高血压是导致心血管事件的重要危险因素，严重威胁人类健康[1]。然而其发病机制复杂，目前尚未完全明晰。人主动脉平滑肌细胞（human aortic smooth muscle cells，HASMCs）在维持血管功能稳定中起关键作用[2]。炎性衰老是高血压血管病变中决定机体衰老速率的关键因素[3]。血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）在高血压中兼具升压效应及调控细胞衰老和炎症反应。然而，Ang Ⅱ诱导HASMCs炎性衰老的机制仍有待深入研究。本研究拟通过多维度指标检测，明确Ang Ⅱ对HASMCs炎性衰老的调控作用，建立标准化模型，为揭示高血压病的发病机制及寻找潜在治疗靶点提供实验依据。

1 对象与方法

1.1 实验细胞

HASMCs（货号：210B530051）购自上海青旗生物技术有限公司。使用DMEM培养基（货号：11965092，美国赛默飞世尔科技公司）培养，所有细胞均在37 ℃、5%CO2 的培养箱中培养。培养基每48 h更换1次，当细胞生长至培养瓶底面积80%～90%时进行传代。

1.2 主要仪器与试剂

AngⅡ（货号：HY-13948/CS-2280，美国Med Chemexpress生物科技公司）；CCK8（货号：C0038，上海碧云天生物技术有限公司）；细胞衰老β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal）染色试剂盒（货号：C0602，上海碧云天生物技术有限公司）；细胞周期检测试剂盒（货号：MCH100106，德国默克股份有限公司）；BCA定量试剂盒（货号：PC0020，北京索莱宝科技有限公司）；人白细胞介素（interleukin，IL）-6酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（货号：E-EL-H6156，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；人IL-1β ELISA试剂盒（货号：E-EL-H0149，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；人肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（货号：E-EL-H0109，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；RNAsimple总RNA提取试剂盒[货号：DP419，天根生化科技（北京）有限公司]；HiScript Ⅳ All-in-One Ultra RT SuperMix for qPCR（货号：R433，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（货号：Q712，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；p53（货号：60283-2-Ig，武汉三鹰生物技术有限公司）；p21（货号：28248-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司）；p16（货号：10883-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司）；基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）（货号：66366-1-Ig，武汉三鹰生物技术有限公司）；γ-H2AX（货号：YM8195，美国Immunoway生物技术公司）；GAPDH（货号：60004-1-Ig，武汉三鹰生物技术有限公司）；山羊抗兔（货号：A0208，上海碧云天生物技术有限公司）；山羊抗小鼠（货号：A0216，上海碧云天生物技术有限公司）。

细胞培养箱（型号：371，美国赛默飞世尔科技公司）；台式离心机（型号：6-16KS，德国西格玛奥德里奇公司）；制纯水系统（型号：ELIX5，德国默克股份有限公司）；多功能酶标仪（型号：Synergytm H1，美国伯腾仪器有限公司）；倒置相差显微镜（型号：AE2000，麦克奥迪实业集团有限公司）；倒置荧光显微镜（型号：BX61VS，日本奥林巴斯有限公司）；流式细胞仪（型号：Cytomisc FC500，美国贝克曼库尔特有限公司）；透射电镜（型号：H-7650，日本日立公司）；垂直电泳系统[型号：Powerpac Universal，伯乐生命医学产品（上海）有限公司]。

1.3 实验分组及处理

取生长状态良好的HASMCs（6～8代）接种于6孔板，细胞密度为1.2×105 个/ml。本研究共分为6组：空白组及10-8、10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L组。空白组加入完全培养基培养，其余5组加入相应浓度的Ang Ⅱ溶液100 μl，共作用48 h。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 细胞形态变化 采用倒置显微镜观察HASMCs的形态变化。

1.4.2 CCK8法检测细胞活力 每孔加入CCK8试剂孵育2 h，使用多功能酶标仪于450 nm波长处测定吸光度。

1.4.3 划痕实验检测细胞迁移能力 标记笔在每孔背面划1条横线，待细胞铺满孔板后，用枪头垂直于孔板和标记线划两条垂线。将不同浓度Ang Ⅱ作用于HASMCs，放入培养箱中继续培养48 h，于倒置显微镜下观察并拍照。

