补肺丸源于《永类钤方》[1]中的补肺汤，是由熟地黄、党参、炙黄芪、桑白皮、紫菀和五味子6味药组成的中药制剂，具有补肺益气，止咳平喘的疗效，临床用于缓解气短咳喘、咳声低弱等症状。补肺丸中入肺成分较多，包括黄酮类、酚酸、木脂素类和氨基酸类等成分[2]。在新冠疫情期间被北京市中医药管理局列为新型冠状病毒感染恢复期的推荐用药。目前补肺丸质量控制的研究较少，其质量标准仍需进一步完善。

中药制剂成分复杂，单一成分定量难以表征其整体质量属性，指纹图谱联合化学计量学可系统评价中药质量并筛选质量标志物，该方法应用广泛，对中成药质量控制研究有重要意义[3-4]。方中炙黄芪为臣药，蜜炙后的黄芪以益气补中为主要功效，可用于肺气虚证，其化学成分中以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为主的黄酮类具有抗炎作用[5]；五味子为方中佐药，有益气生津的功效，可明显抑制肺纤维化程度[6]。本研究建立了15批补肺丸的超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）指纹图谱，结合聚类分析、主成分分析等化学模式识别及4种标志性成分的含量测定方法，对15批次补肺丸样品进行质量评价，以期为此制剂的质量控制和标准提升提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters ACQUITY型超高效液相色谱仪（美国Waters公司，检测器：二极管阵列检测器）；KQ-500DE型超声波清洗器（上海超声波仪器厂）；METTLER TOLEDO ME204型 和METTLER TOLEDO MS205DU型 天平（瑞士梅特勒公司）。

1.2 试药

补肺丸（批号：305001、305002、305011、305013、305019、305020、305022、305025、305026、305029、305032、305033、305038、301054和301070，购于丽彩甘肃西峰制药有限公司）；五味子醇甲（批号：110857，纯度：99.2%）、五味子醇乙（批号：112108，纯度99.2%）、五味子乙素（批号：110765-201813，纯度：99.1%）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号：111920，纯度：96.8%）、绿原酸（批号：110753，纯度91.6%）、桑皮苷A（批号：112086，纯度量：96.4%）均购于中国食品药品检定研究院；桑黄酮G（批号：J01GB150396纯度：98%）购于上海源叶生物科技有限公司；乙腈（赛默飞世尔科技公司，色谱级）；甲酸（阿拉丁，色谱级）；甲醇（赛默飞世尔科技公司，分析纯）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters BEH-C18 柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（0～8 min，1%～2%A；8～15 min，2%～2%A；15～22 min，2%～11%A；22～36 min，11%～21%A；36～46 min，21%～30%A；46～48 min，30%～40%A；48～56 min，40%～45%A；56～63 min，45%～53%A；63～68 min，53%～62%A；68～79 min，62%～70%A）。流速0.3 ml/min。检测波长：254 nm。柱温：30 ℃。进样量2 μl。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取各对照品适量，精密称定，分别以70%甲醇溶解，制成单一对照品贮备液。各精密吸取适量，加70%甲醇稀释，制成含绿原酸144.60 μg/ml、桑皮苷A 48.70 μg/ml、毛蕊异黄酮葡萄糖苷17.20 μg/ml、五味子醇甲57.00 μg/ml、五味子醇乙32.40 μg/ml、桑黄酮G 69.80 μg/ml和五味子乙素39.28 μg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称定补肺丸样品4 g，置于具塞锥形瓶中，精密量取70%甲醇50 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率100 W、频率40 kHz）60 min，取出，冷却至室温，称定重量，用70%甲醇补足失重，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方比例分别取缺五味子、缺黄芪的阴性样品（自制制剂），按“2.2.2”项方法制备五味子阴性和黄芪阴性对照溶液。

2.3 UPLC指纹图谱方法学考察

2.3.1 精密度考察 取按“2.2.2”方法制备的供试品溶液，“2.1”项色谱条件连续进样6次。以7号峰（五味子醇甲）为参照峰，计算结果显示，各共有峰相对峰面积的RSD为0.90%～2.91%（n=6），相对保留时间的RSD为0.01%～0.18%（n=6），提示该仪器精密度符合要求。

