体配方为猪油10%+胆固醇2.5%+蔗糖20%+胆酸盐1%+普通饲料66.5%，然后使用链脲佐菌素溶液腹腔注射（42 mg/kg）的方法复制DN模型[1]。3 d后抽取尾静脉血检测随机血糖≥16.7 mmol/L，24 h尿蛋白≥20 mg表示造模成功。连续饲养4周，观察大鼠饮食、活动及存活情况。造模后4周，超净台解剖出大鼠肾脏。

1.4 观察指标

1.4.1 ADSCs-Exo鉴定 提取Exo后采用透射电镜观察Exo形态，纳米颗粒跟踪分析仪测量Exo的大小和浓度，Western blot法检测Exo标志蛋白，包括CD63和CD81。

1.4.2 RT-qPCR法检测miRNA-21表达 将肾小球组织经超声粉碎匀浆，加入TRIzol试剂提取RNA，反转录合成cDNA。miRNA-21引物序列：正向引物5’-AATTGTGCAATTCGCGTGAGACAC-3’，反向引物5’-CGCTGTGCCCGGTGCGATGTGCGTA-3’，引物长度154 bp；β-actin引物序列：正向引物5’-TTGTGCGCACGCTGTCGTGCG-3’，反向引物5’-ATGTGCGTGCACGCTGAT-3’，引物长度89 bp。结果以2-△△Ct 表示。

1.4.3 尿微量白蛋白和血肌酐 造模后及造模后4周常规生化法检测大鼠尿微量白蛋白和血肌酐水平。

1.4.4 HE染色观察肾小球病理情况 制作肾小球石蜡切片，常规方法制作肾小球石蜡切片，依次进行脱蜡至水化、苏木精染色、水洗后分化、返蓝、伊红染色、脱水透明等操作，观察肾小球病理改变。

1.4.5 TUNEL染色观察肾小球内皮细胞凋亡 PBS洗涤细胞，加入50 μl TUNEL检测液后37 ℃避光孵育60 min，PBS洗涤后用抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下观察计数。

1.4.6 Western blot法检测E-cadherin、α-SMA、FSP1蛋白含量 肾小球组织经超声粉碎匀浆，加入RIPA蛋白提取试剂充分反应，BCA蛋白定量试剂盒测定浓度。取30 μg总蛋白，经8%SDS-PAGE电泳分离，将分离区带电转移至PVDF膜，加入兔抗鼠E-cadherin、α-SMA、FSP1、CD63、CD81及GAPDH一抗（1∶1 000）静置过夜，洗涤后加入对应二抗（1∶500）室温孵育4 h，PBS洗涤，ECL显色。使用Lab Works 4.5凝胶成像软件进行半定量分析，结果以目的蛋白与GAPDH条带灰度值比值表示。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADSCs-Exo鉴定

透射电镜显示，颗粒呈球形结构，表面不规则，生物膜结构明显，见图1A；Exo的直径为100～120 nm，与透射电镜观察结果一致，见图1B；Western blot法检测出特征性标记CD63、CD81表达，见图1C。

图1 外泌体鉴定

A：透射电镜图（400×）；B：纳米粒子追踪图；C：蛋白条带图。ADSCs：脂肪干细胞；Exo：外泌体。

2.2 各组miRNA-21表达比较

与空白对照组比较，模型组miRNA-21升高（P＜0.05）；ADSCs-Exo组、ADSCs-Exo-NC组与模型组miRNA-21比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与ADSCs-Exo-NC组比较，ADSCs-Exo-过表达组miRNA-21升高，ADSCs-Exo-低表达组miRNA-21降低（P＜0.05）。见图2。

图2 各组miRNA-21表达比较（n=10）

与空白对照组比较，aP＜0.05；与ADSCs-Exo-NC组比较，bP＜0.05。ADSCs：脂肪干细胞；Exo：外泌体。

2.3 各组尿微量白蛋白、血肌酐水平比较

与造模后比较，造模后4周模型组、ADSCs-Exo组、ADSCs-Exo-NC组、ADSCs-Exo-过表达组尿微量白蛋白、血肌酐水平升高，ADSCs-Exo-低表达组尿微量白蛋白、血肌酐水平降低（P＜0.05）。与空白对照组比较，模型组造模后和造模后4周尿微量白蛋白、血肌酐水平升高（P＜0.05）。ADSCs-Exo组、ADSCs-Exo-NC组与模型组造模后和造模后4周尿微量白蛋白、血肌酐水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。ADSCs-Exo-过表达组、ADSCs-Exo-低表达组与ADSCs-Exo-NC组造模后尿微量白蛋白、血肌酐水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与ADSCs-Exo-NC组比较，ADSCs-Exo-过表达组造模后4周尿微量白蛋白和血肌酐升高，ADSCs-Exo-低表达组造模后4周尿微量白蛋白、血肌酐水平降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组尿微量白蛋白、血肌酐水平比较

