宫颈癌是女性生殖系统恶性肿瘤的常见类型，全球每年新发病例超过66万例，死亡病例超过34万例[1]。2024年我国新发宫颈癌100 390例，死亡34 731例，是女性生殖系统恶性肿瘤发病及死亡的首位原因[2]。因此，迫切需要深入研究宫颈癌的分子机制，以推动新的诊疗策略和预后改善。RECQL4是一种DNA解旋酶，能够通过激活DNA修复通路促进癌细胞存活，从而加速肝细胞癌、食管癌等恶性肿瘤进展[3]。OTUB2是一种去泛素化酶，能通过去泛素化作用稳定关键促癌分子，从而促进胶质母细胞瘤、卵巢癌等恶性肿瘤进展[4]。然而，关于宫颈癌组织中RECQL4、OTUB2表达的临床价值鲜见报道。本研究旨在探讨宫颈癌组织中RECQL4、OTUB2表达及其与病理参数和预后的相关性，以期为改善宫颈癌患者预后提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至2019年12月在保定市第一中心医院行手术治疗的宫颈癌患者143例，年龄30～76岁，平均（53.11±10.14）岁；HPV阳性135例，阴性8例；病理类型：鳞状细胞癌115例，腺癌28例；FIGO分期[5]：ⅠA～ⅠB1期90例、ⅠB2～ⅡB期53例；肿瘤直径＞2 cm 75例，≤2 cm 68例；分化程度：低分化54例，中、高分化89例；淋巴结转移48例。本研究中患者或家属自愿签署知情同意书。

纳入标准：①年龄＞18岁；②临床资料信息完整；③初次经病理诊断为宫颈癌[6]；④FIGO分期为Ⅰ～ⅡB期，并在保定市第一中心医院接受根治性子宫切除术和盆腔淋巴结切除术；⑤能接受随访。排除标准：①术前已接受其他抗肿瘤治疗；②妊娠期或哺乳期妇女；③有手术禁忌证；④合并其他恶性肿瘤；⑤院内死亡或失访；⑥合并急、慢性感染；⑦合并自身免疫性疾病；⑧合并心肝肾等重要脏器严重损害。本研究经保定市第一中心医院医学伦理委员会批准（快[2023]065号）。

1.2 研究方法

1.2.1 体内实验

1.2.1.1 免疫组织化学染色法 取部分石蜡包埋的宫颈癌组织及癌旁正常组织标本，连续切片4 μm，铺片于载玻片烘干，依次进行脱蜡、梯度酒精水化，抗原热修复、过氧化物酶封闭、封闭；随后加入RECQL4、OTUB2抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号：A25184、A24185，稀释比1∶100），4 ℃孵育过夜。次日加入HRP标记的二抗，37 ℃孵育30 min，常规DAB显色、苏木精复染、脱水、透明、封片。使用倒置显微镜（日本光学工业株式会社，型号：ECLIPSE Ts2）观察并拍照。阳性细胞比例×染色强度≥3分判定为阳性表达。阳性细胞比例评分：0分（≤5%）、1分（＞5%～25%）、2分（＞25%～50%）、3分（＞50%～75%）、4分（＞75%～100%）；染色强度评分：0分（无染色）、1分（淡黄色）、2分（棕黄色）、3分（棕褐色）[7]。

1.2.1.2 RT-qPCR法 液氮下研磨部分宫颈癌组织及癌旁正常组织标本，加入总RNA提取试剂（北京伊塔生物科技有限公司，货号：YT10622）提取组织总RNA，反转录为cDNA（试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司，货号：RP1105）。利用实时荧光定量扩增仪（西安天隆科技有限公司，型号：Gentier X3）和SYBR Green qPCR Mix试剂（江西江蓝纯生物试剂有限公司，货号：D7265-25ml）检测。反应体系：2×SYBR Green Mix 10 μl，cDNA模板1 μl，正、反向引物各0.6 μl，ddH2O补充至20 μl；反应程序：95℃10 min 1次，95℃2 s、60℃2s、70℃10s，共计40次。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法计算组织中RECQL4、OTUB2 mRNA表达。每次实验设置3个复孔，结果取平均数。引物由上海华大基因科技有限公司设计合成，引物序列见表1。

表1 引物序列（5’-3’）

1.2.1.3 随访 宫颈癌患者术后通过电话或门诊随访5年，随访截至2024年12月，患者出现复发转移（原发部位根治术后再次生长或向原发部位以外其他部位生长）或死亡则停止随访，统计5年无进展生存率。

