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三黄洗剂首载于《中医外科学》，由大黄、黄柏、黄芩、苦参组成，具有清热燥湿、杀虫止痒的功效，适用于各种急性皮肤病及疖病，见红肿热痛瘙痒渗液者。三黄洗剂（青药制备字Z20210119000）作为青海高原地区皮肤病防治的特色制剂，在长期应用中获得了良好的临床反馈，但是目前尚无明确的质量控制标准，制约了其进一步推广应用。需要特别说明，虽然存在同名异方，但鲜见此特定组方的指纹图谱及多指标含量测定研究的公开文献报道[1]。本研究通过建立HPLC指纹图谱、化学计量学分析及同时测定7种指标成分含量，为三黄洗剂的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦1260高效液相色谱仪配备二极管阵列检测器（美国Agilent公司）；KQ-500DE台式超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；EX125ZH十万分之一电子天平（常州奥豪斯仪器有限公司）；5810R离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 药物与试剂

没食子酸（批号：JB242565）、药根碱（批号：N03IB231067）、黄芩苷（批号：JB246114）、小檗碱（批号：JB241108）、黄芩素（批号：A07IB222187）、汉黄芩素（批号：JB241988）、大黄素（批号：M29IB216001）均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98%；色谱纯甲醇（批号：C17490813）、色谱纯乙腈（批号：C17601042）、分析纯磷酸（批号：C17508021）、分析纯异丙醇（批号：C17440672）均购自上海麦克林生化科技股份有限公司；娃哈哈纯净水（批号：20250328）购自青海西宁娃哈哈启力饮料有限公司。

三黄洗剂样品S1（批号：011551）、S2（批号：011553）、S3（批号：080831）、S4（批号：050643）、S5（批号：021021）、S6（批号：050641）、S7（批号：080831）、S8（批号：011552）、S9（批号：050643）、S10（批号：032141）均由青海省中医院制剂中心提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.2%磷酸水（B），梯度洗脱，洗脱程序为：0～5 min，8%→10%A；5～10 min，10%→13%A；10～20 min，13%→23%A；20～40 min，23%→53%A；40～43 min，53%→85%A；43～45 min，85%→8%A；45～50 min，8%A；流速为：0～5 min，0.8 ml/min；5～45 min，1 ml/min；45～50 min，0.8 ml/min；柱温为38 ℃，检测波长为280 nm，进样量为5 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取没食子酸、药根碱、黄芩苷、小檗碱、黄芩素、汉黄芩素、大黄素对照品粉末适量，用甲醇溶解，制成质量浓度分别为4.74、2.35、2.30、2.18、1.27、2.98、1.96 mg/ml的单一对照品贮备液，分别精密量取各对照品贮备液适量置于20 ml量瓶中，加50%甲醇定容稀释，摇匀，即得浓度为474.00、47.00、28.75、54.50、254.00、59.60、39.20 μg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备三黄洗剂40 ℃加热超声20 min，10 000 r/min离心10 min（离心半径为5 cm），精密量取上清液20 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备按三黄洗剂处方配比分别称取缺大黄、黄柏、黄芩与苦参的阴性样品4份，根据三黄洗剂工艺方法提取，按“2.2.2”项下同法制备阴性样品溶液。

2.3 指纹图谱的建立与相似度分析

2.3.1 精密度试验取三黄洗剂（S2），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件连续进样6次，记录色谱图，以22号峰（黄芩素）为参照峰，24个共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD值分别小于2.26%和0.12%，仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验取三黄洗剂（S2），按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.1”项下条件进样测定，记录色谱图，以22号峰（黄芩素）为参照峰，24个共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD值分别小于2.10%和0.52%，该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验取三黄洗剂（S2），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，室温下于0、2、4、8、12、16、24 h按“2.1”项下条件进样测定，记录色谱图，以22号峰（黄芩素）为参照峰，24个共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD值分别小于2.72%和0.37%，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4 指纹图谱的建立及相似度分析取10批三黄洗剂样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定，记录色谱图，将10批图谱数据导入中药色谱指纹谱图相似度评价系统（2012版）软件进行分析评价，以S2为参照图谱，采用中位数法，时间窗为0.1 min，多点校正和Mark峰匹配后生成对照图谱（R），三黄洗剂的HPLC叠加图谱与对照图谱分别见图1～2。10批样品共标定出24个共有峰（280nm），10批样品与对照图谱相似度计算结果分别为0.987、0.999、0.998、0.998、0.980、1.000、0.999、0.999、0.999、0.998，相似度均＞0.987，各批次之间相似度良好。

