急性高原缺氧性脑损伤（acute high-altitude hypoxic brain injury，AHHBI）是临床上常见的神经系统疾病，包括高原头痛、急性高山病和高原脑水肿[1]。其病理机制复杂涉及氧化应激、炎症反应、能量代谢障碍等多个环节，且缺乏有效的预防和治疗措施[2]。突触可塑性对于维持神经系统的正常功能至关重要，脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BD NF）是一种重要的神经生长因子，与酪氨酸激酶受体B（tyrosine receptor kinase B，TrkB）结合后可以调节突触可塑性促进神经元存活和分化，改善神经系统功能[3-4]。电针作为传统针刺与现代电刺激结合的非药物疗法，可以促进神经再生、改善脑血流、抑制炎症反应、增强神经可塑性等[5-6]。然而，电针治疗AHHBI强度目前尚未明确。因此，本研究通过低压氧舱构建AHHBI模型，观察不同强度电针对AHHBI突触可塑性的影响，探讨电针治疗AHHBI的作用机制，为临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级8～10周龄雄性C57BL/6J小鼠60只，体质量20～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0006，实验动物使用许可证号：SYXK（青）2021-0002，实验动物合格证号：110011241103735146。常规饲养于青海大学医学院动物房，自由饮水进食，适应1周后开展实验。本研究经青海大学科技伦理委员会审批（PJ202401-24）。

1.2 主要仪器与试剂

主要仪器：低压氧舱（型号：DYC-3000，贵州风雷航空军械有限责任公司）；华佗牌SDZ-Ⅴ型电针仪、华佗牌0.35 mm×13 mm针灸针（苏州医疗用品厂有限公司）；包埋机（型号：BMJ-A，常州郊区中威电子仪器厂）；病理切片机（型号：UC7rt，德国徕卡公司）；漂烘仪（型号：PHY-Ⅲ，常州市中威电子仪器有限公司）；离心机（型号：H2050R，湖南湘仪离心仪器有限公司）；透射电镜[型号：JEM-1400FLASH，日本电子（JEOL）]；制胶仪（型号：T-20，Servicebio）。

主要试剂：苏木精染液[货号：H9627，西格玛奥德里奇（Sigma Aldrich）公司]；伊红染液、甲苯胺蓝（货号：YE2080、JT8570，合肥博美生物科技有限责任公司）；高尔基染色液（货号：G1069，武汉塞维尔生物科技有限公司）；BDNF抗体、TrkB抗体、突触后致密物质-95（postsynaptic density-95，PSD-95）抗体（货号：28205-1-AP、80878-1-AP、20665-1-AP，Proteintech）；β-actin内参抗体（货号：AC026，abclonal）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0009，Beyotime）。

1.3 动物分组与造模方法

动物分组：采用随机数字表法将实验小鼠分为空白对照组、低氧模型组、电针低强度组、电针中强度组、电针高强度组，共5组，每组12只。

造模方法：参考本课题组前期实验造模方法，电针各组在舱外治疗4 d后，第5天将低氧模型组和电针各组放入低压氧舱，模拟6 000 m海拔高原低氧环境72 h，复制AHHBI小鼠模型，期间动物自由饮水、进食，电针各组每天固定时间治疗1次[7]。在造模期间治疗时，实验者由外部进入缓冲舱后关闭大舱门，待缓冲舱升到预设海拔（海拔4 000 m），同时实验舱降到预设海拔，两舱气压平衡后，打开中间舱门进行电针操作，操作结束后实验者回到缓冲舱然后关闭中间舱门，此时实验舱再次平稳升到6 000 m，缓冲舱缓慢降到与舱外海拔一致后大舱门自动打开。氧舱参数设定：升降速度10 m/s，氧分压10.1 kPa，舱内温度（25±2℃），湿度（50±5%）。空白对照组置于舱外（海拔2 260 m）环境条件下正常饲养，自由饮水、进食。