1.4.4 流式细胞术检测细胞周期比例 各组细胞经PBS洗涤后，采用70%乙醇4 ℃固定过夜，4 ℃下1 500 r/min离心5 min（离心半径为6 cm），弃上清液，取1×105 个细胞重悬于200 μl细胞周期染色工作液，避光孵育20 min后，使用流式细胞仪进行细胞周期分布情况。

1.4.5 SA-β-Gal化学染色法检测SA-β-Gal活性各组细胞经PBS洗涤后，每孔加入1 ml SA-β-Gal染色工作液，于37 ℃无CO2 条件下过夜孵育，使用倒置荧光显微镜观察并拍照记录阳性染色细胞，计算细胞蓝染率。

1.4.6 ELISA法检测细胞炎症因子的表达水平 收集各组细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测IL-6、IL-1β、TNF-α 水平，使用酶标仪在特定波长下测量吸光度值。

1.4.7 RT-qPCR法检测衰老相关mRNA的表达 采用RZ裂解液提取RNA，于冰上按照说明书立即反转为cDNA，按照荧光定量说明书避光加样配置20 μl反应体系：2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μl，正、反向引物各0.4 μl，cDNA模板4 μl，并用DEPC水补足至20 μl。扩增条件：95 ℃预变性30 s；40个循环（95 ℃10 s，60 ℃30 s），采用2-ΔΔCt 法计算目的基因的相对表达量。引物信息见表1。

表1 引物信息

注IL：白细胞介素；MMP：基质金属蛋白酶；MCP-1：单核细胞趋化因子-1；TGF-β：转化生长因子-β；PAI-1：纤溶酶原激活物抑制物-1；IFN-β：β 干扰素。

1.4.8 透射电镜观察细胞线粒体结构 各组细胞经预冷PBS洗涤2次后，加入2.5%戊二醛4 ℃固定2 h，PBS洗涤3次，1%锇酸室温固定2 h。经30%～100%梯度乙醇脱水、丙酮置换后，环氧树脂包埋并聚合，超薄切片机切片，铜网承载后经醋酸铀、枸橼酸铅染色。透射电镜下观察细胞线粒体结构。

1.4.9 Western blot法检测衰老相关蛋白的表达采用细胞裂解液冰上裂解细胞，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行定量蛋白浓度。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白，并转印至PVDF膜。用5%脱脂奶粉溶液封闭膜1～2 h后，4 ℃过夜孵育一抗p53（1∶5 000）、p21（1∶1 000）、p16（1∶4 000）、MMP2（1∶2 000）、γ-H2AX（1∶2 000）、GAPDH（1∶10 000）。TBST洗涤3次后，分别孵育抗兔（1∶1 000）或抗小鼠（1∶1 000）二抗，ECL化学发光法检测蛋白条带。

2 结果

2.1 不同浓度Ang Ⅱ对HASMCs形态的影响

空白组生长较快，细胞间连接紧密，呈长条状或梭形、星形或纺锤形；10-8、10-7 mol/L组细胞生长速度轻度减慢，细胞间连接轻度疏松，形态几乎无变化；10-6、10-5、10-4 mol/L组细胞生长速度变慢，细胞质空泡增多，细胞间连接较稀疏，细胞浆内颗粒增加，细胞形状不规则。见图1。

图1 不同浓度Ang Ⅱ对HAS MCs形态的影响（×100）

Ang Ⅱ：血管紧张素Ⅱ；HASMCs：人主动脉血管平滑肌细胞。

2.2 不同浓度Ang Ⅱ对HASMCs增殖能力的影响

与空白组比较，10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L组细胞活力降低（P ＜0.05）。见图2。

图2 不同浓度Ang Ⅱ对HAS MCs增殖能力的影响（n=4）

与空白组比较，aP ＜0.05。Ang Ⅱ：血管紧张素Ⅱ；HASMCs：人主动脉血管平滑肌细胞。

2.3 不同浓度Ang Ⅱ对HASMCs迁移能力的影响

与空白组比较，10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L组细胞划痕愈合率降低（P ＜0.05）。见图3。

