衰老是人类生命周期中不可避免的生物学过程。中国人口老龄化问题日趋严峻，国家老龄事业发展公报显示，截至2024年12月，全国60岁及以上老年人口为3.3亿，占总人口的22.0%。衰老驱动的营养感应失调、慢性炎症等均与年龄相关脂质代谢疾病密切相关[1]。衰老过程中，肝脏易表现出进行性脂质代谢紊乱[2]。如何调控衰老中的脂质代谢稳态已成为医学领域备受关注的重要议题。AMPK/mTOR为细胞感知营养物质状态的关键因子，两者分别抑制脂肪酸合成与分解，被视作营养代谢中的阴阳关系[3]。衰老过程中的脂质代谢紊乱属阴阳失衡、本虚标实[4]。艾灸疗法为历代医家保健延衰的重要手段。关元穴乃阴阳交关之处，艾灸关元穴具有调和阴阳、健体益寿，纠正脂质代谢的功效[5]。本研究通过观察艾灸关元穴对衰老小鼠肝脏脂质代谢和衰老标志物，以及对AMPK/mTOR的调节作用，探究艾灸的影响机制。

1 对象与方法

1.1 实验动物

本研究选用24只SPF级18月龄C57BL/6J自然衰老雌性小鼠和8只相同遗传背景的6月龄青年雌性小鼠。18月龄小鼠体重为26～29 g，6月龄小鼠体重为24～27 g；小鼠均购自杭州启真实验动物科技有限公司，实验动物合格证号：20240228Abzz0105000895，实验动物使用许可证号：SCXK（京）2020-0013，实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0004。饲养环境温度维持在（22±2）℃，相对湿度（55±5）%，光照（08:00～20:00时）和黑暗（20:00～次日08:00时）交替。本研究经北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会批准（BUCM-2024022303-1070）。

1.2 主要仪器与试剂

光学显微镜（型号：BX51）购自日本Olympus公司；高通量组织研磨器（型号：SCIENTZ-48L）购自宁波新芝生物科技股份有限公司；电子天平（型号：京制00000246号）购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；显影仪（型号：Image Quant LAS 500）购自美国Cytiva公司。

艾绒（货号：JAR-50）购自北京健力园医疗器械有限公司；衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）试剂盒：白细胞介素（interleukin，IL）-1α、IL-1β（货号：YJ106733、YJ106732）购自上海酶联生物有限公司；甘油三酯（triglycerides，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）测定试剂盒（货号：A113-1-1、A112-1-1、A110-1-1、A111-1-1）购自南京建成生物工程研究所有限公司；RT-qPCR反应试剂盒（货号：AG11606）购自艾科瑞生物科技有限公司；mTOR、AMPK、ULK1多克隆兔一抗（货号：F0169、A5149、A5149）购自Selleck中国有限公司。

1.3 实验分组及处理

小鼠适应性喂养1周，对小鼠体重和日进食量进行称重。1周后按照随机数字表法将18月龄小鼠分为老年组、艾灸组、阳性组，每组8只。6月龄小鼠作为空白组。各组处理方法：

①第2～3周。老年组、艾灸组及空白组小鼠自由饮食饮水，无其他干预。阳性组适应性喂养时平均进食量约3 g/d，第2周限制饮食减少平均进食量的10%（约2.7 g/d），第3周饮食限制20%（约2.4 g/d）[6-8]。

②第4～11周。各组小鼠均进行关元穴区剃毛，面积约1.5 cm×1.5 cm。关元穴参考实验动物学常用动物穴位定位方法取穴，位于小鼠脐下约10 mm处[9]。老年组与空白组小鼠均自由饮食饮水，单手抓取固定小鼠（不艾灸），3 min/d，每周6次，共8周。艾灸组小鼠自由饮食饮水，单手抓取固定小鼠，进行麦粒灸干预；将艾炷置于关元穴，手持线香点燃艾炷，即将燃尽时用镊子取下艾灰；每壮约5 mg，5壮/d，每周6天，共8周[10-11]。阳性组小鼠限制饮食减少平均进食量的30%（约2.1 g/d），单手抓取固定小鼠（不艾灸），3 min/d，每周6天，共8周。

