中亚沙棘是胡颓子科沙棘属沙棘的一个亚种，在新疆维吾尔自治区广泛分布[1]。中亚沙棘抗逆性强，在新疆地区广泛被用于生态治理[2]。沙棘含有维生素、蛋白质、有机酸、酚类、黄酮、酚酸、肌醇、类胡萝卜素和甾醇等多种活性物质[3-5]。

沙棘叶作为产出沙棘果实附属产物，其所含的活性成分丰富，不仅在医药、食品领域得到应用，还具有多元化、深层次的开发潜力[6-7]。同时与沙棘果比较，沙棘叶具资源丰富、采收期长、易于采集和储存等优势[8-9]。沙棘叶作为产出沙棘果实附属产物，其开发利用有助于实现沙棘全株的高值化利用，提高种植经济效益，有效减少资源浪费。沙棘叶作为一种绿色环保、可持续和易获得的一种天然原料，沙棘叶产品在未来市场中显示出广阔的应用前景。

沙棘叶富含的黄酮类成分具有抗氧化、抗肿瘤等药理活性[10-13]。为更好地开发利用中亚沙棘药材资源，本研究以中亚沙棘叶为研究对象，通过系统筛选建立中亚沙棘叶中总黄酮类成分的提取工艺的筛选，制备得到总黄酮提取物。并进一步对该提取物进行体外抗氧化活性的初步探究，旨在为中亚沙棘叶的深入研究和综合开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦丁对照品（北京索莱宝科技有限公司，批号：20230118）；邻苯三酚（上海源叶生物科技有限公司，批号：S29851）；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）（东京化成工业株式会社，批号：217-591-8）；VC对照品（天津市致远化学试剂有限公司，批号：20231201）；磷酸缓冲液（北京兰杰柯生物科技有限公司，批号：23223110）。

中亚沙棘叶和果实分别于2023年5月及8月采于新疆塔什库尔干塔吉克自治县，自然晾干后粉碎待用。

1.2 仪器与设备

DFY-X300型高效多功能粉碎机（温州顶历医疗器械有限公司）；HH-S6型数显恒温水浴锅（常州金坛宏华仪器）；T6型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；KQ-700DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；B-N型分析天平（梅特勒-托利多中国分公司）；N1001型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；HX-T3型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 中亚沙棘叶总黄酮提取

将干燥的中亚沙棘叶完全粉碎后，过60目筛，准确称取一定质量的中亚沙棘叶粉末置于一定浓度与体积的乙醇溶液中，在适宜的温度下进行超声提取（功率100 W，频率40 kHz），过滤即得中亚沙棘叶总黄酮提取液[14]。

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制

采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定提取物中总黄酮含量[15]。精密称取一定质量的芦丁对照品用60%乙醇配制成0.2 mg/ml芦丁对照品溶液后，精密量取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml置25 ml容量瓶中，分别加入5%NaNO2 1.0 ml，放置6 min后，再加入10%Al（NO3）3 1.0 ml，放置6 min后，继续加入4%NaOH溶液10 ml摇匀，再加入乙醇定容摇匀，放置15 min。以空白试剂作参比溶液，于510 nm波长处测定吸光度值，并以芦丁对照品溶液的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制中亚沙棘叶总黄酮含量测定的标准曲线。该回归方程为A=11.742C+0.003 4，R2=0.999 8，其线性范围为0.019 8～0.059 4 mg/ml，提示在0.019 8～0.059 4 mg/ml范围内其吸光度值与浓度呈良好的线性关系。按照上述实验条件，测定不同提取物的吸光度值后，根据回归方程测得不同样品的黄酮含量。

式中C：待测样品溶液的黄酮浓度（mg/ml）；D：稀释倍数V：样品溶液体积（ml）；W：待测样品的质量（mg）。

1.3.3 单因素试验

根据预实验结果，在筛选提取条件时，精密称取多份1.0 g中亚沙棘叶粉末，依次对提取溶剂（H2O，20%、40%、60%、80%、95%乙醇）、提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）和料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1.0∶30 g/ml）进行优化。所有溶液的提取均在超声功率100 W、频率40 kHz条件下进行，提取液过滤后取续滤液测定吸光度，并依据标准曲线计算总黄酮含量，以确定各阶段最佳提取参数。

1.3.4 正交实验设计

根据单因素试验考察的结果，以中亚沙棘叶中总黄酮的含量为考察指标，设计L9（34）正交实验方案，按照正交表中的方案进行实验，每组试验重复3次，通过计算每组提取液中的总黄酮含量[16]。通过方差分析确定每个实验因素对总黄酮含量的影响，再结合直观分析的结果确定每个因素的最优水平组合，从而得出中亚沙棘叶总黄酮的最佳提取工艺条件，具体考察因素与水平见表1。