图3 不同浓度Ang Ⅱ对HAS MCs迁移能力的影响（n=3）

A：各组细胞划痕光镜图（×100）；B：各组细胞划痕愈合率柱状图。0 h：药物处理初始时刻的细胞划痕形态；48 h：药物处理48 h后的细胞划痕形态。与空白组比较，aP ＜0.05。Ang Ⅱ：血管紧张素Ⅱ；HASMCs：人主动脉血管平滑肌细胞。

2.4 不同浓度Ang Ⅱ对HASMCs周期的影响

与空白组比较，10-8、10-6、10-5 mol/L组G0/G1 期细胞占比升高，10-8、10-6、10-5、10-4 mol/L组S期细胞占比下降，10-7、10-6 mol/L组G2/M期细胞占比降低（P ＜0.05）。见图4。

图4 不同浓度Ang Ⅱ对HASMCs周期的影响（n=3）

与空白组比较，aP＜0.05。Ang Ⅱ：血管紧张素Ⅱ；HASMCs：人主动脉血管平滑肌细胞。

2.5 不同浓度Ang Ⅱ对HASMCsS A-β-G a l活性的影响

与空白组比较，10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L组SA-β -Gal阳性率增加（P ＜0.05）。见图5。

图5 不同浓度Ang Ⅱ对HASMCs SA-β-Gal活性的影响（n=3）

A：各组SA-β-Gal染色光镜图（×400）；B：各组SA-β-Gal阳性率柱状图。与空白组比较，aP＜0.05。Ang Ⅱ：血管紧张素Ⅱ；HASMCs：人主动脉血管平滑肌细胞；SA-β-Gal：β 半乳糖苷酶。

2.6 不同浓度Ang Ⅱ对HASMCs炎症因子表达的影响

与空白组比较，10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L组IL-6水平增加；10-8、10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L组IL-1β、TNF-α 水平增加（P ＜0.05）。见图6。

图6 不同浓度Ang Ⅱ对HASMCs炎症因子表达的影响（n=3）

与空白组比较，aP＜0.05。IL：白细胞介素；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；AngⅡ：血管紧张素Ⅱ；HASMGs：人主动脉血管平滑肌细胞。

2.7 不同浓度Ang Ⅱ对HASMCs衰老相关mRNA表达的影响

与空白组比较，10-6、10-5、10-4 mol/L组IL-1α、β干扰素（interferon-β，IFN-β）、MMP3、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β mRNA表达升高；10-6、10-4mol/L组MCP-1、PAI-1 mRNA表达升高（P＜0.05）。见图7。

图7 不同浓度Ang Ⅱ对HASMCs衰老相关分泌表型mRNA表达的影响（n=3）

与空白组比较，aP＜0.05。IL：白细胞介素；MMP：基质金属蛋白酶；MCP-1：单核细胞趋化因子-1；TGF-β：转化生长因子-β；PAI-1：纤溶酶原激活物抑制物-1；IFN-β：β 干扰素；AngⅡ：血管紧张素Ⅱ；HASMGs：人主动脉血管平滑肌细胞。

2.8 不同浓度Ang Ⅱ对HASMCs线粒体结构的影响

空白组细胞线粒体外膜光滑连续，内膜高度折叠成嵴；10-8、10-7 mol/L组细胞线粒体内膜轻度损伤，嵴轻度缺失；10-6、10-5、10-4 mol/L组细胞线粒体内膜重度损伤，嵴不连续且缩短，出现空泡化。见图8。

图8 不同浓度Ang Ⅱ对HASMCs线粒体结构的影响（×15 000）

AngⅡ：血管紧张素Ⅱ；HASMGs：人主动脉血管平滑肌细胞。

2.9 不同浓度Ang Ⅱ对HASMCs衰老相关蛋白表达的影响

与空白组比较，10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L组p53、γ-H2AX、MMP2蛋白表达增加；10-8、10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L组p21蛋白表达增加；10-8、10-7、10-6 mol/L组p16蛋白表达增加（P＜0.05）。见图9。

图9 不同浓度Ang Ⅱ对HASMCs衰老相关蛋白表达的影响（n=3）

A：蛋白条带图；B：各组p53蛋白表达柱状图；C：各组p21蛋白表达柱状图；D：各组p16蛋白表达柱状图；E：各组γ-H2AX蛋白表达柱状图；F：各组MMP2蛋白表达柱状图。与空白组比较，aP＜0.05。MMP：基质金属蛋白酶；AngⅡ：血管紧张素Ⅱ；HASMCs：人主动脉血管平滑肌细胞。