③第12周。处死各组小鼠并进行指标检测。

1.4 样本处理

末次干预结束后，禁食1晚，称重，异氟烷麻醉。摘取小鼠眼球取血后脱颈处死，血浆静置后以3 000 r/min离心10 min，（离心半径为10 cm），在-80 ℃冰箱冻存。取部分肝组织液氮速冻后-80 ℃保存，部分肝组织多聚甲醛固定。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 肝脏指数 肝脏指数（%）=肝脏湿重（g）/小鼠体重（g）×100%。

1.5.2 血清血脂水平 测定各组血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平。

1.5.3 HE染色 肝组织包埋，切片，脱蜡，苏木精染液染色后，在显微镜下观察肝细胞病理形态学变化。

1.5.4 油红O染色 肝组织包埋后于-20 ℃冷冻切片，显微镜下观察肝细胞内脂滴分布情况，并使用Image J软件进行定量分析。

1.5.5 肝组织IL-1α、IL-1β 水平 取小鼠肝组织进行匀浆并离心（1 400 r/min离心10 min，离心半径为10 cm），测定肝组织匀浆中IL-1α、IL-1β 水平。

1.5.6 RT-qPCR法测定mTOR、AMPK、ULK1 mRNA表达从肝组织中提取总RNA，使用一步法RT-qPCR试剂盒配制体系，在Bio-Rad CFX96实时荧光定量系统上进行，反应体系总体积为20 μl，包括SYBR 10 μl，Mix 0.8 μl，正、反向引物各0.8 μl，RNA样本80 ng（如果RNA浓度为40.0 ng/μl，则每反应孔应加入2.0 μl），加入无酶水补齐至20 μl。42 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，95℃退火5s、60℃延伸30s，循环40次。用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5.7 Western blot法检测mTOR、AMPK、ULK1蛋白表达 从肝组织中提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度。煮沸蛋白，进行电泳及转膜。5%脱脂奶粉室温孵育2 h，加入一抗mTOR（1∶2 000）、AMPK（1∶2 000）、ULK1（1∶2 000），4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次，二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，进行曝光。以β-actin的灰度值为参考，使用Image J软件分析数据，计算蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般状况

空白组小鼠毛色光泽，活动灵敏，精神活跃；老年组小鼠毛色稀疏，精神稍差，动作迟缓；艾灸组小鼠的毛色光泽度、精神状态好于老年组。

2.2 各组小鼠肝脏指数比较

与空白组比较，老年组肝脏指数升高（P＜0.05）；与老年组比较，艾灸组肝脏指数降低（P＜0.01）。见图1。

图1 各组小鼠肝脏指数比较（n=8）

与空白组比较，aP＜0.05；与老年组比较，bbP＜0.01。

2.3 各组小鼠肝组织病理形态

HE染色显示，空白组小鼠肝组织条理清晰排列规律，肝细胞形态基本一致，无明显畸形，胞浆内少量脂滴空泡。与空白组比较，老年组小鼠肝细胞排列紊乱，肿胀变形，出现肝细胞点状坏死和炎性浸润，可见较多气球状脂肪空泡。与老年组比较，艾灸组小鼠肝组织变形减轻，脂滴沉积减少。见图2。

图2 各组小鼠肝组织HE染色

A：空白组；B：老年组；C：艾灸组；D：阳性组。

油红O染色显示，空白组小鼠有少量淡红色脂滴分布，老年组显示大泡样鲜红色脂滴蓄积，艾灸组脂滴蓄积减小。与空白组比较，老年组脂滴相对面积升高（P＜0.01）；与老年组比较，艾灸组脂滴相对面积降低（P＜0.01）。见图3。