1.4 治疗方法

电针各组：将小鼠头顶部剃毛，然后置于小鼠固定装置上，针刺小鼠“百会”“四神聪”，穴位定位参考《实验针灸学》[8]，百会穴位于头部顶骨正中，四神聪穴位于头部顶骨正中前后左右各旁开2 mm[9]。针灸针选用0.35 mm×13 mm。进针时百会穴向后斜刺，四神聪穴向百会穴方向斜刺，进针约2 mm。进针后针柄末端连接SDZ-Ⅴ型电针仪，选择疏密波（疏波工作5 s，密波工作10 s），频率20/100 Hz（疏波频率∶密波频率=1∶5），在电针仪调节强度（档）处设置电针低、中、高强度组分别为5、10、15，负载在250 Ω 下电针低、中、高强度组输出电流强度分别为0.2、0.6、0.9 mA，20 min/次，1次/d，连续7 d[10]。

正常对照组和低氧模型组：每天只进行电针各组同等条件的抓取，不进行其他干预。

1.5 标本采集

实验结束后，将实验组小鼠从氧舱内取出，脱颈处死小鼠，于冰上剥离脑组织，用冰的PBS清洗3次，去除血液和其他杂质，之后用滤纸吸干。每组取3只小鼠全脑组织固定于10%多聚甲醛溶液，3只小鼠海马组织固定于2.5%戊二醛溶液，3只小鼠海马组织固定于高尔基溶液，并制作病理切片。其余3只小鼠海马组织固定于冻存管中，移入-80℃冰箱保存。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 HE染色观察小鼠海马细胞形态 组织样本放入包埋盒中，脱水、透明化，石蜡包埋并切片，切片厚度4 μm。将石蜡切片依次用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各20 min，梯度乙醇（95%→85%→75%）脱水各5 min，苏木精染色5～10 min，分化、返蓝、冲洗，伊红染色3 min，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，在400倍光学显微镜下观察并采集图像。

1.6.2 尼氏染色观察小鼠海马神经元形态和数量 石蜡切片脱蜡、脱水（同HE染色），甲苯胺蓝染色2～3 min，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，在400倍光学显微镜下计数并采集图像。

1.6.3 透射电镜观察小鼠海马突触超微结构 组织样本经2.5%戊二醛和1%四氧化锇双重固定后，通过丙酮梯度脱水、Epon-812环氧树脂梯度渗透及梯度升温（37 ℃预聚合24 h，60 ℃固化48 h）包埋，切片机切取60～90 nm切片，将切片用醋酸铀染色10～15 min后，再用柠檬酸铅染色1～2 min，在50 000倍透射电镜下观察并采集图像。

1.6.4 高尔基染色观察小鼠海马树突棘形态和密度组织样本在26 ℃避光染色14 d并定期更换染液，染色完成后组织样本梯度乙醇脱水、二甲苯透明，将样本切成60 μm厚的切片，切片经显影液处理30 min后水洗，甘油明胶封片。在1 000倍光学显微镜下采集图像，并计算每10 μm的树突棘密度，计算公式为树突棘密度=树突棘数量/树突长度×10。

1.6.5 Western blot法检测小鼠海马组织BDNF、TrkB、PSD-95蛋白表达 取小鼠海马组织于EP管中，加入裂解液，低温研磨后于4 ℃下12 000 r/min离心10 min，收集上清液。采用BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液，沸水浴煮沸变性。配制10%SDS-PAGE分离胶与5%浓缩胶，上样后分阶段电泳。电泳结束后，采用湿法转膜。转膜后将PVDF膜放入用TBST Buffer稀释的5%脱脂奶粉中封闭。一抗4 ℃孵育过夜，BDNF（1∶2 000）、TrkB（1∶5 000）、PSD-95（1∶2 000）、及内参β-actin（1∶50 000）次日TBST洗膜3次（每次10 min），加入HRP标记山羊抗兔二抗（1∶8 000），室温摇床孵育1 h。ECL化学发光显影后使用Image J软件进行分析。