1.2.2 体外实验

1.2.2.1 细胞株 宫颈癌细胞（HeLa细胞系）购自北京协和细胞库。使用含10%胎牛血清和1%双抗的MEM培养基，培养环境为37 ℃、5%CO2、湿度70%～80%。

1.2.2.2 主要仪器和试剂 化学发光仪（上海勤翔化学发光仪，型号：ChemiScope6100）；RECQL4抗体（美国abcam公司，货号：ab188125）；OTUB2抗体（美国abcam公司，货号：ab192375）；光学显微镜（日本奥林巴斯公司，型号：DX31）；shRECQL4、shOTUB2病毒液及oeRECQL4、oeOTUB2病毒液均购自上海吉玛基因生物科技公司；CCK8试剂盒（上海碧云天生物科技公司，货号：C0042）。

1.2.2.3 敲低和过表达实验①敲低实验：接种HeLa细胞于6孔板（5×105/孔），细胞培养至60%汇合度时，分为NC组、shRECQL4组、shOTUB2组。shRECQL4组和shOTUB2组滴加shRECQL4、shOTUB2病毒液，37 ℃孵育48～72 h后收集细胞，2 μg/ml嘌呤霉素筛选。②过表达实验：将HeLa细胞铺板生长至80%～85%汇合度时进行病毒感染，分为NC组、oeRECQL4组、oeOTUB2组，嘌呤霉素筛选细胞，3～4 d后提取蛋白检测验证，进行后续实验。

1.2.2.4 Western blot法 收集转染后的细胞，PBS洗涤2次，加入RIPA裂解液，BCA法定量测定蛋白浓度，加入5×SDS上样缓冲液，95 ℃变性5 min。SDS-PAGE电泳，恒压80 V（浓缩胶），120 V（分离胶）电泳，溴酚蓝跑至凝胶底部。甲醇浸泡1 min激活PVDF膜。采用湿转法转膜，恒流200 mA转膜2 h，5%脱脂牛奶封闭2h，加入RECQL4、OTUB2一抗（稀释比均为1∶1000），4 ℃冰箱过夜，二抗室温孵育1 h。采用ECL法显色，按1∶1混合ECL A/B液，滴至膜上，化学发光仪成像。每次实验独立重复3次，结果取平均数。

1.2.2.5 CCK8增殖实验 消化HeLa细胞，调整密度至5×104/ml，按5 000细胞/孔接种至96孔板，分别在0、12、24、48 h，每孔加入10 μl CCK8溶液，轻轻混匀。37 ℃避光孵育1 h，酶标仪测定450 nm波长下的光密度值（optical density，OD）值。每次实验设置6个复孔，结果取平均数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 28.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（）表示，比较采用t检验；计数资料用例数和百分率[例（%）]表示，比较采用χ2 检验。R 4.4.2软件survival、survminer包绘制阳性与阴性RECQL4、OTUB2蛋白表达宫颈癌患者无进展期生存曲线。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌组织与癌旁正常组织中RECQL4、OTUB2蛋白表达

RECQL4、OTUB2蛋白染色位于细胞质。宫颈癌组织中RECQL4、OTUB2蛋白阳性表达率为62.94%（90/143）、65.03%（93/143），癌旁正常组织为23.08%（33/143）、20.98%（30/143）。宫颈癌组织中RECQL4、OTUB2蛋白阳性表达率高于癌旁正常组织（χ2=46.347、56.618，P＜0.001）。见图1。

图1 宫颈癌及癌旁正常组织RECQL4、OTUB2蛋白表达（免疫组织化学染色法，400×）

2.2 宫颈癌组织与癌旁正常组织中RECQL4、OTUB2 mRNA表达

宫颈癌组织中RECQL4、OTUB2 mRNA相对表达量为（1.66±0.27）、（2.02±0.31），癌旁正常组织为（1.16±0.16）、（1.30±0.17）。宫颈癌组织中RECQL4、OTUB2 mRNA表达高于癌旁正常组织（t=19.051、23.353，P＜0.001）。

2.3 不同病理参数的宫颈癌患者RECQL4、OTUB2蛋白阳性表达比较

不同FIGO分期、淋巴结转移的宫颈癌患者RECQL4、OTUB2蛋白阳性表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同病理参数的宫颈癌患者RECQL4、OTUB2蛋白表达比较[例（%）]