图3 各组小鼠油红O染色及脂滴相对面积比较

A：空白组；B：老年组；C：艾灸组；D：阳性组；E：各组小鼠脂滴相对面积比较（n=3）。与空白组比较，aaP＜0.01；与老年组比较，bbP＜0.01。

2.4 各组小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比较

与空白组比较，老年组血清TG、TC、LDL-C水平升高，血清HDL-C水平降低（P＜0.01）；与老年组比较，艾灸组血清TG、TC、LDL-C水平降低，血清HDL-C水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。见图4。

图4 各组小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比较（n=8）

与空白组比较，aaP＜0.01；与老年组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01。TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇。

2.5 各组小鼠肝组织IL-1α、IL-1β 水平比较

与空白组比较，老年组肝组织IL-1α、IL-1β 水平升高（P＜0.01）；与老年组比较，艾灸组肝组织IL-1α、IL-1β 水平降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图5。

图5 各组小鼠肝组织IL-1α、IL-1β 水平比较（n=8）

与空白组比较，aaP＜0.01；与老年组比较，bbP＜0.01。IL：白细胞介素。

2.6 各组小鼠肝组织mTOR、AMPK、ULK1 mRNA表达比较

与空白组比较，老年组肝组织mTOR mRNA表达升高，AMPK、ULK1 mRNA表达降低（P＜0.05或P＜0.01）；与老年组比较，艾灸组mTOR mRNA表达降低，AMPK、ULK1 mRNA表达升高（P＜0.05或P＜0.01）。见图6。

图6 各组小鼠肝组织mTOR、AMPK、ULK1 mRNA表达比较（n=3）

与空白组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01；与老年组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01。

2.7 各组小鼠肝组织mTOR、AMPK、ULK1蛋白表达比较

与空白组比较，老年组肝组织mTOR蛋白表达升高，AMPK、ULK1蛋白表达降低（P＜0.05或P＜0.01）；与老年组比较，mTOR蛋白表达降低，AMPK、ULK1蛋白表达升高（P＜0.05或P＜0.01）。见图7。

图7 各组小鼠肝组织mTOR、AMPK、ULK1蛋白表达比较

A：蛋白条带图；B：各组小鼠肝组织mTOR蛋白表达比较（n=3）；C：各组小鼠肝组织AMPK蛋白表达比较（n=3）；D：各组小鼠肝组织ULK1蛋白表达比较（n=3）。与空白组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01；与老年组比较bP＜0.05，bbP＜0.01。

3 讨论

中医理论认为衰老的病机包含脏腑虚损、阴阳失衡、痰瘀促衰等。阴阳失衡与衰老及其导致的脂质代谢紊乱密切相关。年老体衰者元阳生化乏源，水谷输布无常，膏不化正，继而百病丛生[10]。艾灸在助阳补虚、延衰益寿方面发挥功效。关元穴为元阴元阳交关之处，是保健强身长寿要穴[11]。关元穴意为下焦水湿阴浊，在此处被阻隔不可上行侵扰元阳，因此艾灸关元穴有调和阴阳、改善衰老诱发的膏脂化生输布障碍的功效。

本研究中阳性组为能量限制，指在避免营养不良前提下减少每天摄入总热量的15%～40%，是公认减少疾病发生率、延长寿命的干预措施之一，30%的能量限制可以使小鼠寿命延长10%[12]。本研究以肝组织SASP评价艾灸延衰益寿效应，以血脂水平与油红O染色、HE染色等观察衰老小鼠肝脏脂滴形态学，评价艾灸改善脂质代谢；检测AMPK、mTOR、ULK1营养能量感应相关蛋白，探究艾灸作用机制。

