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目前全球胰腺癌的发病率不断上升，死亡率居高不下[1]。我国胰腺癌新发病例数位列全国恶性肿瘤第8位，死亡人数居第6位，5年生存率仅为8.5%，预后极差[2-3]。80%患者确诊时丧失手术机会[4]。吉西他滨虽为化疗的金标准，但由于耐药性，疗效有限。亟须寻找新的治疗靶点[5]。

RAD23B蛋白是一种43 kD的定位于细胞核的高度保守的DNA损伤修复蛋白[6]。近年来研究发现，RAD23B在食管癌、胃癌和结直肠癌中均发挥促癌作用[7-9]。然而，关于RAD23B在胰腺癌中的功能作用及其潜在机制尚未明确。本研究旨在探究RAD23B对胰腺癌细胞的生物学行为的影响，初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

显微镜（型号：DM4000B，德国莱卡公司）；MultiskanTMFC酶标仪（美国Thermo Fisher公司）；流式细胞仪（美国BD公司，型号：FACSVerse）。RPMI-1640培养基（上海逍鹏生物科技有限公司，货号：C3010-0500）和胎牛血清（Viva Cell Bioscience，货号：C04001）；青霉素链霉素双抗灭菌液（江苏无锡耐思生命科技股份有限公司，货号：211092）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0013K）；4%多聚甲醛（货号：P1110）、0.1%结晶紫（货号：C1063）购于北京索莱宝科技有限公司。CCK8检测试剂盒（河北瑞派特生物科技有限公司，货号：RP-RC3028）；BCA蛋白浓度检测试剂盒（江苏凯基生物科技有限公司，货号：KGB2101-500)；细胞凋亡检测试剂盒（美国BD公司，货号：556547）；Transwell小室（美国Corning公司，货号：725001）；LipofectamineTM3000转染试剂（美国Thermo Fisher，货号：L3000001)；P53抗体（货号:ET1605-16）、Bax抗体（货号:ET1603-34）、Caspase-3抗体（货号:ET1608-64）、Cyclin D1抗体（货号:YT1172）均购自杭州华安生物技术有限公司；RAD23B抗体（ABclonal，货号:2121-1-AP）、Bcl-2抗体（Arigo,货号:ARG55188）、β-actin（ABclonal,货号:AC026）、Goat Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody（Report Biotech,货号：S1002）。RAD23B siRNA（苏州吉玛基因）。RAD23B shRNA慢病毒（山东维真生物科技有限公司）。siRNA和shRNA的序列见表1。pcDNA3.1和pcDNA3.1-RAD23B（NM_002874.5）真核基因表达质粒购自山东维真生物科技有限公司。

1.2 数据分析

通过GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析171例胰腺癌组织、179例正常胰腺组织中RAD23B基因的表达情况及RAD23B低表达组（89例）、RAD23B高表达组（89例）患者生存率。

1.3 细胞培养及分组

人胰腺癌细胞PANC-1和BXPC-3购自国家实验细胞库。用含10%FBS、1%双抗的RPMI-1640培养基，37℃、5%CO2 培养箱中培养。按LipofectamineTM3000说明书将不同序列siNC、siRNA-1、siRNA-2及pcDNA3.1和pcDNA3.1-RAD23B质粒转染至胰腺癌细胞PANC-1和BXPC-3中，分别命名为siNC、siRNA-1、siRNA-2组及OE-NC、OE-RAD23B组，用于后续实验。

1.4 CCK8检测

将胰腺癌细胞以5 000个/孔接种于96孔板中，每组设4个复孔。分别于24、48、72、96 h每孔加入100 μl CCK8试剂，37 ℃孵育2 h。酶标仪测定450 nm吸光度值。实验重复3次。

1.5 克隆形成实验

将胰腺癌细胞以1 000个/孔接种于6孔板中。培养10～14 d。4%多聚甲醛固定10 min，0.1%结晶紫染色20 min。对形成的菌落拍照计数。实验重复3次。

1.6 Transwell实验

上室中加入100μlMatrigel基质胶（用于侵袭实验）或不加基质胶（用于迁移实验）。上室接种2×104 个细胞，下室加入含10%FBS的完全培养基，培养48 h。甲醇固定10 min，0.1%结晶紫染液染色20 min。显微镜下对迁移或侵袭的细胞拍照计数（放大倍数20倍）。实验重复3次。