注 与同组造模后比较，aP＜0.05；与同期空白对照组比较，bP＜0.05；与同期ADSCs-Exo-NC组比较，cP＜0.05。ADSCs：脂肪干细胞；Exo：外泌体。

2.4 各组肾小球病理情况

空白对照组肾小球结构完整；模型组肾小球内皮细胞结构紊乱，间隙增大，系膜区明显增宽，系膜基质聚集；ADSCs-Exo组、ADSCs-Exo-NC组与模型组改变基本相似；ADSCs-Exo-过表达组内皮细胞明显减少，间隙进一步增大，系膜区进一步增宽，系膜基质进一步聚集；ADSCs-Exo-低表达组出现新生内皮细胞，间隙缩小，系膜区基质沉积减少。见图3。

图3 肾小球病理图（HE染色，100×）

ADSCs：脂肪干细胞；Exo：外泌体。

2.5 各组内皮细胞凋亡率比较

与空白对照组比较，模型组内皮细胞凋亡率升高（P＜0.05）；ADSCs-Exo组、ADSCs-Exo-NC组与模型组内皮细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与ADSCs-Exo-NC组比较，ADSCs-Exo-过表达组内皮细胞凋亡率升高，ADSCs-Exo-低表达组内皮细胞凋亡率降低（P＜0.05）。见图4。

图4 各组内皮细胞凋亡率比较

A：TUNEL染色图（200×）；B：各组内皮细胞凋亡率柱状图（n=10）。与空白对照组比较，aP＜0.05；与ADSCs-Exo-NC组比较，bP＜0.05。ADSCs：脂肪干细胞；Exo：外泌体。

2.6 各组E-cadherin、α-SMA、FSP1蛋白表达量比较

与空白对照组比较，模型组α-SMA、FSP1蛋白表达量升高，E-cadherin蛋白表达量降低（P＜0.05）。ADSCs-Exo组、ADSCs-Exo-NC组与模型组α-SMA、FSP1、E-cadherin蛋白表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与ADSCs-Exo-NC组比较，ADSCs-Exo-过表达组α-SMA、FSP1蛋白表达量升高，E-cadherin蛋白表达量降低（P＜0.05）；ADSCs-Exo-低表达组α-SMA、FSP1蛋白表达量降低，E-cadherin蛋白表达量升高（P＜0.05）。见图5。

图5 各组E-cadherin、α-SMA、FSP1蛋白表达量比较

A：蛋白条带图。B：各组E-cadherin、α-SMA、FSP-1蛋白表达柱状图（n=10）。与空白对照组比较，aP＜0.05；与ADSCs-Exo-NC组比较，bP＜0.05。E-cadherin：E-钙黏附蛋白；α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白；FSP1：铁死亡抑制蛋白1；ADSCs：脂肪干细胞；Exo：外泌体。

3 讨论

EXO参与细胞间的信息交换，调节受体细胞的生理功能，在调节多种疾病进程中发挥重要作用[9-10]。研究显示，EXO可以缓解DN的炎症反应[11]。陈洪民等[12]研究显示，糖通饮可能通过抑制miRNA-21/转化生长因子-β1表达来延缓DN大鼠的肾脏纤维化进程。EXO还可以改善DN氧化应激状态。黄莉吉等[13]研究表明，芪葵颗粒联合火把花根片治疗DN的临床效果较好，能够降低血清miRNA-21表达，延缓肾纤维化的进程。结合上述文献可知，miRNA-21表达可通过多种途径参与DN的发生。

本研究针对ADSCs-Exo进行了靶向miRNA-21表达，进一步研究显示，ADSCs-Exo-过表达组造模后4周肾小球病理损害明显加重，尿微量白蛋白和血肌酐水平、内皮细胞凋亡率、α-SMA和FSP-1蛋白表达量升高，而E-cadherin蛋白表达量降低；ADSCs-Exo-低表达组则相反。提示靶向抑制miRNA-21表达可以改善DN病情和病理损害，影响EndMT进程。尿微量白蛋白和血肌酐水平是评估DN严重程度及肾功能的主要指标。EndMT在DN的发生、发展中发挥重要作用，其可以破坏肾小球滤过屏障、促进肾间质纤维化、诱发肾小管上皮-间充质转化、参与炎症反应和免疫调节等[14]。转化生长因子-β1是EndMT的核心调控因子，通过Smad2/3磷酸化激活下游靶基因（如Snail、Twist），抑制内皮标志物（如CD31）并上调间充质标志物（如α-SMA）。本研究推测miRNA-21表达可能通过调控TGF-β/Smad信号通路活性，进而影响EndMT的发生。

