二仙温阳散为广东省中山市博爱医院生殖科、中医科和药学部经多年临床实践共同研发的外敷制剂，是中山市博爱医院生殖中心治疗不孕症的中医特色疗方，由淫羊藿、制仙茅、干姜、艾叶、桂枝和小茴香6味药物组成，具温补肾阳、调理冲任之效，有促排卵助孕之功，临床适用于女性生育力下降属脾肾阳虚者。方中淫羊藿既内壮肾阳而强筋健骨、又外散风湿而通痹止痛[1-2]；制仙茅既善补命门而兴阳道、又除寒湿而暖腰膝[3]。二药合用，相得益彰，温肾壮阳之力增强，共为君药，为“二仙”方名由来[4-5]。干姜善温脾肾暖宫、桂枝擅通阳行血瘀、艾叶长温经止血安胎、小茴香专温肾疏肝止痛，四者均性温，形成“温肾-暖宫-通络”三位一体效应。全方组成合理，六药协同配伍，共奏温阳助孕之功。

该方临床用量大、疗效好，深受医师和患者认可，但鲜有质控标准保证临床用药，存在成分含量波动风险。为进一步规范和提高药品质量，本研究整合显微鉴定法鉴别艾叶、桂枝、小茴香粉末特征；薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）定性鉴别制仙茅与干姜；高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）定量测定质控指标成分淫羊藿苷。使方中6味药均得到系统检验，不仅更全面科学地验证该制剂的有效性与安全性，更为其质量标准的制订及其他剂型的深入研发提供实验支撑。

1 仪器与试药

1.1 仪器

正置显微镜（ECLIPSE EI，日本尼康株式会社）；电子分析天平（BSA224S Max 220g，0.1 mg，德国赛多利斯公司）；高效液相色谱仪（1260InfinityⅡ型，美国安捷伦科技有限公司）；电热恒温水浴锅（WS2-133-75，汕头市广播仪器厂）；超声清洗仪（HX/US-0011-UM，江苏华系医疗器械有限公司）；色谱柱（ZORBAX Eclipse Plus C18，4.6 mm×150 mm，5 μm，美国安捷伦公司)；硅胶G板(青岛基亿达硅胶试剂有限公司)。

1.2 试药

对照品：淫羊藿苷（批号：110737-202418，纯度：98.4%）、仙茅对照药材（批号：121505-202305）、干姜对照药材（批号：120942-201309）均购于中国食品药品检定研究所；供试品二仙温阳散（批号：20241220、20250107、20250110），包括淫羊藿、制仙茅、干姜、小茴香、艾叶、桂枝均购于国药集团冯了性（佛山）有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯；水为自制超纯水；其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 显微定性鉴别

取少量二仙温阳散供试品粉末置于载玻片上，滴加水合氯醛试液，加热透化后滴甘油，加盖玻片制成显微鉴定样本，置于显微镜下观察。

艾叶：观察到两种非腺毛（T形、单列性）和腺毛[6]。T形非腺毛顶端细胞长弯，具不等长两臂，柄由2～4个细胞构成（图1A）；单列性非腺毛由3～5个细胞组成，顶端细胞极细长扭曲，常断落（图1B）；腺毛鞋底状，由4或6个细胞相对叠合而成（图1C）。

