田七花叶颗粒是以名贵中药材三七花和三七叶茎为主要原料，经提取、浓缩、干燥、制粒等现代工艺精制而成的中药制剂[1]。其具有清热凉血、平肝潜阳之功效，临床上常用于血热所致疮疖及肝热引起的心悸、烦燥、眩晕、头痛、失眠等症，也可作为肝热型高血压的辅助治疗[2]。

微生物污染不仅可能导致药品中有效成分降解，还存在引发严重不良反应的风险，直接影响药品的安全性、有效性及质量稳定性，对患者健康构成潜在威胁[3]。因此，开展微生物限度检查对监测药品微生物污染、保障药品整体质量安全具有重要意义。

作为云南特色中成药，七花叶颗粒的生产企业多集中于省内[4]。为更科学评估该制剂的微生物污染状况，须建立适宜的微生物限度检查方法[5]。本研究根据现行《中华人民共和国药典》[6]、《中国药典分析检测技术指南》[7]等相关要求，对云南省内6家药品生产企业共16批田七花叶颗粒进行微生物限度检查方法的适用性研究，旨在排除检验条件与操作程序对检查结果的干扰，建立一种简便高效、准确可靠、切实可行的检测方法，为该产品的微生物监控和质量提升提供技术支持。

1 材料

1.1 仪器

Scout SE602FZH型百分之一电子天平[奥豪斯仪器（常州）有限公司]；BHC-1300A2型生物安全柜（苏州净化设备有限公司）；MLS-3781L-PC型高压蒸汽灭菌器[松下健康医疗器械（上海）有限公司]和HPP260型恒温恒湿培养箱[美墨尔特（上海）贸易有限公司]。

1.2 供试品

选取云南省内6家药品生产企业（编号A～F）共计16批产品，分别取3批或1批开展该制剂微生物限度检查方法的适用性研究。

1.3 检定菌

工作菌株（Ⅳ代、1.0×106～2.0×106 CFU/粒）：黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC（F）98 003〕（批号：200715）、白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F）98001〕（批号：200629）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63501〕（批号：200818）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B）26003〕（批号：200610）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC（B）10104〕（批号：200715）均购自北京三药科技开发公司；标准菌株：大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44 102]冻干菌株购自中国食品药品检定研究院。使用前经纯度和特性确认，上述菌株符合规定要求。

1.4 培养基

胰酪大豆胨液体培养基（tryptic soy broth，TSB）（批号：1101555）、胰酪大豆胨琼脂培养基（tryptic soy agar，TSA）（批号：1102851）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（sabouraud dextrose agar，SDA）（批号：1097725）、麦康凯液体培养基（Macconkey Broth，MacB）（批号：1096825）和pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：1075535）购自广东环凯微生物科技有限公司。麦康凯琼脂培养基（Macconkey Agar，MacA）（批号：190902）购自北京陆桥技术股份有限公司。经适用性检查结果显示，上述培养基的指示特性、促生长能力和抑制能力等项目均符合规定要求。

2 方法与结果

2.1 试验菌液制备

按照供应商提供的使用说明和现行《中华人民共和国药典》[6]（四部）相关要求，制备相应试验菌液，并采用TSB培养基将其浓度梯度稀释至终浓度为103～104 CFU/ml。

2.2 制备供试液

从同一批次产品中随机抽取3个以上独立市场销售包装，无菌操作条件下称取10 g样品，置于无菌匀浆杯中。向匀浆杯加入适量TSB培养基至总体积100 ml，以6 000 r/min处理匀浆1 min，至样品分散均匀，即得1∶10（g/ml）供试液。随后采用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液对供试液进行梯度稀释，备用。

2.3 计数方法适用性试验

2.3.1 试验组 取适宜稀释级别的供试液5份，每份10 ml，分别加入0.1 ml相应试验菌液，涡旋混匀充分后，使试验菌终浓度不超过100 CFU/ml。分别取混合液1 ml加入直径90 mm的无菌平皿中，倾注适量相应培养基，混匀待凝固后，按照规定条件倒置培养。定期观察平板上菌落生长情况，计数并报告[8]。每株试验菌在每稀释级别下每种培养基平行制备3个平皿。