综上所述，ADSCs来源EXO负载miRNA-21可以促进DN大鼠肾小球EndMT的发生。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Effects of exosomes-loaded miRNA-21 on renal endothelial-to-mesenchymal transition in rats with diabetic nephropathy

Reyihan Abudulitifu ZHANG Lin Gulixian Tuerhong LI Guangyu
Department of Nephrology,the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830028,China

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of adipose stem cells (ADSCs) derived exosomes (Exo)-loaded miRNA-21 in regulating renal endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) of rats with diabetic nephropathy (DN).Methods Seventy 3-month-old SPF-grade male SD rats were selected,among which 10 were used for extracting ADSCs and 60 were used for experimental research.ADSCs in the logarithmic growth phase were selected,and Exo were extracted after liposome transfection with miRNA-21 overexpression,low expression，and empty plasmid;meanwhile,Exo of ADSCs without transfection of any plasmid was extracted.Sixty rats were divided into blank control group,model group,ADSCs-Exo group,ADSCs-Exo-NC group,ADSCs-Exo-overexpression group,and ADSCs-Exo-low expression group according to the random grasping method,with 10 rats in each group.The ADSCs-Exo group,ADSCs-Exo-NC group,meanuhile,ADSCs-Exo-overexpression group,and ADSCs-Exo-low expression group were respe ctively injected with the corresponding Exo through the tail vein one week before replicating the model at a dose of 10 mg/kg once a day for one consecutive week.Except for blank control group,the other groups of rats were treated with a high-sugar and high-fat diet and intraperitoneal injection of Streptozotocin Solution to establish the DN model.The pathological conditions of glomerulus of rats in each group were observed;the apoptosis rate of endothelial cells,the levels of urine microalbumin and serum creatinine of rats in each group were compared;and the protein expressions of E-cadherin,α-smooth muscle actin(α-SMA),and ferroptosis inhibitory protein 1(FSP1)of rats in each group were compared.Results The glomerular structure of blank control group was intact;while the structures of glomerular endothelial cells in ADSCs-Exo group,ADSCs-Exo-NC group,and model group were disordered;a small number of endothelial cells were observed in ADSCs-Exo-overexpression group;while new endothelial cells appeared in ADSCs-Exo-low expression group.Compared with after modeling,the levels of urinary microalbumin and serum creatinine increased in model group,ADSCs-Exo group,ADSCs-Exo-NC group,and ADSCS-Exo-overexpression group 4 weeks after modeling,while those in ADSCs-Exo-low expression group decreased(P＜0.05).Compared with blank control group,the levels of urinary microalbumin and serum creatinine in model group increased after modeling and 4 weeks after modeling(P＜0.05);compared with ADSCs-Exo-NC group,the levels of urinary microalbumin and serum creatinine increased in ADSCs-Exo-overexpression group,while those in ADSCS-Exo-low expression group decreased 4 weeks after modeling (P＜0.05).Compared with blank control group,the apoptosis rate of endothelial cells in model group increased (P ＜0.05);compared with ADSCs-Exo-NC group,the apoptosis rate of endothelial cells in ADSCs-Exo-overexpression group increased,while that in ADSCs-Exo-low expression group decreased(P ＜0.05).Compared with blank control group,the expression levels of α-SMA and FSP1 proteins in model group increased,while the expression level of E-cadherin protein decreased (P＜0.05).Compared with ADSCs-Exo-NC group,the expression levels of α-SMA and FSP1 proteins in ADSCs-Exo-overexpression group increased,while the expression level of E-cadherin protein decreased (P＜0.05);in ADSCs-Exo-low expression group,the expression levels of α-SMA and FSP1 proteins decreased,while the expression level of E-cadherin protein increased (P＜0.05).Conclusion ADSCs derived Exo-loaded miRNA-21 can promote the occurrence of EndMT in glomeruli of DN rat.

[Key words] Diabetes nephropathy;Endothelial-to-mesenchymal transition;Adipose stem cells;Exosomes;miRNA-21

[中图分类号] R318

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）11（a）-0013-06

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.31.03

[基金项目] 新疆少数民族科技人才特殊培养计划科研项目（2021D03023）。

（收稿日期：2025-04-19）

（修回日期：2025-08-28）