1.6.6 RT-qPCR法检测小鼠海马组织BDNF、TrkB、PSD-95 mRNA表达 取小鼠海马组织于EP管中，加入裂解液，研磨离心后严格按照RNA提取试剂盒说明书提取RNA，分光光度计检测RNA纯度，逆转录成cDNA。以cDNA为模板，采用TB Green法进行RTqPCR检测，反应体系如下：TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）10.0 μl，Forward Primer（10 μmol/L）0.8 μl，Reverse Primer（10 μmol/L）0.8 μl，Template cDNA 2.0 μl，ddH2O 6.4 μl，总体积20.0 μl。反应程序设置：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸并采集荧光10 s，共45个循环。以β-actin作为内参基因，采用2-△△ct 法计算目标基因mRNA的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

注BDNF：脑源性神经营养因子；TrkB：酪氨酸激酶受体B；PSD-95：突触后致密物质-95。

1.7 统计学方法

采用SPSS 28.0统计学软件进行数据分析，GraphPad Prism 10.1.2软件绘制统计柱状图。计量资料采用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，满足方差齐性，进一步两两比较采用LSD-t检验，不满足方差齐性则采用Tamhane’s T2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠海马细胞形态比较

空白对照组海马神经元排列整齐，细胞形态清晰，核大而圆，核仁明显。与空白对照组比较，低氧模型组海马神经元排列紊乱呈散在分布，椎体细胞数量减少。与低氧模型组比较，电针各组海马神经元损伤均得到改善，其中电针低强度组海马神经元排列紊乱得到改善，局部有少量神经元胞体皱缩；电针中、高强度组海马神经元排列整齐，海马区域局部神经纤维溶解，可见空泡形成，损伤较轻。见图1。

图1 各组小鼠海马细胞形态比较（HE染色，×400）

红色箭头示神经元，绿色箭头示神经纤维。

2.2 各组小鼠海马神经元形态和数量比较

空白对照组海马神经元结构完整，排列整齐，神经元数量较多无明显丢失。与空白对照组比较，低氧模型组海马神经元排列疏松，神经元数量减少（P＜0.01）。与低氧模型组比较，电针中、高强度组神经元数量增加（P＜0.05）。见图2、3。

图2 各组小鼠海马神经元形态比较（尼氏染色，×400）

红色箭头示神经元。

图3 各组小鼠海马神经元数量比较（n=3）

与空白对照组比较，aaP＜0.01；与低氧模型组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01。

2.3 各组小鼠海马突触超微结构比较

空白对照组海马突触前膜、突触后膜、突触间隙清晰可见，前膜内含有丰富的突触小泡。与空白对照组比较，低氧模型组海马突触间隙变窄模糊，前膜内突触小泡大量减少。与低氧模型组比较，电针低、中、高强度组突触间隙较清晰，前膜内突触小泡增多，突触超微结构均得到改善，其中电针高强度组改善效果显著。见图4。

图4 各组小鼠海马突触超微结构比较（透射电镜，×50 000）

绿色箭头示突触前膜，蓝色箭头示突触后膜，红色圆圈示突触间隙，黄色圆圈示突触小泡。

2.4 各组小鼠海马树突棘形态和密度比较

与空白对照组比较，低氧模型组海马树突棘密度降低（P＜0.05）。与低氧模型组比较，电针高强度组海马树突棘密度升高（P＜0.05）。与电针低强度组比较，电针高强度组海马树突棘密度升高（P＜0.05）。见图5、6。