2.3.5 共有峰指认与归属分别取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液按“2.1”项下条件进样测定，记录色谱图，将样品溶液各色谱峰的保留时间、紫外吸收光谱图与混合对照品溶液进行比对，指认出4、17、19、20、22、23、24号峰分别为没食子酸、药根碱、黄芩苷、小檗碱、黄芩素、汉黄芩素、大黄素，见图3。没食子酸、大黄素来自大黄，药根碱、小檗碱来自黄柏，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素来自黄芩。

2.4 化学计量学分析

2.4.1 聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）将10批三黄洗剂24个共有峰的峰面积结果导入SPSS 26.0统计学软件中，采用组间联接、平方欧式距离法进行系统聚类分析，结果见图4。当平方欧氏距离为8时，10批次样品可分为三大类，其中S3、S10、S8、S6、S7、S2为第1类，S4、S9、S1为第2类，S5为第3类。

2.4.2 主成分分析（principal component analysis，PCA）以10批三黄洗剂24个共有峰的峰面积为变量，导入SIMCA 14.1软件中进行无监督模式PCA处理，结果见图5。观察样品之间的离散和聚集趋势发现，PCA结果与HCA结果一致，进一步验证了HCA的结果。

2.4.3 正交-偏最小二乘法判别分析（orthogonal partialleastsquaresdiscriminantanalysis，OPLS-DA）为探寻引起不同批次三黄洗剂药材质量差异的标志成分，将10批三黄洗剂24个共有峰的峰面积数据导入SIMCA 14.1软件中，进行监督模式下的OPLS-DA分析，建立模型，R2X=0.827，R2Y=0.882，Q2=0.708，表明所建立的模型稳定可靠，具有较好的预测能力；其分类结情况与HCA、PCA一致，进一步验证分析结果的可靠性。见图6。

为防止数据出现过拟合现象而影响分析结果的准确性，利用200次置换试验进行检验，R2=（0.0，0.207），Q2=（0.0，-0.647），结果表明模型未出现过度拟合的情况，所构建的OPLS-DA模型可用于判别10批三黄洗剂质量成分的差异，可进行进一步分析。见图7。

以投影变量重要性（variable importance for the projection，VIP）＞1为条件筛选差异化合物，24个成分中筛选出峰12、峰4（没食子酸）、峰21、峰22（黄芩素）共4个差异成分，提示这4个成分是引起不同批次三黄洗剂之间主要差异标志物。见图8。

2.5 三黄洗剂中7个成分含量测定

2.5.1 线性关系考察分别取“2.2.1”项下的混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、2.5、4.0、5.0 ml置于5 ml量瓶中，用50%甲醇定容稀释制成一系列梯度浓度的溶液，按“2.1”项下条件进样测定，记录峰面积，以质量浓度为横坐标（X），对应的色谱峰面积为纵坐标（Y），绘制线性回归方程，结果见表1。

2.5.2 精密度考察取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，按“2.1”项下条件连续进样6次，记录三黄洗剂中7个成分峰面积，计算各成分精密度RSD值，结果显示，RSD值均小于1.10%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性考察取三黄洗剂（S2），按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，于室温下放置0、2、4、8、12、24 h后，按“2.1”项下条件进样测定，得到三黄洗剂中7个成分的峰面积，计算各成分的RSD值，结果显示，RSD值均小于2.09%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.4 重复性考察取三黄洗剂（S2），按“2.2.1”项下方法平行制备6份，按“2.1”项下条件进样测定，记录峰面积，计算各成分含量的RSD值，结果显示，三黄洗剂中7个成分的RSD值均小于1.26%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验取三黄洗剂（S2）6份，每份约10 ml，精密称定，按照样品已有含量近似1∶1的比例加入7个对照品溶液，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定，并计算加样回收率，结果见表2。