3 讨论

高血压病是典型的血管衰老相关疾病，其病理过程伴有血管重构、老化及炎症反应，HASMCs功能异常是高血压血管重构的核心环节[4-5]。细胞划痕愈合率降低，诱导线粒体损伤，导致能量代谢紊乱，进而诱发细胞衰老；MMP2、MMP3表达增加，导致细胞外基质降解增强，加速血管纤维化进程，与MCP-1介导的单核/巨噬细胞招募共同塑造了血管壁慢性炎症与重塑的微环境；同时，抑制HASMCs增殖，DNA损伤标志物γ-H2AX表达上调，推动炎性衰老进程，进一步激活p53/p21和p16/Rb衰老相关信号通路，引起细胞周期阻滞并促进衰老相关分泌表型的产生[6-12]。炎症信号与衰老相关分泌表型之间存在着动态交互关系，炎症因子升高可增强SA-β-Gal活性[13]。

综上所述，本研究通过多指标、多维度检测发现，10-6 mol/L Ang Ⅱ在维持细胞基本状态的前提下，可诱导线粒体损伤，激活p53/p21与p16/Rb通路，引起细胞周期阻滞及衰老相关分泌表型的生成，成功诱导HASMCs炎性衰老模型，为高血压血管衰老机制的研究提供了可靠工具。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

[1]HENGEL F E，SOMMER C，WENZEL U.Arterial hypertension[J].Dtsch Med Wochenschr，2022，147（7）：414-428.

[2]AJAY A K，ZHU L J，ZHAO L，et al.Local vascular Klotho mediates diabetes-induced atherosclerosis via ERK1/2 and PI3-kinase-dependent signaling pathways[J].Atherosclerosis，2024，396：118531.

[3]FRANCESCHI C，BONAF M，VALENSIN S，et al.Inflammaging.An evolutionary perspective on immunosenescence[J].Ann N Y Acad Sci，2006，908（1）：244-254.

[4]DEUSSEN A，KOPALIANI I.Targeting inflammation in hypertension [J].Curr Opin Nephrol Hypertens，2023，32（2）：111-117.

[5]苏洁，俞静静，颜美秋.基于主动脉Ang Ⅱ/AT1通路研究蒙花苷对高血压血管重构的影响[J].中草药，2019，50（20）：5003-5010.

[6]WANG M，MONTICONE R E，MCGRAW K R.Proinflammation，profibrosis，and arterial aging[J].Aging Med（Milton），2020，3（3）：159-168.

[7]MAS-BARGUES C，ROMÁN-DOMI＇NGUEZ A，SANZ-ROS J，et al.Bcl-xL overexpression in T cells preserves muscle mitochondrial structure and function and prevents frailty in old mice[J].Sci Adv，2025，11（12）：eadr1378.

[8]OGRODNIK M，CARLOS ACOSTA J，ADAMS P D，et al.Guidelines for minimal information on cellular senescence experimentation in vivo[J].Cell，2024，187（16）：4150-4175.

[9]CALCINOTTO A，KOHLI J，ZAGATO E，et al.Cellular senescence：aging，cancer，and injury[J].Physiol Rev，2019，99（2）：1047-1078.

[10]BEAUSÉJOUR C M，KRTOLICA A，GALIMI F，et al.Reversal of human cellular senescence：roles of the p53 and p16 pathways[J].EMBO J，2003，22（16）：4212-4222.

[11]BAO H，CAO J，CHEN M，et al.Biomarkers of aging[J].Sci China Life Sci，2023，66（5）：893-1066.

[12]FU T E，ZHOU Z.Senescent cells as a target for anti-aging interventions：from senolytics to immune therapies[J].J Transl Int Med，2025，13（1）：33-47.

[13]LI X，LI C，ZHANG W，et al.Inflammation and aging：signaling pathways and intervention therapies [J].Signal Transduct Target Ther，2023，8（1）：239.

