流感疫苗的生产和批签发依赖于疫苗效价的准 确测定，血凝素含量是目前反映流感疫苗效价的重要指标[1-3]。现行的疫苗效价测定方法为单向免疫扩散法（single-radial immunodiffusion，SRID），该方法的准确性依赖于抗原抗体形成的沉淀环直径的准确测量[4]。游标卡尺直测法由人工操作，具有精度低、主观性大、操作繁琐且耗时长的缺点。Immulab血凝素含量测定系统是为疫苗研究开发的专业商用测量系统，可识别凝胶板上的圆形沉淀环，快速准确地自动测量其直径。本研究建立了基于Immulab血凝素含量测定系统的SRID检测法，通过对建立的方法进行方法学验证，并与游标卡尺法进行一致性研究，旨在提高血凝素含量检测的精度并缩短试验周期，为疫苗质量的快速评价提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 参考品及疫苗

人流感病毒主要由甲型流感病毒（H1N1亚型，H3N2亚型）和乙型流感病毒（B/Yamagata系，以下简称“B/Y”；B/Victoria系，以下简称“B/V”）组成，四价流感病毒裂解疫苗[quadrivalent influenza vaccines（split virion）inactivated，QIV］涵盖上述4种亚型[5]。标准抗原H1N1（批号：22/320）、H3N2（批号：21/314）及B/V（批号：21/316）购自英国生物制品检定所，标准抗原B/Y（批号：2020/136B）购自澳大利亚治疗用品管理局。标准血清H1N1（批号：23/100）、H3N2（批号：22/226）及B/V（批号：22/228）购自英国生物制品检定所，标准抗原B/Y（批号：AS449）购自澳大利亚治疗用品管理局。QIV供试品由安徽智飞龙科马生物制药有限公司提供（批号：202203001、202203002、202203003、202210008、202312002、202406001）。

1.2 主要试剂

琼脂糖（上海贝晶生物技术有限公司，货号：BYR0100）；考马斯亮蓝R-250（美国VWR Life Science公司，货号：0472）；去垢剂N-二甲基-3-铵-1-丙烷磺酸盐（德国Merck KGaA公司，货号：693017）。

1.3 基于SRID的Immulab血凝素含量测定系统的应用

参照《中华人民共和国药典》[4]三部（2020年版）中SRID法，取适量H1N1、H3N2、B/V、B/Y型别的标准血清，分别于1.5%琼脂糖中混匀，制备4块不同型别血清琼脂胶板，冷却后打孔，孔径3 mm，孔间距13 mm。按文献方法制备B型双价标准抗原参考品，将B/V和B/Y标准抗原分别用注射用水溶解至血凝素含量为80 μg/ml，将两者1∶1混合待用[6-7]。另将H1N1和H3N2标准抗原分别用注射用水溶解至血凝素含量为40 μg/ml，将制备好的标准抗原/QIV供试品分别与10%去垢剂按9∶1的体积比混匀，室温裂解30～60min后进行浓度稀释。在含有4种不同型别标准血清的琼脂胶板小孔中对应加入H1N1、H3N2、B/V+B/Y、B/V+B/Y型别的40、30、20、10 μg/ml标准抗原、QIV供试品及加标样品，每孔10 μl并设双复孔。于20～25 ℃放置至少18～24 h。用磷酸盐缓冲液浸泡1 h后，干燥、染色、脱色。用Immulab血凝素含量测定系统或游标卡尺测量标准抗原/供试品形成的沉淀环直径的横径和纵径，求出两者均值。以标准抗原形成的沉淀环直径（Y）对其相应浓度（X）进行直线回归，求出直线回归方程，将供试品的沉淀环直径代入直线回归方程，可得到供试品的血凝素含量。

1.4 方法学验证

1.4.1 线性 分别配置4种不同型别浓度的标准抗原（40、30、20、10 μg/ml），按“1.3”项下方法，沉淀环直径用Immulab血凝素含量测定系统测量，重复3次实验，以标准抗原沉淀环直径对其浓度绘制标准曲线得到其相应的拟合度，若相关系数≥0.98，则提示曲线拟合度良好。

1.4.2 专属性 分别取4种型别40 μg/ml标准抗原、3批QIV供试品及PBS，按“1.3”项下方法，观察标准抗原及QIV供试品与4种型别特异性血清是否产生特异性反应，PBS溶液与4种型别特异性血清是否产生非特异性反应。