2.3.2 重复性考察 取按“2.2.2”项方法平行制备的6份供试品溶液，“2.1”色谱条件进样分析。以五味子醇甲（7号峰）为参照峰，计算结果显示，各共有峰的相对峰面积的RSD为0.53%～2.79%（n=6），相对保留时间的RSD为0.01%～0.22%（n=6），提示本方法重复性良好。

2.3.3 稳定性考察 取按“2.2.2”方法制备的供试品溶液，“2.1”色谱条件分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样分析，以7号峰五味子醇甲为参照峰，计算各共有峰相对峰面积的RSD为1.25%～2.61%（n=8），各共有峰相对保留时间的RSD为0.04%～1.03%（n=8），提示该供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4 指纹图谱的建立及相似度评价 供试品溶液依据“2.2”项下方法制备（共15批次），“2.1”项色谱条件下进行UPLC分析。所得色谱图数据导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版），以S1 的色谱图为参照图谱，设定时间窗宽度为0.1 min，采用平均数法对15批样品进行指纹图谱的多点校正。15批样品（S1～S15）与R的相似度计算结果分别为0.998、0.997、0.996、0.995、0.990、0.991、0.986、0.995、0.994、0.994、0.991、0.997、0.974、0.991。提示各批样品成分稳定、均一性良好。结果见图1～2。通过比对保留时间与紫外光谱特征，在15批补肺丸的UPLC色谱图中共标识出11个特征共有峰。指认3号峰为绿原酸、4号峰为桑皮苷A、5号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、7号峰为五味子醇甲、8号峰为五味子醇乙、9号峰为桑黄酮G、11号峰为五味子乙素。

图1 补肺丸的UPLC指纹图谱

UPLC：超高效液相色谱法。

图2 对照品图谱

1：绿原酸；2：桑皮苷A；3：毛蕊异黄酮葡萄糖苷；4：五味子醇甲；5：五味子醇乙；6：桑黄酮G；7：五味子乙素。

2.4 化学模式识别

2.4.1 聚类分析 将15批补肺丸样品共有峰的峰面积数据导入SPSS 26.0软件，以相对峰面积标准化值构建原始数据矩阵，采用组间连接法进行聚类分析。以平均欧式距离作为样品的测度，结果可见当平方欧式距离为25时，15批样品被分为2类，S1～S13 为一类，S14和S15 为一类，提示不同批次的补肺丸质量存在一定差异。见图3。

图3 15批补肺丸聚类分析

2.4.2 主成分分析 以峰面积数据矩阵为数据，运用SPSS 26.0软件对15批补肺丸进行主成分分析，提取的1个主成分的特征值为14.670，累积方差贡献率达到97.797%，提示这一个主成分因子能代表补肺丸指纹图谱11个共有峰的基本特征。主成分分析碎石图见图4。

图4 主成分分析碎石图

2.4.3 正交偏最小二乘-判别分析 将11个共有峰的峰面积导入SIMCA 14.1软件，结果见图5～6。进行200次置换检验，其R2X为0.674，大于0.5，提示该模型稳定性较好，R2Y为0.817，Q2 为0.653。Q2 回归线与纵轴交点低于0，提示该模型未出现过拟合状态，说明该模型具有有效性。

图5 补肺丸OPLC-DA得分

图6 置换检验图

采用变量重要性投影筛选影响制剂质量的标志物，共有成分的VIP值越大，其对制剂组间差异的影响就越大。15批样品中11个共有成分的VIP值见图7，其中VIP值大于1的是绿原酸（VIP值为2.320 23）、五味子醇甲（VIP值为1.253 54）、桑皮苷A（VIP值为1.151 06），提示这些是影响补肺丸分类的主要标志性成分，可作为评价补肺丸质量的指标成分。