Establishment and evaluation of an in vitro inflammatory senescence model of human aortic smooth muscle cells

CUI Meiyu1 ZHOU Lingfeng1 FU Yingkun2 LEI Yan1 YANG Jing1

1.Experimental Research Center,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;2.Department of Geriatrics,Guanganmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100053,China

[Abstract] Objective To investigate the intervention effect of angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) on inflammatory senescence of human aortic smooth muscle cells (HASMCs) and establish a standardized model.Methods HASMCs were divided into blank group and 10-8,10-7,10-6,10-5 mol/L,and 10-4 mol/L groups.The blank group was cultured in complete medium,while the other five groups were added with 100 μl of Ang Ⅱsolution of corresponding concentration,and the action lasted for 48 hours.Cell morphology was observed using an inverted microscope;cell viability was detected by CCK8 method;the scratch test was used to detect the migration ability of cells;cell cycle ratio was detected by flow cytometry;the chemical staining of senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) was used to detect the activity of SA-β-Gal;the expression levels of inflammatory factors in cells were detected by enzyme-linked immunosorbent assay;the expression of aging-related mRNA was detected by RT-qPCR;the morphological changes of cell mitochondria were observed by transmission electron microscopy,and the expression of aging-related proteins was detected by Western blot.Results The cells in the blank group were closely connected,presenting as long strip-shaped,spindle-shaped,star-shaped or spindle-shaped;the outer membrane of mitochondria was smooth and continuous,and the inner mitochondrial membrane was highly folded into cristae.The intercellular connections in the 10-8 and 10-7 mol/L groups were slightly loose,and the morphology remained almost unchanged;mild damage to the inner mitochondrial membrane and mild absence of the cristae.The intercellular connections in the 10-6,10-5 mol/L,and 10-4 mol/L groups were relatively sparse,and the cell shapes were irregular;severe damage to the inner mitochondrial membrane,discontinuous and shortened cristae.Compared with the blank group,the cell viability and scratch healing rate in the 10-7,10-6,10-5 mol/L,and 10-4 mol/L groups decreased,the positive rate of SA-β-Gal increased,and the interleukin(IL)-6 level increased(P＜0.05).Compared with the blank group,the proportion of G0/G1 phase cells in the 10-8,10-6 mol/L,and 10-5 mol/L groups increased,the proportion of S phase cells in the 10-8,10-6,10-5 mol/L,and 10-4 mol/L groups decreased,and the proportion of G2/M phase cells in the 10-7 mol/L and 10-6 mol/L groups decreased (P＜0.05).Compared with the blank group,the levels of IL-1β and tumor necrosis factor-α in the 10-8,10-7,10-6,10-5 mol/L,and 10-4 mol/L groups increased (P＜0.05).Compared with the blank group,the expressions of IL-1α,interferon-β,matrix metalloproteinase（MMP）3，and transforming growth factor-β mRNA in the 10-6,10-5 mol/L and 10-4 mol/L groups increased;and the expressions of MCP-1 and PAI-1 mRNA in the 10-6 mol/L and 10-4 mol/L groups increased (P＜0.05).Compared with the blank group,the expressions of p53,γ-H2AX,and MMP2 protein in the 10-8,10-7,10-6 mol/L,and 10-5 mol/L groups increased;the expression of p21 protein increased in the 10-8,10-7,10-6,10-5 mol/L and 10-4 mol/L groups;and the expression of p16 protein increased in the 10-8,10-7 mol/L,and 10-6 mol/L groups (P＜0.05).Conclusion Intervention of HASMCs with 10-6 mol/L Ang Ⅱfor 48 hours is the optimal concentration for inducing a senescence model.This study provides an important theoretical basis for establishing an Ang Ⅱ-induced inflammatory senescence model of HASMCs.

[Key words] Angiotensin Ⅱ;Human aortic smooth muscle cells;Inflammatory senescence;Cell model

[中图分类号] R543.1

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）01（a）-0004-07

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25061499

[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（82074260）；北京市自然科学基金资助项目（7252256）。

[作者简介] 崔美玉（1997-），女，中国中医科学院医学实验中心2023级中西医结合基础专业在读博士研究生，主要从事中医药延缓血管衰老作用机制研究工作。

[通讯作者] 杨静（1980-），女，博士，研究员，博士生导师，主要从事中医药治疗心血管疾病基础研究工作。

（收稿日期：2025-06-23）

（修回日期：2025-10-20）