1.4.3 准确度 采用加样回收实验比较血凝素含量测量值与真实值之间的差异。取3批QIV供试品分别与4种不同型别浓度为30 μg/ml的标准抗原等体积混合后作为加标样品，按“1.3”项下方法，沉淀环直径用Immulab血凝素含量测定系统测量。回收率=（加标样品血凝素含量×2-QIV供试品血凝素含量）/加入标准抗原浓度×100%，若回收率在80%～120%范围内，则提示准确度良好。

1.4.4 重复性 取3批QIV供试品，按“1.3”项下方法每批供试品检测6次，沉淀环直径用Immulab血凝素含量测定系统测量，同一批QIV供试品各型别抗原血凝素含量的RSD≤20%。

1.4.5 中间精密度安排同一实验员不同天及同一天不同实验员按“1.3”项下方法检测1批QIV供试品血凝素含量，各型别抗原血凝素含量的检测3次，沉淀环直径用Immulab血凝素含量测定系统测量，同一实验员不同天及同一天不同实验员QIV供试品各型别抗原血凝素含量的测定结果应RSD≤20%。

1.4.6 耐用性 通过改变实验条件，验证该方法检测QIV血凝素含量的稳定性。取3批QIV供试品按“1.3”项下方法检测，沉淀环直径用Immulab血凝素含量测定系统测量，琼脂胶扩散时间分别为18、22、24 h，不同条件下供试品血凝素含量测定结果的RSD应≤20%。

1.5 不同方法检测沉淀环直径的一致性研究

取6批QIV供试品，按“1.3”项下方法，沉淀环直径采用游标卡尺和Immulab血凝素含量测定系统测量，参考文献中统计学研究方法对血凝素含量结果进行配对t检验，Pearson相关性分析及Bland-Altman分析观察两种方法的一致性[8-10]。

1.6 统计学方法

计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t检验；Pearson相关性分析及Bland-Altman分析均由GraphPad软件完成。

2 结果

2.1 基于SRID的Immulab血凝素含量测定系统的应用

将制备好的各型别抗原的琼脂胶板放入Immulab血凝素含量测定系统，系统经扫描成像后自动识别沉淀圆环，并测量每个孔的横径及纵径。Immulab血凝素含量测定系统可识别4种型别抗原与血清形成的淡蓝色沉淀环，并用蓝色标尺显示沉淀环的最大横径及纵径。见图1。

图1 基于SRID的Immulab血凝素含量测定系统的应用

2.2 方法学验证结果

2.2.1 线性验证结果H1N1、H3N2、B/V+B/Y（B/V血清）、B/V+B/Y（B/Y血清）型别标准抗原在其稀释度内进行直线回归，3次实验的标准曲线相关系数均＞0.98，结果见表1，提示线性良好。

表1 线性验证结果

2.2.2 专属性验证结果4种标准抗原及QIV供试品与4种型别的特异性血清均形成清晰可辨的沉淀环，PBS与4种型别的特异性血清均不形成清晰可辨的沉淀环。见图2。

图2 专属性验证结果

2.2.3 准确度验证结果3批QIV供试品各型别抗原对应的血凝素含量回收率结果见图3，回收率均为80%～120%，提示准确度良好。

图3 准确度验证结果

2.2.4 重复性验证结果3批QIV供试品重复测定6次，血凝素含量测定结果的RSD均≤5%。见表2。

表2 重复性验证结果（，n=6）

2.2.5 中间精密度 同一实验员不同天及同一天不同实验员检测四价流感病毒裂解疫苗血凝素含量，4种不同型别抗原血凝素含量结果的RSD为2.35%～4.97%，均≤5%，结果见表3。

表3 中间精密度验证结果

2.2.6 耐用性验证结果 改变SRID法中琼脂胶扩散的时间并检测不同型别抗原的血凝素含量，结果如表4所示，不同扩散时间的血凝素含量RSD为0.47%～5.36%，提示调整该实验参数对方法的检测结果无影响。

表4 耐用性验证结果

2.3 不同方法检测沉淀环直径的一致性分析

2.3.1 配对t检验 两种方法的4种不同型别抗原血凝素含量结果P值分别为0.66、0.32、0.91、0.28，均＞0.05，提示两种方法的结果无显著性差异。见图4。

图4 配对t检验分析结果

2.3.2 Pearson相关系数 分别以游标卡尺法血凝素含量结果为因变量（X），Immulab法结果为自变量（Y），采用GraphPad软件分析两种方法的相关性，结果显示两种测定法4种不同型别抗原血凝素含量结果具有正相关性（r=0.91、0.92、0.97、0.93，P＜0.05），结果见图5。