图7 15批补肺丸指纹图谱共有峰VIP

图8 对照品和供试品色谱图

A：混合对照品溶液；B：供试品；C：缺黄芪阴性对照；D：缺五味子阴性。1：毛蕊异黄酮葡萄糖苷；2：五味子醇甲；3：五味子醇乙；4：五味子乙素。

2.5 方法学考察及含量测定

2.5.1 专属性 精密吸取混合对照溶液、供试品溶液、缺黄芪阴性对照溶液及缺五味子阴性对照溶液，按“2.2”色谱条件进样分析。结果显示阴性对照溶液在供试品和对照品相应保留时间处均未出现色谱峰且与周围峰有效分离，提示测定无明显干扰。

2.5.2 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”方法制备的对照品溶液1、2、3、4、5 μl，以“2.1”色谱条件进样分析，以对照品进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，计算线性回归方程。结果见表1。

表1 4个成分线性关系考察结果

2.5.3 精密度考察 取按“2.2.2”方法制备的供试品溶液，按“2.1”色谱条件连续进样6次。计算毛蕊异黄酮葡萄糖苷、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子乙素含量RSD分别为0.27%、0.31%、0.36%、0.31%（n=6），提示该仪器精密度良好。

2.5.4 重复性考察 取按“2.2.2”方法平行制备的6份供试品溶液，按“2.1”色谱条件进样分析，记录各成分峰面积，计算毛蕊异黄酮葡萄糖苷、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子乙素含量RSD分别为1.15%、0.65%、0.74%、2.04%（n=6），提示该方法重复性良好。

2.5.5 稳定性考察 取按“2.2.2”方法制备的供试品溶液，按“2.1”色谱条件分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样分析，记录各成分峰面积，计算毛蕊异黄酮葡萄糖苷、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子乙素含量RSD分别为2.45%、1.77%、1.81%、1.92%（n=8），提示该供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.6 加样回收率试验 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子乙素对照品，加甲醇制成含毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.020 7 mg/ml、五味子醇甲0.459 6 mg/ml、五味子醇乙0.1197 mg/ml和五味子乙素0.162 2 mg/ml的对照品溶液，备用。分别精密吸取各对照品溶液0.7、1.0、1.3 ml各3份于锥形瓶中，氮气吹干溶剂，共9份；取补肺丸（S13）约2 g于上述锥形瓶中，按“2.2.2”方法制备供试品溶液。按“2.1”色谱条件进行测定，测定供试品溶液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、五味子醇甲、五味子醇乙和五味子乙素含量，计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果

2.5.7 样品含量测定 取15批样品，按“2.2.2”方法制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件进样测定，计算4个成分含量，结果见表3。

表3 补肺丸4个成分含量测定结果（mg/g）

3 讨论

前期对提取溶剂（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、70%乙醇）、提取溶剂体积（25、50、100 ml）、提取时间（0.5、1.0、1.5 h）、提取方式（超声、回流）、取样量（3、4、5 g）进行考察，发现以“2.2.2”的供试品制备方法重复性和稳定性良好。分别对柱温（25、30、35 ℃）、检测波长（203、245、280 nm）、流动相（乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液）进行考察，发现以“2.1”色谱条件进行洗脱时各成分色谱峰分离度较好；在254 nm波长下，色谱峰数量最多，基线相对平稳，故确定“2.1”的色谱条件。

绿原酸在图谱中峰形较高，且色谱峰分离较差，加样回收率实验结果不合格；桑皮苷A由于色谱峰的干扰，导致含量测定重复性的RSD值＞3%。因此两个化合物未纳入标志物含量测定中。熟地黄作为方中君药，其为阴中之阳，具有补气血、滋肾气的功效。地黄苷D、梓醇是熟地黄的标志性成分，梓醇有多种药理作用，可用于糖尿病、心肌病、脑血管疾病的治疗[7]。在UPLC指纹图谱建立时，梓醇和地黄苷D的对照图谱与指纹图谱相应位置上有干扰且含量较低，因此本研究未测定这两种成分。