图5 各组小鼠海马树突棘形态比较（高尔基染色，×1 000）

红色箭头示树突棘。

图6 各组小鼠海马树突棘密度比较（n=3）

与空白对照组比较，aP＜0.05；与低氧模型组比较，bP＜0.05；与电针低强度组比较，cP＜0.05。

2.5 各组小鼠海马组织BDNF、TrkB、PSD-95蛋白表达比较

与空白对照组比较，低氧模型组海马组织BDNF、TrkB、PSD-95蛋白表达水平降低（P＜0.01）。与低氧模型组比较，电针中强度组海马组织TrkB、PSD-95蛋白表达水平升高（P＜0.01）；与低氧模型组比较，电针高强度组海马组织BDNF、TrkB、PSD-95蛋白表达水平升高（P＜0.01）。与电针低强度组比较，电针中强度组海马组织TrkB、PSD-95蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与电针低强度组比较，电针高强度组海马组织BDNF、TrkB、PSD-95蛋白表达水平升高（P＜0.01）。与电针中强度组比较，电针高强度组海马组织BDNF、TrkB蛋白表达水平升高（P＜0.05）。见图7。

图7 各组小鼠海马组织BDNF、TrkB、PSD-95蛋白表达比较（n=3）

与空白对照组比较，aaP＜0.01；与低氧模型组比较，bbP＜0.01；与电针低强度组比较，cP＜0.05，ccP＜0.01；与电针中强度组比较，dP＜0.05。BDNF：脑源性神经营养因子；TrkB：酪氨酸激酶受体B；PSD-95：突触后致密物质-95。

2.6 各组小鼠海马组织BDNF、TrkB、PSD-95 mRNA表达比较

与空白对照组比较，低氧模型组海马组织BDNF、TrkB、PSD-95 mRNA表达量降低（P＜0.05）。与低氧模型组比较，电针中强度组海马组织BDNF、PSD-95 mRNA表达量升高（P＜0.05）；与低氧模型组比较，电针高强度组海马组织BDNF、TrkB、PSD-95 mRNA表达量升高（P＜0.05）。与电针低强度组比较，电针高强度组海马组织TrkB、PSD-95 mRNA表达量升高（P＜0.05）。见图8。

图8 各组小鼠海马组织BDNF、TrkB、PSD-95 mRNA表达比较（n=3）

与空白对照组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01；与低氧模型组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01；与电针低强度组比较，cP＜0.05。BDNF：脑源性神经营养因子；TrkB：酪氨酸激酶受体B；PSD-95：突触后致密物质-95。

3 讨论

AHHBI在中医理论体系中归属于“头痛”“眩晕”的范畴，其核心病机为高原清气匮乏致宗气不足，气不运血而血滞成瘀，瘀阻脑络致脑髓失养[11-12]。《灵枢·脑论》曰“脑为髓之海，其输在上于盖，在下亦通于脑”。百会、四神聪两穴与脑部密切相关，都位于巅顶。百会穴隶属于督脉，是阳气聚集之处；四神聪穴属经外奇穴，前后两穴位于督脉循行线上，左右两穴毗邻足太阳膀胱经，督脉可“上额交巅，入络于脑”，两穴合用可升阳举陷、醒脑开窍、滋养脑髓[13]。有研究表明，电针百会、四神聪穴可显著减少脑梗死体积和神经元凋亡率，减轻脑损伤[14]。因此，本研究选取百会和四神聪穴作为治疗穴位，并探究电针百会、四神聪穴对AHHBI的影响及作用机制。