表1 L9（34）正交实验因素水平

1.3.5 验证试验

精密称取3份中亚沙棘叶粉末10.0 g，按最佳工艺提取，测定提取液吸光度值A并按照标准曲线计算总黄酮含量。

1.3.6 中亚沙棘叶和果实提取物体外抗氧化实验

1.3.6.1 Fe3+还原能力的测定 将待测的中亚沙棘叶和果实分别用DMSO溶解稀释成质量为0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mg/ml的样品溶液备用[17]。分别向7支试管中依次加入各样品溶液2.5 ml、pH值为6.6的PBS溶液2.5 ml、1%铁氰化钾溶液2.5 ml，摇匀，将试管置于50 ℃水浴中保温20 min，取出，快速冷却，分别加入10%三氯乙酸溶液2.5 ml，摇匀，离心10 min，再分别取上清液2.5 ml，依次加入蒸馏水2.5 ml、0.1%FeCl3 溶液0.5 ml，充分混匀，静置10 min，VC为阳性对照，在波长700 nm下测定吸光度值A（以蒸馏水作参比）。比较不同提取物对Fe3+还原能力的影响。

1.3.6.2 DPPH·清除率的测定 采用DMSO将中亚沙棘叶及果实样品分别稀释为不同浓度样品溶液（叶：0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/ml；果实：0.1、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.0 mg/ml）[18]。取不同浓度样品溶液1 ml，甲醇1 ml，DPPH溶液2 ml，在517 nm波长处测定吸光度值（Ai）；再以甲醇溶液代替DPPH溶液测定吸光度值（Aj）；以甲醇溶液代替样品溶液测定吸光度值（A0）。以VC为阳性对照，每个实验平行3次，取平均值计算清除率：清除率（%）=[1-(Ai-Aj）/A0]×100%。

1.3.6.3 超氧阴离子自由基（O2-·）清除率的测定 采用DMSO将中亚沙棘叶及果实样品分别稀释为不同浓度样品溶液（叶：0.004、0.006、0.010、0.020、0.050、0.150、0.250 mg/ml；果实：0.006、0.010、0.020、0.050、0.150、0.250、0.350 mg/ml）[19]。取1 ml样品液与9 ml PBS混合，25 ℃保温15 min后得混合液。取3 ml混合液，0.1ml邻苯三酚溶液，反应4 min时加入一滴10 mol/L HCl终止反应，于325 nm波长下测定吸光度值（A1）；再以PBS代替邻苯三酚溶液测定吸光度值（A2）；以PBS代替混合液测定吸光度值（A3），以VC为阳性对照，每个实验平行3次，取平均值来计算清除率。清除率（%）=[1-（A1-A2）/A3]×100%。

2 结果

2.1 中亚沙棘叶总黄酮含量测定方法的建立

实验结果显示，芦丁的标准曲线为A=11.742C+0.003 4（R2=0.999 8，n=5），其线性范围为0.019 8～0.059 4 mg/ml。提示芦丁在0.019 8～0.059 4 mg/ml范围内呈良好的线性关系。

2.2 单因素试验

提取溶剂的筛选结果如图1A所示。在其他因素条件固定下，随着乙醇浓度增加，总黄酮提取量呈先下降后上升的趋势。乙醇浓度为50%时，总黄酮含量最低（30.88 mg/g）；浓度为95%时达到最高（44.39 mg/g）。结果显示，在50%～95%的乙醇浓度范围内，总黄酮提取量随乙醇浓度增加而增加，因此选择95%乙醇作为后续提取溶剂。

图1 单因素实验结果

A：提取溶剂；B：超声时间；C：料液比。

提取时间的筛选结果如图1B所示。在其他因素条件固定下，随提取时间延长，总黄酮含量先下降，后逐渐上升，在2.0 h后增幅趋缓，为节约时间成本，后续实验选择提取时间为2.0 h。

料液比的筛选结果如图1C所示。在其他因素条件固定的情况下，总黄酮含量随溶剂用量增加先下降后升高随后下降，在料液比为1∶25（ml/g）时达到最高（37.23 mg/g）。结果显示，总黄酮提取量并非随溶剂比例增大而增加，而是在1∶15～1∶25范围内呈上升趋势，因此确定最佳料液比为1∶25（ml/g）。