图5 Pearson相关性分析统计结果

2.3.3 Bland-Altman分别以游标卡尺法和Immulab法血凝素含量结果均值为横坐标，以游标卡尺法和Immulab法血凝素含量结果差值为纵坐标，对4种不同型别抗原血凝素含量结果采用GraphPad软件绘制Bland-Altman图，结果见图6。两种检测方法的4种不同型别抗原血凝素含量差值的均值分别为（-0.07±0.35、-0.37±0.83、-0.02±0.43、0.21±0.44）μg/ml，所有数据点均在95%CI内，游标卡尺法和Immulab法血凝素含量结果具有一致性。

图6 Bland-Altman分析统计结果

3 讨论

流感病毒主要经感染者飞沫或分泌物传播，侵袭患者肺或气道致高热、咳嗽或全身不适，严重时引起肺炎致人死亡[11-13]。世界卫生组织发布的《2019—2030全球流感战略》[14]指出，流感仍是全球最大的公卫问题之一，每年约有10亿的流感病例，重症患者病例为300万～500万，并致29万～65万患者死亡。在我国某些地区，甲型流感阳性率近几年呈增高趋势[15]。中国疾病预防控制中心建议推广并扩大流感疫苗的接种，以降低流感的严重性[16]。QIV涵盖4种亚型的流感病毒，能为接种者提供更为全面的防护[17-22]。

已有研究为基于仪器软件实现圆环直径的自动测量提供理论基础，有研究团队开发了抗生素效价检测中抑菌圆环图像处理及自动检测的软件，实现了对抑菌圈的自动测量，克服了人工测量的缺点[23]；另有报道称抑菌圆环自动测量仪具有良好的准确性，将标准板放置在不同位置，不同角度，对直径的测量结果均无显著性差异[24]；有学者将机器视觉技术应用于计算机，开发了血凝素含量自动测量仪，测量精度可达2 μg/ml，但未对仪器方法进行品种适用性验证研究[25]。

本研究应用Immulab血凝素含量测定系统检测血凝素含量，方法线性及专属性良好，准确度、重复性及中间精密度高，且耐用性好。与游标卡尺法测定结果具有相关性和一致性，可将其应用于血凝素含量的检测。相对于传统的游标卡尺血凝素含量测定法，Immulab血凝素含量测定系统实现了对SRID法中沉淀环的自动测量，可提高血凝素含量测量的精度，缩短试验周期，在流感大流行期间，有望提高有效疫苗的快速批签发和放行，缩短疾病的流行时间。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Consistency analysis of different measurement methods for precipitation ring diameter in the determination of hemagglutinin content

GAO Yimin1 LI Liandi1 WANG Jiaji2 XU Leiming1

1.Anhui Institute for Food and Drug Control,Anhui Province,Hefei 230051,China;2.Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical Co.,Ltd,Anhui Province,Hefei 230031,China

[Abstract] Objective To measure the diameter of precipitation ring in the hemagglutinin content by two different methods,and to analyze the consistency of the measured results.Methods The single-radial immunodiffusion (SRID) was used to detect the hemagglutinin content.The diameter of precipitation ring was measured by Immulab hemagglutinin content determination system,and the method was methodological validated.The diameter of precipitation ring was measured by vernier caliper or Immulab hemagglutinin content determination system,respectively.The measurement results were analyzed by paired T test,Pearson correlation analysis and Bland-Altman analysis were used to observe the consistency of the two methods.Results The SRID based Immulab hemagglutinin determination method had good linearity,strong specificity and high durability.The RSD of repeatability and intermediate precision test results were ≤6%.The results of the consistency study showed that there was no significant difference between the measurement results of the two methods,and the Pearson coefficient was ＞0.8 and the results were positively correlated.Bland-Altman analysis showed that the mean difference between the two methods was within the 95% confidence interval,and the measurement results were consistent.Conclusion The hemagglutinin content determination method using Immulab hemagglutinin assay system has good repeatability and high accuracy,and is consistent to the vernier caliper method.

[Key words] Content of hemagglutinin;Diameter of precipitation ring;Consistency analysis

[中图分类号] R392-33

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）11（a）-0026-06

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.31.05

[基金项目] 安徽省药品监督管理局科技创新项目（AHYJKJ-202213）。

[作者简介] 高益敏（1993-），女，硕士；研究方向：药检药理和生物制品质量控制。

[通讯作者] 王佳霁（1986-），男，硕士；研究方向：生物制品质量研究与评价。许雷鸣（1980-），男，博士，副主任药师；研究方向：药检药理和生物制品质量控制。

（收稿日期：2025-07-03）

（修回日期：2025-08-26）