随着年龄增长，血浆中饱和脂肪酸及多不饱和脂肪酸水平均呈上升趋势，整体脂质代谢紊乱导致非脂肪组织出现异位脂质积聚[13]。TG、TC和LDL-C等均可反映血浆和肝脏内脂质代谢状态。SASP是细胞衰老过程中分泌的促炎因子、趋化因子等。IL-1α 和IL-1β 为SASP中常见因子，过量分泌干扰肝脏内环境，加剧代谢性疾病进展，促进衰老程序[14]。AMPK和mTOR是感知细胞内营养物质水平、调节代谢平衡的中枢激酶复合体。AMPK抑制脂质合成代谢而mTOR促进合成代谢，两者共同维持细胞内的代谢稳态[15]。ULK1复合体是连接上游营养能量感受器与下游自噬体形成的桥梁，影响细胞内脂质分解[16]。

综上所述，艾灸能够改善自然衰老小鼠的肝脏脂质代谢异常和衰老标志物的机制，可能与激活AMPK/mTOR通路、调节肝脏营养能量感应有关。本研究为艾灸在预防和治疗与脂代谢异常相关的衰老性疾病方面提供了实验依据和理论支持。未来可明确艾灸活性成分与作用靶点，验证单一成分对脂质代谢和衰老标志物的影响。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1]KROEMERG，MAIERAB，CUERVOAM，etal.Fromgeroscience to precision geromedicine：Understanding and managing aging[J].Cell，2025，188（8）：2043-2062.

[2]SONG R，HU M，QIN X，et al.The Roles of Lipid Metabolism in the Pathogenesis of Chronic Diseases in the Elderly [J].Nutrients，2023，15（15）：3433.

[3]CHEN S，LUO S，ZOU B，et al.Magnesium Supplementation Stimulates Autophagy to Reduce Lipid Accumulation in Hepatocytes via the AMPK/mTOR Pathway [J].Biol Trace Elem Res，2023，201（7）：3311-3322.

[4]宋玮，张钟艺，邱海荣，等.从“膏脂转输障碍”探析茱萸丸治疗动脉粥样硬化的思路[J].中国实验方剂学杂志，2025，31（13）：54-61.

[5]陈方方，杨丹辰，杨雨婷，等.艾灸关元穴对自然衰老小鼠行为学、肠道菌群及沉默信息调节因子1相关通路蛋白的影响[J].环球中医药，2025，18（6）：1116-1123.

[6]王鑫宇，刘滢，隋昕，等.短期饮食限制对小鼠肝脏胰岛素信号通路与线粒体的影响[J].中国兽医学报，2024，44（4）：719-727.

[7]褚光辉，宋美慧，周正，等.啮齿类动物饮食限制的研究进展[J].生理科学进展，2020，51（5）：395-401.

[8]VICTORIAAR，RIJOFF，IZUMOM，et al.Circadianalignment of early onset caloric restriction promotes longevity in male C57BL/6J mice[J].Science，2022，376（6598）：1192-1202.

[9]China Association of Acupuncture and Moxibustion.实验动物常用穴位名称与定位第3部分：小鼠[J].世界针灸杂志（英文版），2025，35（2）：160-162.

[10]崔梦凡，马秉哲，殷智洋，等.关元穴麦粒灸对自然衰老小鼠睾酮低下及下丘脑-垂体-性腺轴的调节作用研究[J].中华男科学杂志，2025，31（2）：157-164.

[11]王群，陈丝，宋囡，等.基于“行津液、运膏脂”理论探讨泽泻汤对高脂血症大鼠PI3K/AKT/FoxO1/AQP9途径的影响及分子机制[J].时珍国医国药，2024，35（3）：563-567.

[12]李舒涵，张婷，韩丽，等.艾灸在器官水平抗衰老机制的研究进展[J].中华中医药杂志，2024，39（10）：5390-5393.

[13]NASSAR K，EL-MEKAWEY D，ELMASRY A E，et al.The significance of caloric restriction mimetics as anti-aging drugs[J].BiochemBiophysResCommun，2024，692：149354.

[14]ADEMOWO O S，WENK M R，MAIER A B.Advances in clinical application of lipidomics in healthy ageing and healthy longevity medicine[J].Ageing Res Rev，2024，100：102432.