图1 显微特征（400×）

A：艾叶T形非腺毛；B：艾叶单列性非腺毛；C：艾叶鞋底形腺毛；D：桂枝石细胞；E：桂枝具缘纹孔导管；F：小茴香破碎油管。

桂枝：观察到石细胞、具缘纹孔导管、韧皮维管束等[7]。石细胞细胞壁一面菲薄、三面增厚（图1D）；导管为具缘纹孔导管（图1E）。

小茴香：观察到红棕色破碎的油管碎片，以及糊粉粒、草酸钙簇晶等（图1F）。

艾叶、桂枝、小茴香显微特征均符合2020年版《中华人民共和国药典》[8]记载。

2.2 TLC定性鉴别

2.2.1 干姜的鉴别 称取二仙温阳散粉末5 g，加20 ml乙酸乙酯，超声处理10 min后滤过，滤液挥干后用乙酸乙酯1 ml复溶，即得供试品溶液。阴性对照溶液同法制备，其处方比例与原方一致但不含干姜成分。另称取干姜对照药材1 g，加4 ml乙酸乙酯，同法制成对照药材溶液[8]。依TLC法试验（通则0502），各点样6 μl于硅胶G板，以石油醚（60～90 ℃）-三氯甲烷-乙酸乙酯（2∶1∶1）展开，晾干后用1%香草醛的10%硫酸乙醇溶液显色，105 ℃加热，日光下检视专属性[9]。结果显示，供试品色谱中在对照品相应位置出现清晰蓝紫色斑点，分离度佳，形状大小一致，阴性无干扰，证实其专属性符合要求。进一步考察不同时间（图2A～B）、不同实验员（图2B～C）、不同薄层板批次（图2A～C）等条件，结果均稳定。提示该方法专属性强，耐用性、重现性良好。

图2 干姜TLC鉴别

A、B为同一实验员在不同时间的实验结果；B、C为不同实验员在同一时间的实验结果；A、B、C为三批次薄层板的试验结果。1～3：供试品；4：阴性对照品；5：干姜对照药材。TLC：薄层色谱法。

2.2.2 制仙茅的鉴别 称取二仙温阳散粉末5 g，加50 ml乙醇超声处理30 min，滤过，滤液挥干后用乙醇1 ml复溶，即得供试品溶液。阴性对照溶液同法制备，其处方比例与原方一致但不含仙茅成分。另称取2 g仙茅对照药材，加20 ml乙醇，同法制备仙茅对照药材溶液[8]。依TLC试验（通则0502），于硅胶G板各点样4 μl供试品、阴性对照溶液和6 μl对照品溶液，以二氯甲烷-丙酮-甲酸（5∶2∶1）展开，晾干后用2%香草醛的10%硫酸乙醇溶液显色，105 ℃加热，日光下检视专属性[10]。结果显示，供试品色谱在对照品相应位置上显清晰粉红色斑点，分离度好，形状大小一致，阴性无干扰，证实其专属性符合要求。进一步考察不同时间（图3A～B）、不同实验员（图3B～C）、不同薄层板批次（图3A～C）等条件，结果均稳定。提示该方法专属性强，耐用性、重现性良好。

图3 仙茅TLC鉴别

A、B：同一实验员在不同时间的实验结果；B、C：不同实验员在同一时间的实验结果，A、B、C：3批次薄层板的试验结果。1～3：供试品；4：阴性对照品；5：仙茅对照药材。TLC：薄层色谱法。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件 采用ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱（4.6mm×150 mm，5 μm），维持270 nm检测波长和30 ℃柱温，以流动相（水-乙腈，23∶77）洗脱，流速1.0 ml/min，进样体积10 μl。以淫羊藿苷对应色谱峰为计算基准，理论塔板数不低于8 000。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密称定二仙温阳散2.5 g，加入12.5 ml乙醇，超声提取1 h，抽滤得到滤液，水浴挥干，残渣加入浓度为50%（V/V）的稀乙醇分次溶解，转移至5 ml容量瓶定容，摇匀，即得供试品溶液。

2.3.3 对照品溶液的制备 精密称定淫羊藿苷对照品10 mg，加入甲醇分次溶解，定容至50 ml，摇匀，配成200 μg/ml的对照品储备溶液。

2.3.4 阴性供试品溶液的制备 称取缺淫羊藿的二仙温阳散2.5 g，依据“2.3.2”项操作流程制备不含淫羊藿的阴性对照品溶液。

2.3.5 专属性试验 依据“2.3.1”项色谱条件，各进样10 μl淫羊藿苷对照品、供试品、阴性样品溶液。结果显示，供试品与对照品在相同保留时间1呈现特征吸收峰，主峰纯度高，峰形对称且与相邻杂质峰有效分离，阴性样品无干扰峰。提示该方法专属性良好。见图4。

