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复方硫酸软骨素片为复方制剂，处方中包含硫酸软骨素、附子（制）、白芍、甘草浸膏[1]。硫酸软骨素具有促进软骨合成代谢、活血止疼、祛寒除湿的作用[2-3]。附子具有调节血糖代谢、治疗心血管疾病、调节免疫、抗肿瘤、调节神经、抗炎、抗氧化、保护肾脏等作用[4-5]。白芍在保肝、抗肝纤维化、抗炎、镇痛、抗抑郁、降血糖、心血管保护、抗氧化、调节免疫及抗肿瘤等方面具有较好的药理活性[6]。复方硫酸软骨素片处方中白芍用70%乙醇回流提取，提取液浓缩成浸膏后制片[7]。白芍含有多种化学成分，白芍浸膏中的主要成分是芍药苷，芍药苷为白芍药理作用的主要活性成分[8-10]。甘草浸膏作为原料药被广泛用于化学及中药复方制剂中，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等药理作用，其主要成分为甘草酸和甘草酸铵[11]。该复方制剂用于风湿、类风湿性关节炎、肩周炎、类软骨炎及血管神经性偏头痛[7]。现行法定标准仅通过紫外分光光度法测定硫酸软骨素含量及通过薄层色谱法检查乌头碱限度，并未包含白芍浸膏及甘草浸膏有效成分含量测定项，不能有效控制该制剂的质量。《中华人民共和国药典》[12]2020版一部对甘草浸膏中有效成分甘草苷及甘草酸均有相应的限度要求，且芍药苷为白芍的主要有效成分，因此需建立同时测定此3种成分的方法，对该制剂质量加以控制。故本研究采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定复方硫酸软骨素片中芍药苷、甘草苷及甘草酸铵的含量，同时建立芍药苷的转移率模型。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；XS205DU十万分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；Milli-Q Integal 5超纯水器（德国Millipore公司）；SK5200HP超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）；R-215旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）。

芍药苷对照品（批号：110736-201943，纯度：95.1%）、甘草苷对照品（批号：111610-201908，纯度：95.0%）、甘草酸铵对照品（批号：110731-202021，纯度：96.2%）均购自中国食品药品检定研究院；试剂乙腈（HPLC级，美国Merck公司）；HPLC级磷酸（批号：E2029081，阿拉丁）；无水乙醇（批号：2101073610，安徽安特食品股份有限公司）；甘草片（批号：20201001，浙江佐力百草中药饮片有限公司）；附片（黑顺片）（批号：2210051，浙江华宇药业股份有限公司）；硫酸软骨素（猪）（批号：C14600478，麦克林化学试剂有限公司）；超纯水（自制）；64批次复方硫酸软骨素片来自3个厂家（样品来源覆盖生产和经营单位），10批次白芍药材（来源于饮片公司、药店和网络）信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：岛津C18，150 L×4.6 nm；流速：1 ml/min；柱温：30 ℃；波长：235 nm，进样量：10 μl；流动相：A为乙腈，B为0.1%磷酸，梯度洗脱。洗脱程序：0～15 min流动相A比例为15%～50%，15～16 min流动相A比例为50%～90%，16～18 min流动相A比例为90%，18～19 min流动相A比例为90%～15%，19～22 min流动相A比例为15%。

2.2 多指标成分含量的测定

2.2.1 对照品储备溶液制备称取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得相应浓度的对照品储备溶液。对照品储备液配制见表2。

2.2.2 标准系列溶液的制备分别精密吸取芍药苷对照品储备溶液2 ml，甘草苷对照品储备溶液0.65 ml，甘草酸铵对照品储备溶液4.35 ml，置于同一10 ml的容量瓶中用70%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，作为对照品工作液。分别吸取对照品工作液0、0.5、1.0、2.5、5.0 ml分别置于10 ml容量瓶中，用70%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，即得相应浓度的标准系列溶液。

2.2.3 样品溶液制备取样品10片，去除糖衣，精密称定，研细，分别精密称取约5片，置于150 ml锥形瓶中，分别精密加入70%乙醇溶液20 ml，称定重量，超声提取30 min，放冷，用70%乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。

2.2.4 阴性样品溶液制备按照复方硫酸软骨素片处方中各药材比例及制法，制备缺白芍及甘草浸膏的阴性样品，按“2.2.3”项下方法制备缺白芍及甘草浸膏的阴性样品溶液，典型色谱图见图1。

2.2.5 标准曲线和线性范围取“2.2.2”项下标准系列溶液，按“2.1”项下条件进行测定，以化合物峰面积值Y对质量浓度X（mg/ml）进行线性回归，结果芍药苷线性范围为0.018 6～0.372 8 mg/ml，回归方程为Y=13 825X-8.462，相关系数r为0.999 5；甘草苷线性范围为0.005 025～0.100 500 mg/ml，回归方程为Y=23 284X-2.672 8，相关系数r为0.999 5；甘草酸线性范围为0.04 394～0.8 788 mg/ml，回归方程为Y=4 938.2X-12.952，相关系数r为0.999 1。

2.2.6 精密度与重复性精密吸取“2.2.1”项下的对照品储备液适量，置10 ml容量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，即得芍药苷浓度为0.093 21mg/ml、甘草苷浓度为0.077 28 mg/ml、甘草酸浓度为0.351 6 mg/ml的对照品溶液，按“2.1”项下条件重复进行6次测定，以化合物峰面积值计算RSD，芍药苷、甘草苷、甘草酸的RSD分别为0.79%、、0.73%、1.65%，提示仪器的精密度良好。