突触具有动态结构，超微结构改变是影响突触可塑性的基础，主要包括突触数量、PSD厚度、突触小泡数量和突触间隙宽度等[15]。本研究低氧模型组海马突触间隙变窄模糊，突触小泡数量大量减少，经过不同强度电针干预后超微结构均得到改善，这与其他研究一致，证明电针可能是通过修复超微结构进而改善缺氧后脑损伤[16-17]。树突棘是神经元兴奋性突触传递的部位，其形态和密度的变化影响突触传递和神经元可塑性[18]。有研究发现电针可以增加树突棘密度，促进树突棘再生和神经损伤修复[19]。本研究低氧模型组小鼠海马树突棘密度降低，经过电针干预后树突棘密度升高其中高强度组升高显著，提示电针可能通过增加树突棘密度进而增强突触结构可塑性从而改善缺氧后脑损伤。PSD-95是突触后膜上核心构架蛋白之一，在突触后致密物中含量丰富，参与突触传递效能调控和突触结构重建，是反映突触可塑性的重要标志[20]。Cai等[21]研究表明电针疗法可通过增加突触相关蛋白PSD-95的表达及减少超微结构降解来改善5XFAD小鼠的突触可塑性。本研究低氧模型组PSD-95表达降低，经过电针干预后PSD-95的表达增加，其中电针中、高强度组升高明显，提示电针可能通过增加突触可塑性相关蛋白PSD-95的表达进而改善缺氧后脑损伤。

BDNF是中枢神经系统中分布最广泛的神经营养因子，在海马体和大脑皮层中高度表达[22]。TrkB是位于神经细胞膜上的跨膜蛋白，其结构由细胞外糖基化多肽、跨膜区和胞质内酪氨酸激酶区组成，是BDNF的特异性受体[23]。BDNF与TrkB结合后会促使酪氨酸激酶发生磷酸化，并激活下游信号通路：MAPK/ERK通路、PI3K-Akt通路、PLCγ-Ca2+通路，增强神经元存活和突触可塑性[24-25]。

Numakawa和Kajihaya[26]证实激活BDNF-TrkB信号通路可以促进神经元存活、减少细胞凋亡并增强突触强度。BDNF的缺失和由TrkB介导的信号传导受损会导致神经元功能障碍、突触缺陷及神经退行性变。Li等[27]研究表明电针可以通过激活BDNF-TrkB信号通路增加神经元存活并诱导树突再生，增强神经元可塑性。本研究模型组BANF、TrkB表达降低，经过电针干预后表达增加，电针高强度组最为显著，提示电针能激活BDNF-TrkB信号通路发挥神经保护作用来改善缺氧后脑损伤，与上述研究结果一致。

综上所述，电针可能通过激活BDNF-TrkB信号通路，促进树突棘形态和突触超微结构修复，提高突触可塑性相关蛋白PSD-95的表达，从而增强小鼠海马突触可塑性改善AHHBI，且高强度电针疗效最好。本研究为动物实验，在临床治疗时还应根据性别、年龄、体质和患者耐受程度综合考虑，以选取最适合电针强度进行治疗。本研究为电针治疗AHHBI提供了实验依据，局限性在于仅对BDNF-TrkB信号通路进行研究，今后将继续探索电针对其上下游通路的影响。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Exploring the effect of electroacupuncture on synaptic plasticity in mice with acute high-altitude hypoxic brain injury based on the BDNF-TrkB signaling pathway

GUO Xuejing ZHU Zhifang HUANG Shanshan OUYANG Shuai TONG Li LI Yongping
Medical College,Qinghai University,Qinghai Province,Xining 810001,China