2.3.2 对照组 按照现行《中华人民共和国药典》[6]通则1105，同时参考周昱杉等[8]的研究中“1.2.2微生物计数方法的适用性试验”设置菌液对照组、供试品对照组和阴性对照试验；其余操作步骤及培养条件同试验组。

2.3.3 试验组回收比计算 按照以下公式计算试验组回收率，试验组回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液对照组平均菌落数。

由表1可知，各试验菌株的回收均符合要求，且阴性对照试验未见菌落生长，提示常规法可有效消除供试品的抑菌活性。因此，采用1∶10供试液结合倾注平皿法（1 ml/皿）进行本品微生物计数是可行的，无需额外建立其抑菌活性的中和或去除方法。

表1 微生物计数方法适用性试验考察结果

注TSA：胰酪大豆胨琼脂培养基；SDA：沙氏葡萄糖琼脂培养基。

2.4 控制菌检查方法适用性试验

本制剂为不含药材原粉和脏器提取物的口服制剂，依据现行《中华人民共和国药典》[6]，须开展大肠埃希菌检查。

2.4.1 菌液制备 本研究取适量大肠埃希菌培养物，依照“2.1”项所述方法，制备成浓度为10～100 CFU/ml菌液。

2.4.2 适用性试验 取1∶10供试液10 ml各3份，分别加入100、200和300 ml TSB培养基中，各接入0.1 ml大肠埃希菌液；混匀后，于33 ℃静置培养18 h。取上述预培养物1 ml接种至100 ml MacB培养基中，43℃静止培养24 h。取上述培养物划线接种至MacA平板，33 ℃倒置培养18 h，观察并记录MacA平板上菌落生长情况。若发现MacA平板上有疑似菌落生长，应观察并详细记录菌落特征，随后挑取单菌落进行分离纯化，并依据现行《中华人民共和国药典》[6]指导原则9204相关技术开展进一步鉴定。

2.4.3 对照试验 设置阳性对照试验和阴性对照试验如下：阳性对照试验以TSB培养基替代供试液；阴性对照试验以TSB培养基替代供试液和试验菌液；其余操作同适用性试验[9]。

2.4.4 试验结果 表2可知，适用性试验和阳性对照试验均成功检出相应试验菌，而阴性对照试验无微生物生长，符合规定要求。具体而言，将供试液接种于最小体积（100 ml）TSB培养基中，混匀后按要求培养，即可实现大肠埃希菌的有效富集。因此，直接接种法适用于本品的控制菌检查。

表2 大肠埃希菌检查适用性试验考察结果

注+表示有菌生长；-表示无菌生长；/表示未试验或不涉及。TSB：胰酪大豆胨液体培养基；MacB：麦康凯液体培养基；MacA：麦康凯琼脂培养基。

2.5 供试品检查

采用倾注平皿法（1∶10，1 ml/皿）与直接接种法相结合的方式，对16批次田七花叶颗粒进行微生物限度检查，结果显示所有批次均符合现行《中华人民共和国药典》[6]通则1107项下“不含药材原粉和脏器提取物的口服给药中药固体制剂”的微生物限度要求。具体结果如下：①需氧菌总数计数方面，5批供试品中检出菌落，占总批次的31.25%。菌落数最大值为20 CFU/g，其中81.25%的样品菌落数低于10 CFU/g，6.25%的样品为15 CFU/g，所有结果均远低于标准限定值（103 CFU/g）；②霉菌和酵母菌总数计数中，6批样品有菌落生长，占比37.5%。最高检出值为40 CFU/g，68.75%的样品菌落数小于10 CFU/g，25.0%的样品介于10～20CFU/g，所有结果显著低于标准上限（102CFU/g）；③所有批次均未检出大肠埃希菌（1 g）。

3 讨论

田七花叶颗粒是云南地区特色中药制剂，历经多年临床实践验证，其疗效确切、服用便捷，获得人民群众的广泛认可[2]。现行质量标准虽能满足日常质量控制的基本需求，但由于缺乏定量指标，难以全面反映制剂的内在质量[10]。研究表明，采用高效液相色谱法可对其中人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3进行含量测定，为该制剂中活性成分的定量监控提供方法学基础[1,11]。