2.3 正交试验

正交实验结果如表2所示。每组试验按正交表中实验方案对中亚沙棘叶粉末进行提取，每组平行提取3份，再分别测定各组提取液中总黄酮的含量，并进行方差分析（表3）与直观分析。方差分析结果显示，提取时间（A）、提取次数（B）和溶剂量（C）3个因素均P＜0.01，提示三者对总黄酮含量均具有显著影响。进一步通过直观分析比较各因素水平下的平均含量（k值）发现，因素A在水平A1（1.5 h）时总黄酮平均含量最高，为39.65 mg/g；因素B在水平B2（提取2次）时最高，为43.58 mg/g；因素C在水平C2（25 ml/g）时最高，为39.14 mg/g。因此，综合方差分析与直观分析结果，确定最佳提取工艺组合为A1B2C2，即：称取1.0 g中亚沙棘叶粉末，按料液比1∶25（ml/g）加入95%乙醇，提取2次，每次1.5 h。

表2 正交分析实验结果

表3 正交实验结果的方差分析结果

注 R2=0.871，调整后R2=0.832。

2.4 验证实验

精密称取3份10.0 g中亚沙棘叶粉末，根据筛选出的最佳总黄酮提取工艺进行3次平行验证实验，结果显示，3份中亚沙棘叶提取液中总黄酮的平均含量为41.33 mg/g。

2.5 中亚沙棘叶和果实提取物中总黄酮含量的测定

根据最佳提取工艺制备中亚沙棘叶和果实的总黄酮提取物，并分别测定总黄酮含量。结果显示，中亚沙棘叶提取物中总黄酮的含量为41.46 mg/g，果实提取物中的总黄酮含量为38.0 mg/g，见表4。并对中亚沙棘叶和果实提取物中总黄酮含量的测定结果进行方差分析得P＜0.05，提示中亚沙棘叶和中亚沙棘果实的总黄酮含量存在显著差异，即中亚沙棘叶中的总黄酮含量高于果实，见表5。

表4 中亚沙棘叶、果实中总黄酮测定结果

表5 不同中亚沙棘部位中总黄酮测定结果的方差分析结果

注 R2=0.719，调整后R2=0.648。

2.6 中亚沙棘叶和果实提取物体外抗氧化实验

2.6.1 还原能力测定

中亚沙棘叶和果实提取物对Fe3+还原能力的实验结果如图2所示。结果显示，在0.05～0.40 mg/ml浓度范围内，中亚沙棘叶和果实提取物的还原能力随浓度增加而增强，提示中亚沙棘提取物对Fe3+有良好的还原作用。在整个浓度范围内，中亚沙棘叶提取物的还原能力始终高于果实提取物，但两者的效果都弱于阳性对照VC。

图2 对Fe3+还原能力的测定

2.6.2 对DPPH·清除能力的测定

中亚沙棘叶与果实提取物对DPPH·自由基的清除能力结果如图3所示。结果显示，各提取物清除DPPH·自由基的能力随样品浓度增加而增强。且VC、中亚沙棘叶和果实提取物的IC50 值分别为0.030 1、0.065 4和0.662 4 mg/ml，提示叶提取物的清除作用强于果实提取物，但两者均弱于阳性对照VC。

图3 对DPPH·清除能力的测定

DPPH：1，1-二苯基-2-苦肼基。

2.6.3 对O2-·清除能力的测定

中亚沙棘叶与果实提取物对O2-·的清除能力如图4所示。结果显示，各提取物的清除能力随样品浓度增加而增强。VC、中亚沙棘叶提取物和果实提取物的IC50 值分别为0.058 1、0.007 7、0.038 0 mg/ml，提示中亚沙棘叶与果实提取物的清除率均高于阳性对照VC，且叶提取物的清除效能显著高于果实提取物。

图4 对O2-·的清除能力的测定

O2-·：超氧阴离子自由基。

3 讨论

通过单因素实验确定因素水平，并通过正交实验最终确定提取时间、提取次数和料液比等因素均对提取中亚沙棘叶中的总黄酮提取效率有显著影响。在单因素实验中，提取液中的总黄酮含量并不是单纯随变量的变化而单一的正相关或负相关的变化。在优化提取方案的条件筛选过程中不仅结合实验数据，同时与实际相结合从经济等方面综合考虑。最终得到最佳的提取工艺为用95%乙醇超声提取中亚沙棘叶粉末，料液比为1∶25，提取2次，每次提取时间为1.5 h。按该提取工艺等制备得到的中亚沙棘叶提取物中总黄酮含量较高为41.33 mg/g，本工艺使用95%乙醇而非甲醇等有机溶剂作为提取溶剂具有绿色无毒、可回收、易于获取和性价比高等优点。使用超声提取在便于大量提取的同时避免了接触明火和高温，减少了很多的安全隐患，也为大规模使用沙棘叶提取总黄酮提供了一种可供参考的提取方式。