2.5.6 样品含量测定取10批三黄洗剂样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定，记录峰面积，计算三黄洗剂中7个成分含量，结果显示，没食子酸、黄芩素等成分波动显著。见表3。

3 讨论

3.1 提取条件

本研究考察了不同提取溶剂（80%甲醇、甲醇、75%乙醇）的提取效果，发现采用甲醇的提取率更高，故选取甲醇作为提取溶剂。本研究对比了涡旋振荡与加热超声（20、30、40 ℃）提取方式，发现40 ℃超声20 min所测成分的分离度与色谱峰峰型更好，故选择加热超声提取。综合考虑，最终确定供试品溶液制备方法。

3.2 色谱条件

经过二极管阵列检测器检测，发现波长在280 nm处，色谱峰最多，符合文献描述关于黄芩苷等目标成分的最大吸收波长，兼顾了生物碱与黄酮类物质共检出，故选取280 nm为检测波长[2-4]。流动相体系方面先后考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水，发现在乙腈-0.2%磷酸水流动相体系中，基线稳定，色谱峰峰型尖锐，分离度均＞1.5，符合《中华人民共和国药典》2020版要求。经过对比，在0～5 min选择流速0.8 ml/min时，色谱峰峰型稳定，有效减少了肩峰等色谱峰异常。该色谱条件方法稳定，有效保证了色谱峰信息量最大化。

3.3 指标成分选择

在中药复方制剂的质量控制中，科学合理地选择指标性成分是确保制剂有效性、安全性和稳定性的关键[5]。基于中药质量标志物（Q-Marker）的“五原则”——质量传递与溯源、特有性、有效性、可测性及复方配伍适应性[6]；本研究中选取没食子酸、小檗碱、药根碱、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和大黄素作为指标成分，以全面反映制剂的物质基础和质量特征。没食子酸作为大黄中鞣质类成分的代表，具有显著的抗氧化和抗炎作用，能有效抑制皮肤炎症反应[7-8]；大黄素属于羟基蒽醌衍生物，是泻下和抗菌活性的核心物质，现代药理研究表明，其对金黄色葡萄球菌等常见皮肤病原菌有强效抑制作用[9]。二者共同体现大黄“清热解毒”的功效，且含量稳定、易于检测，符合特有性和可测性原则，同时通过OPLS-DA分析发现，没食子酸在批次间呈现显著含量差异（VIP＞2.6），表明其可作为制剂工艺稳定性的敏感标志物。黄芩苷作为黄芩的特征性成分，具有广谱抗菌、抗病毒和免疫调节作用[10-12]；黄芩素和汉黄芩素属于黄酮苷元，能显著抑制组胺释放和炎症因子表达，缓解皮肤瘙痒和红肿，这些成分与复方“燥湿止痒”的主治功效相契合，符合有效性和配伍适应性原则[13-15]。黄柏中的小檗碱具有显著的抗菌活性，能有效穿透角质层，在表皮层维持治疗浓度直接作用于皮肤感染病灶[16-17]；药根碱则增强免疫调节功能，协同提升制剂的整体疗效，二者在黄柏中特有性强，含量测定方法稳定可靠[18]。苦参虽未直接指定单一成分，但其苦参碱类成分通过复方配伍间接支持整体功效，确保质量传递的完整性。最终，所选7种成分覆盖了各药味的核心活性物质，通过HPLC法可实现同步测定，为三黄洗剂的质量评价提供了科学、全面的依据。

综上所述，本研究建立的方法操作简便、结果准确、重复性好，可用于三黄洗剂的质量控制。但受限于青海高原地区制剂生产规模及留存样本数量，本研究共纳入10批样品，今后需增加样本量予以进一步验证。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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【作者机构】	¹青海大学医学院中医系； ²青海省中医院疮疡皮肤科
【分类号】	R917
【基金】	青海省中（藏）医药科研课题项目（Z2025001）。

三黄洗剂HPLC指纹图谱、化学计量学及多指标成分含量测定研究

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