微生物限度检查作为药品质量控制体系的重要组成部分，其结果不仅能反映产品的微生物污染状况，也能真实反映生产企业的卫生管理水平[12]。为确保检查结果的准确性和可靠性，规避因外源性污染或漏检导致假阴性或假阳性结果而引起的风险误判，须建立完善的质量保证体系，包括开展方法适用性验证、规范检验流程及加强结果确认[13]。

本研究发现，不同来源的供试品在抑菌活性方面表现出一定差异性，该差异可能与以下因素有关：药材的产地、采收时间、品质等级及炮制方法的不同，生产过程中清洗、干燥、湿热灭菌、所用辅料等工艺条件的波动，以及辐射灭菌等微生物负载控制措施的实施[14-17]。值得注意的是，不同供试品对枯草芽孢杆菌均表现出不同程度的抑制效应，其回收率为0.60～0.79，普遍低于其他试验菌株的回收结果（0.73～1.30），但仍处于可接受范围（0.5～2.0），表明该抑制效应并不影响枯草芽孢杆菌的实际检出能力。这一现象可能与制剂中某些微量活性成分的存在，或多个组分之间的协同抑制效应有关。目前，供试品中作用于枯草芽孢杆菌的具体抑制成分及其作用机制尚未明确，有待进一步深入研究。

在微生物计数部分，本研究严格遵循现行《中华人民共和国药典》[6]（四部）通则1105相关要求进行回收比值计算。根据该通则要求，每一稀释级别应设置两个平行平板，并以其菌落数的平均值作为该稀释级的报告结果，据此进一步计算回收率。若某一稀释级别两个平行平板的菌落数平均值不低于15，则还需满足两者菌落数相差不超过1倍的要求[6,18-19]。因此，在本研究中，回收率系基于《中华人民共和国药典》所规定的双平板均值计算得出，未设置n≥3的独立生物学重复，故未进行均值、标准差及变异系数等统计量计算。

在控制菌检查部分，本研究恪守现行《中华人民共和国药典》[6]（四部）通则1106要求开展相关适用性试验。该版《中华人民共和国药典》在该部分主要侧重于方法的适用性与检出能力，未对方法的最低检出限提出明确要求[20-21]。因此，本研究未就大肠埃希菌的检出限是否符合某项标准另行论述，但已通过系统的方法适用性试验，充分验证了该方法在所有批次供试品中对该目标菌的检出可靠性。

本研究所建立的检查方法操作简便、经济实用，可较好满足当前国内生产企业对该制剂微生物限度检查的实际需求，有助于该制剂质量的有效控制，保障患者用药安全。

通过倾注平皿法进行微生物计数，并结合直接接种法开展控制菌检查，可有效消除本制剂的抑菌活性，避免假阴性结果的出现，确保检查结果的准确性和可靠性。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Exploration on the applicability of microbiological limit test methods for Tianqi Huaye Granules

NIU Jiezhen1 ZHAO Gai2 ZHANG Yuanqing3

1.Center For Food and Drug Inspection of Yunnan Province,Yunnan Province,Kunming 650200,China;2.Kunming Institute for Food and Drug Control,Yunnan Province,Kunming 650032,China;3.the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Yunnan Province,Kunming 650032,China

[Abstract] Objective To establish the applicability of microbiological limit test method for Tianqi Huaye Granules and to investigate the applicability of microbial limit test methods for products from different manufacturers.Methods Conducted in accordance with General Chapters 1105,1106,and 1107 of the Pharmacopoeia of the People’s Republic of China,applicability testing of the microbial limit test methods and microbial limit examinations were performed on sixteen batches of samples from six pharmaceutical manufacturers in Yunnan Province.Results When the pour plate method was employed for microbial enumeration,the antimicrobial activity of the test samples was completely neutralized,the recovery rate of all test strains met the specified requirements(0.5-2.0);for the specified microorganism Escherichia coli,the direct inoculation method was utilized.Conclusion The established microbial limit test method demonstrates characteristics such as simplicity,accuracy and feasibility,making it applicable for routine quality control of the preparation.

[Key words] Tianqi Huaye Granules;Microbiological limit;Method suitability test;Escherichia coli

[中图分类号] R927.1；R921.2

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2025）12（c）-0089-05

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2025.36.15

（收稿日期：2025-08-07）

（修回日期：2025-10-15）