采用最优提取工艺对中亚沙棘叶与果实中的总黄酮进行提取，并对其含量进行测定和比较。结果显示，在最佳提取条件下，中亚沙棘叶中的总黄酮含量（41.46 mg/g）高于果实（38.0 mg/g），而且沙棘叶相较于沙棘果实存在采收周期长、易储存、易运输、经济等优点。本研究为大规模工业化使用中亚沙棘叶提取总黄酮提供了一定的数据参考，提示中沙棘叶存在着巨大的开发应用价值。

通过对中亚沙棘叶和果实中总黄酮的抗氧化活性进行研究，并与VC在一致条件下的抗氧化性能进行比较，结果表明，两者提取物均表现出良好的还原能力，以及对DPPH、和O2-·的清除作用。与杨诗涵等[18]使用酶协同微波提取沙棘果实总黄酮的方法比较，本研究工艺所获得提取物中的总黄酮含量更高，在质量浓度显著低于上述研究的条件下，本研究中沙棘叶和沙棘果实提取物的DPPH·的清除能力仍可达到显著效果。尤其是中亚沙棘叶提取物，其抗氧化性能更为卓越，进一步证实了其在抗氧化应用方面的优越性。

综上，中亚沙棘叶提取物具备开发天然抗氧化剂的应用前景。然而，本研究中仅进行了体外活性评价，后续仍需开展系统的活性研究，以进一步评估其安全性及体内抗氧化活性。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Study on the optimization of extraction process and antioxidant activity of total flavonoids from H.rhamnoides subsp.turkestanica leaves

QIN Jiankang1 DAI Ruiju2 Maierhaba Abulimiti3 Mirensha Yakufu1 WANG Xinling1 WANG Xiaomei1

1.Department of Pharmacy，Xinjiang Medical University,Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830017,China;2.Xinjiang Huachun Biopharmaceutical Co.,Ltd.,Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830000,China;3.Xinjiang Guinong Traditional Chinese Medicine Pieces Co.,Ltd,Xinjiang Uygur Autonomous Region,Wensu 843400,China

[Abstract] Objective To optimize the extraction process of total flavonoids from H.rhamnoides subsp.turkestanica leaves and evaluate their antioxidant activity in vitro.Methods The optimal extraction process of total flavonoids from sea buckthorn leaves of H.rhamnoides subsp.turkestanica was optimized through single-factor experiments and orthogonal experiments,and the differences in total flavonoid content between sea buckthorn leaves and fruits of H.rhamnoides subsp.turkestanica were compared.The reduction ability of total flavonoids in the leaves and fruits of sea buckthorn from H.rhamnoides subsp.turkestanica to Fe3+,as well as their scavenging ability to DPPH radicals and superoxide anion radicals(O2-·)were evaluated.Results The optimized extraction process for total flavonoids from H.rhamnoides subsp.turkestanica leaves was as follows:the medicinal material was extracted twice with 25 volumes of 95%ethanol,each extraction lasting 1.5 hours.Under these conditions,the total flavonoid content in the extracts of the leaves and fruits was determined to be 40.82 and 38.00 mg/g,respectively.Total flavonoid extracts from leaves and fruits,at different concentrations,exhibited significant reducing power toward Fe3+,as well as scavenging capacity against DPPH radicals and O2-·.The IC50 values for DPPH radical scavenging were 0.065 4 mg/ml (leaves) and 0.662 4 mg/ml (fruits),respectively,while the IC50 values for O2-·scavenging were 0.007 7 mg/ml (leaves) and 0.038 0 mg/ml (fruits),respectively.Conclusion The extraction method is feasible and the process conditions are reliable.The total flavonoid content in leaves prepared using this process is higher than that in fruits,and the antioxidant activity of the leaves extractis stronger than that of the fruits extract.

[Key words] H.rhamnoides subsp.turkestanica;Total flavonoids;Process optimization;Ultrasonic-assisted extraction;Antioxidant activity

[中图分类号] R282；R931

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）12（b）-0036-06

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.35.08

[基金项目] 新疆天然药物活性组分与释药技术重点实验室项目（XJDX1713）。

[作者简介] 覃建康（2000.11-），男，新疆医科大学药学院2024级生药学专业在读硕士研究生；研究方向：天然药物活性成分。

[通讯作者] 王晓梅（1979.3-），女，博士，副教授，硕士生导师；研究方向：天然药物活性成分的研究与开发。

（收稿日期：2025-06-30）

（修回日期：2025-09-20）