图4 专属性试验结果

A：淫羊藿苷对照品；B：供试品；C：阴性对照品。1：淫羊藿苷。

2.3.6 线性范围考察 自“2.3.3”项对照品储备液中，精密移取7份至10 ml容量瓶，甲醇定容后分别生成浓度200、170、140、120、100、80、50 μg/ml的序列对 照品。依据“2.3.1”项色谱条件，分别记录峰面积。以对照品浓度为X轴、以目标峰的峰面积为Y轴绘制标准曲线，得回归方程Y=17.098X+24.48，R2=0.999 3，表明淫羊藿苷在50～200 μg/ml浓度范围内与峰面积线性关系良好。

2.3.7 精密度试验 依据“2.3.1”项色谱条件，取浓度120 μg/ml的对照品溶液经6次平行进样分析，检测淫羊藿苷峰面积。统计结果得峰面积的RSD值为0.85%，提示仪器精密度良好，符合实验检测要求。

2.3.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液（批号：241220），依据“2.3.1”项色谱条件分别在6个时间点（0、2、4、8、12、24 h）平行进样分析，测定峰面积，结果显示不同时间点的峰面积RSD值为1.02%，提示该方法在24 h内稳定性良好，满足定量分析方法学要求。

2.3.9 重复性试验 取同一批样品（批号：241220）6份，按“2.3.2”项操作流程制备供试品溶液，依据“2.3.1”项色谱条件进样，记录峰面积，计算淫羊藿苷含量。经6次平行实验验证，淫羊藿苷含量的RSD值为1.39%，提示该方法重复性良好，满足批量样品检测需求。

2.3.10 加样回收率试验 取9份已知含量的同批次样品（批号：241220，浓度254.702 μg/g），每份1.25 g，精密称定，分别加入“2.3.3”项对照品储备液1.2、1.5、1.8 ml的低、中、高3个质量的对照品溶液，每组各3份，依据“2.3.2”项操作流程制备供试品溶液。逐一进样分析并测定每份含量，得到平均回收率为101.89%，RSD值为1.73%，符合方法学验证要求。见表1。

表1 加样回收试验结果

2.3.11 样品含量测定 取二仙温阳散3批，每批次各3份，按“2.3.2”项的流程制备样品溶液。以淫羊藿苷对照品为参照，按“2.3.1”项色谱条件进样平行测定，测得9份淫羊藿苷平均含量为253.14 μg/g，RSD值为1.55%，提示批次间及平行样间含量均一性良好。见表2。

表2 样品检测结果

3 讨论

医院自主研制中药复方的质量标准参差不齐，加强对中药复方的质量标准研究，有利于中药复方在临床治疗中更安全有效地发挥作用[11-12]。本研究建立的“显微-TLC-HPLC”联用分析方法，对全方六味药材展开研究，保证每种药材都得到鉴别或测定，可为二仙温阳散提供更全面充分的质量研究，弥补单一检验方法的局限性。

本研究针对二仙温阳散这一混合细粉，建立了适用于艾叶、桂枝、小茴香粉末的显微鉴定方法，不仅显微特征清晰可辨，且操作简便。具体操作中，加热透化样品环节需着重注意两点：①尽量减少气泡产生，确保样品透化充分；②严格把控透化时长，防止过度加热导致样品焦化，进而破坏其显微特征[13]。

本研究建立了具有良好专属性和重现性的鉴别干姜和制仙茅的方法。其中对仙茅的提取采用的是超声提取法，经平行对比实验验证，超声提取法得到的TLC斑点清晰度、分离度与2020年版《中华人民共和国药典》[8]中采取的加热回流提取法效果一致，且目标斑点大小略优，其简便、节能、省时的优势更适合医院制剂小批量、多批次的生产质控场景，能在保证鉴别效果的同时，降低日常检测的时间与能源成本，提升质量标准的实际应用价值。此外，预实验中还对不同时间、不同实验员、不同薄层板、不同展开系统比例和不同温湿度等试验条件进行考察，结果均无显著差异，提示该方法耐用性良好。