1.7 细胞凋亡实验

胰腺癌细胞用siRNA转染48 h后，收集细胞，用FITC AnnexinV和PI染色。流式细胞仪检测凋亡率。实验重复3次。

1.8 Western blot法

采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，经12%SDSPAGE凝胶电泳分离后移至PVDF膜。10%脱脂牛奶室温封闭2 h，TBST洗3次，分别加入RAD23B、P53、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cyclin D1（稀释比例1∶1 000）和β-actin（稀释比例1∶2 000）一抗4 ℃摇床孵育过夜。次日洗膜、二抗（稀释比例1∶5 000）室温孵育1 h。ECL显色后拍照，使用Image J软件分析条带灰度值。实验重复3次。

1.9 统计学方法

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 9.0软件进行数据分析和作图。计量资料采用均数±标准差（ pagenumber_ebook=26,pagenumber_book=21

）表示，比较采用t检验。采用Logrankχ2 检验分析生存率。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GEPIA数据库中RAD23B在胰腺癌组织中的表达

胰腺癌组织中RAD23B基因表达高于正常组织，且RAD23B低表达患者较RAD23B高表达患者生存率更高（P＜0.05）。见图1。

2.2 敲低RAD23B对胰腺癌细胞增殖能力的影响

siRNA-1、siRNA-2组RAD23B蛋白表达水平、增殖速度低于siNC组，平板克隆形成数少于siNC组（P＜0.05）。见图2。

2.3 敲低RAD23B对胰腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响

siRNA-1、siRNA-2组细胞迁移及侵袭能力低于siNC组（P＜0.05)。见图3。

2.4 过表达RAD23B对胰腺癌细胞增殖能力的影响

与OE-NC组比较，OE-RAD23B组RAD23B蛋白的表达水平升高，增殖速度增快，平板克隆形成数增多（P＜0.05）。见图4。

2.5 过表达RAD23B对胰腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响

OE-RAD23B组细胞迁移及侵袭能力高于OE-NC组（P＜0.05)。见图5。

2.6 敲低RAD23B对胰腺癌细胞凋亡的影响

siRNA-1、siRNA-2组的细胞凋亡百分比高于siNC组（P＜0.05）。见图6。

2.7 敲低RAD23B对胰腺癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响

与siNC组比较，siRNA-1、siRNA-2组P53、Bax和Caspase-3水平上调，而Bcl-2表达下调（P＜0.05）。见图7。

3 讨论

RAD23B包含1个N端泛素样结构域（UBL）、两个泛素连接结构域（UBA）和1个STI1结构域。STI1介导与XPC蛋白的结合，UBL与26S蛋白酶体亚基结合，UBA与泛素修饰的蛋白底物结合[10]。RAD23B参与DNA损伤识别、泛素-蛋白酶体系统调控，调控细胞周期、凋亡及肿瘤的发生[11]。研究表明，P53蛋白作为关键转录因子，通过调控细胞周期停滞、DNA修复、细胞凋亡、自噬和代谢等途径维持基因组稳定性[12-14]。当细胞暴露于内部和外部压力（包括DNA损伤、缺氧、营养剥夺和癌细胞风险）时，P53泛素化受到抑制导致其快速累积，进而通过激活Bax等促凋亡基因诱导细胞凋亡[15-17]。RAD23B可通过其UBA/UBL结构域介导P53蛋白的泛素化降解[18-20]。其敲低后可能导致P53蛋白稳定性增强，从而激活下游Bax与Caspase-3，诱导线粒体通路凋亡。本研究中仅敲低RAD23B即能显著诱导细胞凋亡，可能与RAD23B在维持细胞稳态中的核心调控作用相关。

综上所述，研究结果显示RAD23B可能通过调控P53信号通路诱导细胞凋亡，从而抑制肿瘤进展。RAD23B有望作为胰腺癌的潜在生物标志物及治疗靶点。

然而需要指出的是，目前本研究仅从蛋白表达水平间接反映RAD23B对P53的调控，尚缺乏对两者相互作用及功能激活的直接实验验证。此为本研究的局限之一，并计划在后续研究中进一步明确RAD23B是否通过与P53直接结合并调控其转录活性及稳定性，从而调节凋亡进程。

作者贡献声明：郝志佼负责实验开展、论文写作；范景怡、郑雨桐负责数据整理；陈阳、吴晨鹏负责统计学分析；刘颖、解海茹负责文献检索；李军负责研究和实验指导。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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【作者机构】	¹华北理工大学临床医学院； ²河北省唐山市工人医院检验科； ³河北省唐山市工人医院病理科
【分类号】	R735.9
【基金】	河北省自然科学基金资助项目（H2022105001）河北省重点研发计划项目（22377727D）

RAD23B对胰腺癌细胞生物学行为的影响

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