2.4 不同RECQL4、OTUB2蛋白表达宫颈癌患者的预后比较

143例宫颈癌患者术后5年复发16例、转移9例、死亡15例，无失访病例，5年无进展生存率为72.03%（103/143）。RECQL4、OTUB2蛋白阳性表达宫颈癌患者无进展生存率为61.11%（55/90）、61.29%（57/93），RECQL4、OTUB2蛋白阴性表达为90.57%（48/53）、92.00%（46/50）。RECQL4、OTUB2蛋白阳性表达的宫颈癌患者无进展生存率低于阴性表达的宫颈癌患者（log-rank χ2=13.690，14.586，P＜0.001）。见图2。

图2 不同RECQL4、OTUB2蛋白表达宫颈癌患者的无进展生存曲线

2.5 敲低或过表达对RECQL4、OTUB2蛋白的影响

oe-RECQL4组、oe-OTUB2组RECQL4、OTUB2蛋白的相对灰度值高于NC组（P＜0.05）；sh-RECQL4组、sh-OTUB2组RECQL4、OTUB2蛋白相对灰度值低于NC组（P＜0.05）。见图3～4。

图3 蛋白条带图

图4 敲低或过表达对RECQL4、OTUB2蛋白的影响（n=3）

aP＜0.01。

2.6 敲低或过表达RECQL4、OTUB2蛋白对宫颈癌细胞增殖的影响

sh-RECQL4组24、36、48 h时OD值低于NC组，oe-RECQL4组24、36、48 h时OD值高于NC组（P＜0.05）；sh-OTUB2组36、48 h时OD值明显低于NC组，oe-OTUB2组36、48 h时OD值高于NC组（P＜0.05）。见图5。

图5 RECQL4、OTUB2表达对HeLa细胞增殖的影响（n=6）

与NC组比较，aP＜0.01。OD：光密度值。

3 讨论

目前，手术仍然是早中期宫颈癌最有效的治疗方式，能够彻底切除病灶，但仍有较多宫颈癌患者在术后复发转移[8]。免疫、靶向等治疗提升了该类患者生存率，但获益群体较少。因此，探索影响宫颈癌患者预后的分子标志物，对指导个体化治疗和术后随访策略制订具有重要的意义。

RECQL4是一种DNA解旋酶，参与DNA复制、修复和稳定基因组过程，促进癌细胞增殖、抑制凋亡、基因组不稳定等恶性肿瘤的发生、发展[9]。研究发现，肝细胞癌中RECQL4高表达，能通过修复放疗诱导的DNA损伤，降低放疗敏感性[10]。本研究发现，宫颈癌组织中RECQL4蛋白阳性表达升高，且RECQL4蛋白阳性表达宫颈癌患者预后较差，提示RECQL4在宫颈癌的发生、发展中可能发挥重要的促癌作用；细胞实验显示，RECQL4过表达促进HeLa细胞的恶性增殖能力，与既往研究中RECQL4在多种实体瘤中致癌潜能的报道一致[11]。研究表明，RECQL4激活蛋白激酶B信号通路促进结直肠癌细胞周期G1/S期的转换，促进癌细胞的恶性增殖，导致肿瘤恶性进展[11]。有学者报道，RECQL4的高表达能修复细胞DNA损伤和增强基因组不稳定性，增强癌细胞侵袭和转移能力，从而促进乳腺癌进展[12-13]。机制上，RECQL4高表达能促进肿瘤细胞DNA损伤修复，降低细胞对内外源性损伤的敏感性，促进宫颈癌进展；同时RECQL4能稳定并上调膜联蛋白A2表达，进一步抑制宫颈癌细胞凋亡，从而导致宫颈癌恶性程度加重和预后不良[14]。

OTUB2是一种去泛素化酶，能激活致癌相关信号通路促进恶性肿瘤的发生、发展[4]。本研究发现，宫颈癌组织OTUB2蛋白阳性表达升高，且OTUB2蛋白阳性表达宫颈癌患者5年无进展生存率降低。研究表明，OTUB2能介导肿瘤坏死因子受体相关因子2去泛素化来激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，促进膀胱癌增殖、转移和顺铂耐药[15]。此外，OTUB2能诱导特异性蛋白1的K48泛素化，激活GINS复合物亚基1信号，促进结直肠癌细胞肿瘤化疗耐药和转移[16]。细胞实验显示，OTUB2能够促进宫颈癌HeLa细胞的增殖，导致肿瘤进展。机制上，OTUB2能通过去泛素化作用上调并稳定叉头框蛋白M1表达，上调细胞周期素依赖蛋白激酶D1的表达，增强癌细胞的增殖能力[17]。本研究中，OTUB2蛋白阳性表达的宫颈癌患者预后较差，可能是因为OTUB2能激活蛋白激酶B/哺乳动物雷帕靶蛋信号通路，促进细胞周期的进行，诱导癌细胞恶性增殖，导致宫颈癌患者预后不良[18]。