取61号样品，按“2.2.3”项下的方法平行制备6份样品溶液，按“2.1”项下条件进行测定，以化合物峰面积值计算RSD，芍药苷、甘草苷、甘草酸的RSD分别为0.84%、1.25%、1.09%，提示芍药苷、甘草苷、甘草酸的重复性良好。

2.2.7 加样回收率取61号样品，精密称取约2.5片的样品6份，分别加入“2.2.1”项下的标准储备液适量，按“2.2.3”项下的方法制备样品溶液，按“2.1”项下条件进行测定，以化合物峰面积值计算回收率，见表3。

2.2.8 稳定性取61号样品，按“2.2.3”项下的方法制备样品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h按“2.1”项下条件进行测定，以化合物峰面积值计算RSD，芍药苷、甘草苷、甘草酸的RSD分别为1.61%、0.60%、1.49%，提示供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.9 耐用性取61号样品，按“2.2.3”项下的方法制备样品溶液，除色谱柱为AgilentZORBAXSBC18，5μm，4.6 mm×150 mm外，其余条件同“2.1”项下进行测定。供试品色谱图中3个主要成分同相邻杂质分离度均大于1.5，芍药苷、甘草苷、甘草酸的RSD分别为1.41%、0.56%、1.21%，提示方法耐用性良好。

2.2.10 样品测定取64份样品，按“2.1”项下条件进行测定。在相同试验条件下，样品中色谱峰保留时间与标准品保留时间一致，测定结果见表4。

2.3 芍药苷转移率测定

2.3.1 自制成药方法按处方制法取相应量的附子（制）粉碎，加水（用盐酸调节pH值至3～4）湿润，再加2倍量的上述水煎煮2次，每次煮沸30 min，合并煎液，浓缩。用75%乙醇提取两次，放置过夜，滤过，合并滤液，减压浓缩至膏的重量约为原药材量的1/10；另按表1序号取白芍药材粉碎，加70%乙醇湿润，静置过夜，加相当于药材两倍量的70%乙醇回流提取2 h，滤过，滤渣再加一倍量的70%乙醇回流1 h，滤过，合并二次提取液，减压浓缩至膏的重量约为药材量的1/5。将上述两种浸膏、甘草浸膏与硫酸软骨素加适量赋形剂，压片，包糖衣，即得。共制备序号为1～10实验室自制复方硫酸软骨素片（以下简称“自制成药”）。

2.3.2 样品测定色谱条件见“2.1”项下，对照品溶液的配制、自制成药供试品溶液的配制见“2.2”项下。白芍药材供试品溶液的制备：取白芍药材适量，粉碎，称取药材粉末0.1 g，置于150 ml锥形瓶中，分别精密加入70%乙醇溶液20 ml，称定重量，超声提取30 min，放冷，用70%乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液。测定结果见表5。

3 讨论

复方硫酸软骨素片现行法定标准甘草浸膏处方投料量为20 g制成1 000片。《中华人民共和国药典》[12]2020年版一部，甘草浸膏项下，对甘草苷及甘草酸有相应的限度要求，规定甘草苷不得少于0.5%，甘草酸不得少于7.0%。64批次样品甘草苷的含量为0.61%～0.87%，均大于0.5%，甘草酸含量为7.00%～9.43%，均不少于7.0%。故64批次样品处方中所添加的甘草浸膏均符合规定。

64批次样品芍药苷的含量范围为0.188 1～0.928 2 mg/片。不同厂家，芍药苷含量存在较大差别。近年来的研究仅对复方硫酸软骨素片中的3种成分的含量进行测定，样本量小，且并未对不同厂家芍药苷含量差异较大进行进一步研究。故本研究进一步测定计算芍药苷从白芍到制成成药的转移率。通过对所收集的白芍药材芍药苷含量进行测定可知，10批次白芍药材中芍药苷含量均符合《中华人民共和国药典》[12]2020年版一部，白芍项下芍药苷限度（1.6%）要求。按复方硫酸软骨素片处方制法中投料量计算，10批次自制成药芍药苷转移率为64.13%～74.60%，平均转移率为70.14%，标准偏差为3.76%。以芍药苷平均转移率-2×标准偏差=62.61%为芍药苷从白芍药材到自制成药的转移率。收集到的10批次白芍药材芍药苷含量均符合《中华人民共和国药典》[12]2020年版一部要求，从药材到自制成药后，芍药苷转移率均大于62.61%，符合芍药苷转移率模型。

成方制剂是多种药材配伍后经特定工艺制成的，芍药苷从白芍药材转移到制剂中的转移率是影响制剂药效的关键因素之一。转移率高，意味着制剂中芍药苷的含量相对较高；转移率低或不稳定，则可能导致制剂中芍药苷含量不足或波动较大，进而影响药效的稳定性和有效性。若白芍原药材中芍药苷含量达标，生产企业由于药材投料量或制备工艺导致的芍药苷转移率过低，也无法保证制剂中芍药苷含量。鉴于芍药苷含量及转移率与药效之间的密切联系，对其进行质量控制是保证成方制剂药效的重要手段。上述芍药苷转移率模型可有效评估生产企业白芍药材的质量、投料及制备工艺情况。

本研究建立HPLC法同时测定复方硫酸软骨素片中芍药苷、甘草苷和甘草酸的含量，方法简便、快捷、准确，可用于复方硫酸软骨素片中3种成分的高通量分析；芍药苷转移率模型的建立可有效评估生产企业白芍药材的质量、投料及制备工艺情况。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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【作者机构】	浙江省温州市食品药品检验科学研究院
【分类号】	R284.1
【基金】	浙江省温州市科研项目（Y20240390、N20240024）浙江省市场监督管理局科技计划项目（ZC2023072）。

基于多组分含量测定及芍药苷转移率模型的复方硫酸软骨素片的质量评价

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