[Abstract] Objective To investigate the effect and potential mechanism of electroacupuncture on synaptic plasticity in mice with acute high-altitude hypoxic brain injury via the BDNF-TrkB signaling pathway.Methods Sixty SPF-grade male C57BL/6J mice aged 8-10 weeks and weighing 20-25 g were divided into the blank control group,the hypoxic model group,the low-intensity electroacupuncture group,the mediumintensity electroacupuncture group,and the high-intensity electroacupuncture group according to the random number table method,with 12 mice in each group.A mouse model of acute high-altitude hypoxic brain injury was established using a hypobaric chamber for the hypoxic model group and all electroacupuncture groups.The electroacupuncture groups were treated at “bǎihuì” and “sìshéncōng” acupoints with densedisperse waves at a frequency of 20/100 Hz.The intensities(levels)of the low-,medium-,and high-intensity groups were 5,10,and 15 respectively,and the current intensities were 0.2,0.6,and 0.9 mA respectively,for 20 minutes per session,once daily for 7 consecutive days.The blank control group and the hypoxia model group only received grasping under the same conditions as each electroacupuncture group every day,without any other intervention.Hippocampal cell morphology was observed by HE staining.Neuronal morphology and number in the hippocampus were assessed by Nissl staining.Synaptic ultrastructure was examined using transmission electron microscopy.Dendritic spine morphology and density in the hippocampus were evaluated by Golgi staining.The protein expression levels of brain derived neurotrophic factor(BDNF),tyrosine receptor kinase B(TrkB),and postsynaptic density-95(PSD-95)in hippocampal tissue were detected by Western blot.The mRNA expression levels of BDNF,TrkB,and PSD-95 in hippocampal tissue were measured by RT-qPCR.Results Compared with the blank control group,the hypoxic model group showed disorganized and scattered distribution of hippocampal neurons,a decreased number of neurons(P＜0.01),blurred synaptic ultrastructure,reduced synaptic vesicles,decreased hippocampal dendritic spine density (P＜0.05),reduced protein expression levels of BDNF,TrkB,and PSD-95 in the hippocampus (P＜0.01),and decreased mRNA expression levels of BDNF,TrkB,and PSD-95 (P＜0.05).Compared with the hypoxic model group,hippocampal neuronal damage and synaptic ultrastructure were improved in all electroacupuncture groups;the number of neurons was increased in the medium-and high-intensity electroacupuncture groups(P＜0.05).Hippocampal dendritic spine density were increased in the high-intensity electroacupuncture group (P＜0.05).The protein expression levels of TrkB and PSD-95 were increased in the medium-intensity electroacupuncture group,and the protein expression levels of BDNF,TrkB,and PSD-95 were increased in the high-intensity electroacupuncture group(P＜0.01).The mRNA expression levels of BDNF and PSD-95 were increased in the medium-intensity electroacupuncture group,and the mRNA expression levels of BDNF,TrkB,and PSD-95 were increased in the high-intensity electroacupuncture group (P＜0.05).Compared with the low-intensity electroacupuncture group,hippocampal dendritic spine density was increased in the high-intensity electroacupuncture group(P＜0.05);the protein expression levels of TrkB and PSD-95 were increased in the medium-intensity electroacupuncture group,and the protein expression levels of BDNF,TrkB,and PSD-95 were increased in the high-intensity electroacupuncture group(P＜0.05);the mRNA expression levels of TrkB and PSD-95 were increased in the high-intensity electroacupuncture group (P ＜0.05).Compared with the medium-intensity electroacupuncture group,the protein expression levels of BDNF and TrkB were increased in the high-intensity electroacupuncture group (P＜0.05).Conclusion Electroacupuncture may enhance hippocampal synaptic plasticity and ameliorate acute high-altitude hypoxic brain injury by activating the BDNF-TrkB signaling pathway,promoting the repair of dendritic spine morphology and synaptic ultrastructure,and increasing the expression of synaptic plasticity-related proteins.

[Key words] Acute high-altitude hypoxic brain injury;Electroacupuncture;Synaptic plasticity;BDNF-TrkB signaling pathway

[中图分类号] R245.97

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）01（a）-0039-09

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25072097

[基金项目] 青海省“昆仑英才·高层次教育教学人才”项目；青海省卫生健康委员会中藏医药科研课题项目（J2023003）；青海省科学技术厅应用基础研究项目（2020-ZJ-760）。

[作者简介] 郭雪靖（1998-），女，青海大学医学院2023级针灸推拿学专业在读硕士研究生；研究方向：高原病针灸干预研究。

[通讯作者] 李永平（1978-），男，硕士，教授，硕士生导师；研究方向：针灸效应机制研究。

（收稿日期：2025-07-27）

（修回日期：2025-10-13）