综上所述，RECQL4、OTUB2高表达与宫颈癌患者不良预后相关，可能为个体化治疗提供依据。但本研究仅采用免疫组织化学染色法和RT-qPCR法检测RECQL4、OTUB2表达，未涉及更深入的分子机制。未来还需结合细胞实验进行机制研究。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Biological function of RECQL4 and OTUB2 expressions in cervical cancer tissues and their relationship with clinicopathological characteristics and prognosis

CUI Na1 CHEN Li1 CHEN Shijia2 ZHU Yanfeng3

1.Department of Gynecology,Baoding First Central Hospital,Hebei Province,Baoding 071000,China;2.Blood Transfusion Department,Baoding First Central Hospital,Hebei Province,Baoding 071000,China ;3.Surgery,Baoding Preferential Treatment Hospital,Hebei Province,Baoding 071000,China

[Abstract] Objective To explore the biological function of RECQL4 and OTUB2 expressions in cervical cancer tissues and their relationship with clinicopathological parameters and prognosis.Methods A total of 143 cervical cancer patients who underwent surgical treatment in Baoding First Central Hospital from January 2017 to December 2019 were selected.The expressions of RECQL4 and OTUB2 protein and mRNA in cervical cancer tissues and adjacent normal tissues were detected by immunohistochemistry and RT-qPCR.The patients were followed up for 5 years,and the progression-free survival rates of cervical cancer patients with positive and negative protein expressions of RECQL4 and OTUB2 were compared.Stable RECQL4 and OTUB2 knockdown HeLa cell lines were constructed，and divide it into NC group，shRECQL4 group，and shOTUB2 group;stable overexpressing of RECQL4 and OTUB2 Hela cell lines were constructed，and were divided into NC group，oeRECQL4 group，and oeOTUB2 group.Protein detection was carried out by Western blot method;and the effect of knockdown or overexpression of RECQL4 and OTUB2 on the proliferation of Hela cells were detected by CCK8 method.Results The positive expression rates of RECQL4 and OTUB2 proteins in cervical cancer tissues were higher than those in adjacent normal tissues(P＜0.05).The expressions of RECQL4 and OTUB2 mRNA in cervical cancer tissues were higher than those in adjacent normal tissues (P ＜0.05).There were statistically significant differences in the positive expressions of RECQL4 and OTUB2 proteins among cervical cancer patients with different FIGO stages and lymph node metastasis(P＜0.05).The progression-free survival rate of cervical cancer patients with positive expressions of RECQL4 and OTUB2 proteins were lower than those of cervical cancer patients with negative expression (P＜0.05).The relative gray values of RECQL4 and OTUB2 proteins in the oe-RECQL4 group and the oe-OTUB2 group were higher than those in the NC group(P＜0.05);the relative gray values of RECQL4 and OTUB2 proteins in the sh-RECQL4 group and the sh-OTUB2 group were lower than those in the NC group(P＜0.05).The optical density(OD)values of the sh-RECQL4 group at 24,36 hours,and 48 hours were lower than those of the NC group,while the OD values of the oe-RECQL4 group at 24,36 hours,and 48 hours were higher than those of the NC group (P＜0.05).The OD values of the sh-OTUB2 group at 36,48 hours were lower than those of the NC group,while the OD values of the oe-OTUB2 group at 36,48 hours were higher than those of the NC group(P＜0.05).Conclusion RECQL4 and OTUB2 are highly expressed in cervical cancer tissues and are associated with a poor prognosis in patients with cervical cancer.

[Key words] Cervical cancer;RECQL4;OTUB2;Pathological parameters;Prognosis

[中图分类号] R737.33；R730.7

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）12（a）-0081-06

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.34.14

[基金项目] 河北省医学科学研究课题计划项目（20200423）。

[作者简介] 崔娜（1980.12-），女，硕士，副主任医师；研究方向：妇科肿瘤。

（收稿日期：2025-06-10）

（修回日期：2025-09-23）