淫羊藿作为二仙温阳散的君药，其主要活性物质淫羊藿苷经现代研究表明，可调节女性激素水平、改善卵巢结构与功能，对肾阳虚型激素失调及不孕症有一定治疗作用，因此作为该方含量测定的指标成分[4,14-16]。HPLC实验中，按照2020年版《中华人民共和国药典》[8]的提取方法测得的淫羊藿苷峰高较低，不利于目标峰观察，故改进了样品制备方法，采用提取后浓缩再复溶的制备方式。另外，本研究还筛选了流动相不同极性对淫羊藿苷保留时间的影响，结果显示水与乙腈的比例对出峰时间影响显著，比例为22∶78时，出峰时间达50 min，耗时过长；比例为24∶76时出现拖尾，分离效果不佳。经反复改进流动相比例，以及调整不同波长、不同柱温等实验，不断优化条件，最终确定流动相比例以水-乙腈（23∶77）、波长270 nm、柱温30 ℃时淫羊藿苷峰形最理想，分离效果好。

从现行标准与研究基础来看，相较于淫羊藿苷相对成熟且简便的HPLC定量分析方法，仙茅苷的定量分析在复杂制剂基质中易受干扰，灵敏度、精密度及重复性仍存在一定提升空间。未来研究将针对这一问题从以下两个方向推进：①优化仙茅苷活性成分的提取与检测，排除制剂中其他成分干扰，建立稳定可靠的定量分析方法；②尝试探索指纹图谱结合一测多评等创新检测技术，通过淫羊藿苷与仙茅苷的相对校正因子，实现单指标定量同时控制两种君药成分，在降低成本的同时提升质控效率，以更全面地评价制剂质量[17]。

综上所述，本研究构建的质量控制方法操作便捷、灵敏精确、稳定性佳，在建立其质量标准的同时，可助力该处方多剂型转化与应用推广。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Research on quality standard of Erxian Wenyang Powder

CHEN Jiaxue1 CHEN Yanli1 LIANG Shimin1 DIAO Junfei1 YANG Xianna1 WANG Yue2

1.Department of Preparation,Boai Hospital of Zhongshan,Guangdong Province,Zhongshan 528400,China;2.College of Traditional Chinese Medicine,Guangdong Pharmaceutical University,Guangdong Province,Zhongshan 528400,China

[Abstract] Objective To determine the qualitative and quantitative detection methods for Erxian Wenyang Powder,establish its quality standards,and to provide scientific basis for standardizing its production process and evaluating its quality.Methods Microscopic identification was employed to analyze the powder characteristics of Artemisiae Argyi Folium,Cinnamomi Ramulus,and Foeniculi Fructus in Erxian Wenyang Powder.The qualitative identification of Curculiginis Rhizoma and Zingiberis Rhizoma was achieved through thin layer chromatography (TLC).The content of icariin,an active component in Erxian Wenyang Powder was determined by high performance liquid chromatography(HPLC).The ZORBAX Eclipse Plus C18 chromatography column (4.6 mm×150 mm,5 μm)was selected for elution using a water-acetonitrile(23∶77)mobile phase at a monitoring wavelength of 270 nm and a column temperature of 30℃,with a flow velocity of 1.0 ml/min.The methodological investigation was conducted.Results In microscopic examination,the distinctive characteristics of Artemisiae Argyi Folium (non-glandular and glandular hairs),Cinnamomi Ramulus (stone cells),and Foeniculi Fructus (Broken oil pipe) were distinctly observed.In TLC identification,the spectral spots of Curculiginis Rhizoma and Zingiberis Rhizoma were clear,and the negative was not interfered.The HPLC results indicated that icariin exhibited good linearity within the range of 50-200 μg/ml,with an average sample recovery of 101.89%and RSD of 1.73%.All methodological investigations meet the requirements.Conclusion The analytical method established in this study demonstrated good specificity,reproducibility,and sensitivity,effectively controlling the quality of Erxian Wenyang Powder.

[Key words] Erxian Wenyang Powder;Quality standard;Microscopic identification;Thin layer chromatography;High performance liquid chromatography

[中图分类号] R284.1

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）12（a）-0031-05

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.34.06

[基金项目] 广东省中山市医学科研项目（2024J015）。

（收稿日期：2025-08-03）

（修回日期：2025-09-17）