[15]徐小雯，徐钒锋，朱炎贞，等.基于AMPK/mTOR/ULK1信号通路探讨电针对脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经功能的影响[J].中国针灸，2024，44（12）：1418-1425.

[16]KEZER C A，KUSZTOS V，KASSMEYER B，et al.Impact of sociodemographic disparities on sarcopenia，telomere length，and mortality in patients with liver disease in the US population[J].BMC Gastroenterol，2024，24（1）：404.

Study on the effect of moxibustion on liver lipid metabolism in natural aging model mice

YANG Danchen1 CHEN Fangfang1 WU Jiawei2 YANG Yuting1 ZHANG Yuan2 WANG Yifan1 HAN Li1 ZHAO Baixiao2

1.School of Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.School of Acupuncture and Tuina,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China

[Abstract] Objective To investigate the effect of moxibustion on lipid metabolism in the liver of natural aging mice.Methods Twenty-four 18-month-old natural aging female C57BL/6J mice were selected and divided into elderly group,moxibustion group,and positive group according to the random number table method,with eight mice in each group;and eight 6-month-old young female mice were used as blank group.No special intervention was given to the blank group and elderly group;the moxibustion group received five moxibustion sessions with wheat grains every day,six times a week,for a total of eight weeks;and the positive group was subject to dietary restriction for eight weeks.The liver morphology was observed by HE staining,and the lipid droplet accumulation level was observed by oil red O staining;the levels of serum triglycerides (TG),total cholesterol (TC),low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C),and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C)of each group were compared;the contents of interleukin (IL)-1α and IL-1β in liver tissues of each group were compared;and the expressions of mTOR,AMPK,and ULK1 mRNA and protein were detected by RT-qPCR and Western blot.Results Compared with the blank group,pathological changes such as inflammatory infiltration,steatosis and increased relative area of lipid droplets occurred in hepatocytes of the elderly group;compared with the elderly group,the moxibustion group showed varying degrees of alleviation.Compared with the blank group,the liver index and the relative area of lipid droplets in the elderly group increased (P ＜0.05);compared with the elderly group,the liver index and relative area of lipid droplets in the moxibustion group decreased (P ＜0.01).Compared with the blank group,the levels of serum TG,TC,and LDL-C in the elderly group increased,while the level of serum HDL-C decreased (P＜0.01);compared with the elderly group,the levels of serum TG,TC,and LDL-C in the moxibustion group decreased,while the level of serum HDL-C increased (P＜0.05 or P＜0.01).Compared with the blank group,the levels of IL-1α and IL-1β in liver tissues of the elderly group increased(P＜0.01);compared with the elderly group,the levels of IL-1α and IL-1β in the liver tissues of the moxibustion group decreased (P＜0.01).Compared with the blank group,the expressions of mTOR mRNA and protein in liver tissues of the elderly group increased,while the expressions of AMPK and ULK1 mRNA and protein decreased (P＜0.05 or P＜0.01);compared with the elderly group,the expressions of mTOR mRNA and protein in liver tissues of moxibustion group decreased,while the expressions of AMPK and ULK1 mRNA and protein increased (P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion Moxibustion can improve liver lipid metabolism and aging marker levels,which may be related to the regulation of the AMPK/mTOR/ULK1 signaling pathway.

[Key words] Natural aging;Moxibustion;Lipid metabolism;Cellular nutrient sensing

[中图分类号] R212.7；R245.81；R247.9

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）12（a）-0001-06

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.34.01

[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（82174475）。

[作者简介] 杨丹辰（2000.11-），女，北京中医药大学中医学院2023级中医养生康复学专业在读硕士研究生，主要从事针灸在养生康复中的应用研究工作。

[通讯作者] 韩丽（1981.4-），女，博士，教授，主要从事针灸在养生康复中的应用研究工作。

（收稿日期：2025-07-10）

（修回日期：2025-09-25）