毛蕊异黄酮葡萄糖苷是黄芪中的有效成分，具有强氧化活性能力，可明显改善心肌功能，且具有抗肿瘤、抗病毒作用[8]。五味子醇甲能够改善由呼吸道病毒感染引发的感冒后咳嗽症状，其抗氧化能力强，可提高损伤细胞的存活率，且对肝脏具有保护作用[9-10]。绿原酸是天然的多酚类化合物，具有抗菌、抗病毒作用，可通过抑制促纤维因子的表达及抑制上皮间质转化来缓解肺纤维化[11-12]。3种化学成分的药理作用与补肺丸治疗肺部疾病的作用相对应，可能可以作为补肺丸的质量标志物，以期在后续研究中得到验证。

4 小结

本研究建立了补肺丸的UPLC指纹图谱，共标定11个共有峰，并指认出7个化学成分，15批样品的相似度结果均＞0.9，提示15批补肺丸样品的生产工艺具有较好的一致性。化学模式识别结果显示绿原酸、五味子醇甲和桑皮苷A是导致组间差异的标志性成分。绿原酸、五味子醇甲和桑皮苷A可能是区分不同批次之间差异的关键性成分，可对这3种成分进行更深层次的考察，从而保证补肺丸不同批次之间的一致性。同时测定五味子醇甲等4种成分含量，操作简单，重复性好，稳定可靠。综上所述，由于未对君药熟地黄中的主要成分进行定量分析，所建立的补肺丸质量控制方法尚存在不足，有待进一步完善，本研究建立的方法以期为补肺丸质量标准提供参考。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Quality assessment of Bufei Pills by UPLC fingerprinting,determination of chemical markers,and chemometric

SU Yu1 ZHU Xujiang2 YANG Pengwei2 LI Chunhong1 WANG Yongmei1

1.Gansu University of Chinese Medicine,Gansu Province,Lanzhou 730000,China;2.Gansu Institute for Drug Control/NMPA Key Laboratory for Quality Control of Traditional Chinese Medicine,Gansu Province,Lanzhou 730070,China

[Abstract] Objective To establish the ultra-performance liquid chromatography (UPLC) fingerprinting method for Bufei Pills and for determining the content of four chemical components,and to apply chemical pattern recognition for the quality evaluation of multiple batches of the product.Methods The UPLC method was developed to establish the fingerprint of Bufei Pills.The resulting chromatograms were analyzed using the “Traditional Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System”(2012 edition)to identify common peaks and evaluate similarity.Fifteen batches of Bufei Pills were evaluated through cluster analysis,principal component analysis,and orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis.Additionally,the contents of calycosin-7-glucoside,schisandrin,schisanhenol,and γ-schisandrin were simultaneously determined.Results The UPLC fingerprints of 15 batches of Bufei Pills were established,revealing 11 common peaks,with similarity ranging from 0.974 to 0.998.Chemical pattern recognition classified the 15 batches into two categories.One principal component was obtained with a cumulative variance contribution rate of 97.797%,and three markers responsible for quality variations were identified.The four analytes showed good linear relationships within their respective concentration ranges (r≥0.984 8).The recovery rates for calycosin-7-glucoside,schisandrin,schisanhenol,and schisandrin B were 96.001 04%-103.997 30%,98.915 60%-104.564 76%,97.104 06%-103.953 44%,and 95.285 36%-103.373 53%,with RSD of 3.16%,1.68%,2.73%,and 2.60%(n=9),respectively.The content ranges of the four chemical components in the 15 batches were 0.019 3-0.027 4,0.215 8-0.268 0,0.060 6-0.069 9 mg/g,and 0.075 5-0.094 5 mg/g,respectively.Conclusion The established UPLC fingerprinting and content determination methods for Bufei Pills are simple,accurate,and reproducible,providing a reliable reference for the quality control of Bufei Pills.

[Key words] Fingerprint;Chemometrics;Content determination;Bufei Pills

[中图分类号] R917

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）12（c）-0019-07

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.36.04

[基金项目] 国家药品标准制修订研究课题（2022Z038）。

[作者简介] 苏燏（2001-），女，甘肃中医药大学药学院2023级中药学专业在读硕士研究生；研究方向：中药药效物质与质量评价。

[通讯作者] 朱旭江（1968-），女，博士，硕士生导师，主任药师；研究方向：中药药效物质与质量评价。

（收稿日期：2025-08-06）

（修回日期：2025-10-07）