脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是临床上常见致残率高、死亡率高的疾病，常导致脊髓损伤节段以下瘫痪、感觉异常或缺失、神经源性膀胱以及肠道功能障碍等[1-3]。SCI后的继发性损伤会引起脊髓氧化应激、神经元凋亡、联级炎症反应等，是造成人体功能障碍的重要因素[4-5]。研究发现，抑制PI3K/Akt信号通路后，SCI后神经元凋亡减少，能促进神经元的修复[6-7]。而微小RNA（microRNA，miRNA）通过靶向基因，抑制转录后基因表达，参与细胞增殖、凋亡、分化等过程[8-9]。其中miR-520c-3p通过Akt和NF-κB信号通路的RELA靶向调控血管内皮细胞的增殖、凋亡和黏附[10]。但miR-520c-3p能否通过PI3K/Akt通路调控SCI后神经元凋亡目前尚鲜见相关报道。因此本研究聚焦于miR-520c-3p，探究其是否通过调控PI3K/Akt通路参与SCI后神经元凋亡的进程，以此为SCI治疗提供新策略。

1 材料与方法

1.1 原代脊髓神经元分离与培养

10只健康雄性SPF级SD大鼠，出生4 d内，体重（20±5）g，购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司[实验动物合格证号：NO.41000000000000009400，许可证号：SCXK（豫）2020-0005]。标准饲养于安徽中医药大学动物房内，12 h间隔照明，自由进食饲料和水，恒温25 ℃，相对湿度40%。无菌条件下分离脊髓组织，经0.25%胰蛋白酶消化后，接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5%CO2 培养箱中扩增至3～5代备用，用于后续实验。本研究已通过安徽中医药大学动物伦理委员会批准（AHUCM-rats-2024085）。

1.2 主要实验试剂与仪器

PI3K抑制剂LY294002（美国MedChemexpress生物科技公司，货号：HY-10108）。Lip2000（赛默飞世尔科技公司，货号：L3000-015）；抗体（一抗）PI3K、p-PI3K、Akt、P-Akt（江苏亲科生物研究中心有限公司，货号：AF6241、AF3241、AF6261、AF0016）。β-actin、标记山羊抗小鼠IgG、辣根酶标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：23431-1-AP、ZB-2305、ZB-2301）。双荧光素酶试剂盒（派克生物科技有限公司，货号：FL001）。AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（增强型）（兰杰柯科技有限公司，货号：BL107B）。电泳系统、凝胶成像仪[伯乐生命医学产品（上海）有限公司]；化学发光成像系统（杭州申花科技有限公司）；酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]；流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司）；Real-time PCR仪（霍夫曼-罗氏有限责任公司）。

1.3 脊髓损伤细胞模型的建立与实验分组

使用H2O2 对脊髓神经元细胞进行处理，构建细胞氧化损伤模型，方法参照文献[11]的实验方法。在96孔板中接种细胞悬液。将培养板放在培养箱中预培养24 h（37 ℃，5%CO2）。取H2O2 标准溶液（1 000 μg/ml）1 ml加入10 ml培养基配置成100 μg/ml工作液，然后梯度稀释成50.000、25.000、12.500、6.250、3.125μg/ml。每个浓度6个复孔。取出96孔板，更换培养基，培养48 h。使用细胞CCK8法对各浓度梯度的细胞进行活性检测，得出脊髓神经元细胞氧化损伤模型H2O2 溶液的最适浓度。以下各组细胞进行氧化损伤处理均使用该浓度H2O2 溶液。

正常组：正常培养；H2O2 组：采用最适浓度H2O2处理48 h构建氧化损伤模型；miR-NC组：转染阴性对照siRNA 48 h后，添加H2O2 处理48 h建立氧化损伤模型；miR-520c-3p组：转染miR-520c-3p mimics48h后，添加H2O2 处理48 h进行氧化损伤；LY294002组：20 μmol/L PI3K抑制剂预处理1 h后进行氧化损伤，后续方法同miR-NC组；miR-520c-3p+LY294002组：联合转染与抑制剂处理后进行氧化损伤，后续方法同miR-NC组。各实验重复3次。

1.4 流式细胞术

收集密度合适的各组细胞系，加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞；加入5 μl Annexin V-FITC混匀后，加入5 μl Propidium Iodide，混匀；室温、避光、反应5～15 min；在1 h内，进行流式细胞仪的观察和检测细胞凋亡。

1.5 Western blot法检测相关蛋白表达水平

将细胞离心沉淀至管底，加500 μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）裂解，然后置于冰上。用移液器将裂解液移至1.5 ml离心管中，4 ℃裂解30 min，其间摇晃数次。4 ℃，12 000 r/min离心10 min，取上清分装于1.5 ml离心管中并置于-70 ℃保存。裂解液裂解后提取各组SCN细胞蛋白，电泳分离，转印PVDF膜，封闭、分别加一抗PI3K（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）过夜摇床孵育，鼠二抗（1∶10 000）室温孵育，洗膜，显影；对目的蛋白相对表达量进行分析。

1.6 RT-qPCR法检测相关基因表达水平

使用TRI Reagent裂解细胞，经氯仿分层、异丙醇沉淀、75%乙醇洗涤后，用DEPC水溶解RNA并于-70 ℃保存。cDNA合成，先以gDNA digester去除基因组DNA，再用Hifair Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录，反应程序为25 ℃，5 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 min，产物于-80 ℃保存。扩增体系为10 μl，含SYBR Green qPCR Mix 5 μl、正反向引物各0.5 μl、cDNA模板1 μl及ddH2O 3 μl，反应程序为95 ℃预变性3 min，随后95 ℃，15 s；60 ℃，30 s循环40次。结果采用2-ΔΔCt 法计算相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.7 生物信息学分析与双荧光素酶检测

采用TargetScanv 8.0数据库对miR-520c-3p的靶点进行预测，确定miR-520c-3p和PIK3CA之间存在结合位点后，使用双荧光素酶报告基因法检测miR-520c-3p和PIK3CA的靶向关系。实验分为pPGK-NC+NC组：共转染空载体pPGK-NC与阴性对照NC；pPGK-NC+miR-520c-3p组：共转染空载体pPGK-NC与miR-520c-3p mimics；PIK3CA-WT+NC组：共转染PIK3CA 3’UTR野生型载体与阴性对照NC；PIK3CA-WT+miR-520c-3p组：共转染PIK3CA 3’UTR野生型载体与miR-520c-3p mimics；PIK3CA-MUT+NC组：共转染PIK3CA 3’UTR突变型载体与阴性对照NC；PIK3CAMUT+miR-520c-3p组：共转染PIK3CA 3’UTR突变型载体与miR-520c-3p mimics。每组设3个复孔。将细胞转染后裂解，配制萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶反应液，平衡至室温。取20 μl上述细胞裂解上清，加入96孔板中。加入萤火虫荧光素酶反应液，震板混匀，检测萤火虫荧光素酶活性，加入海肾荧光素酶反应液，震板混匀，检测海肾荧光素酶活性。

1.8 统计学方法

采用SPSS 25.0统计学软件与GraphPad Prism 9软件进行数据处理。计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），进一步两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞氧化损伤模型H2O2 溶液的最适浓度

根据计算H2O2 的IC50 值为47.857 μg/ml。选取47.85 μg/ml为H2O2 处理的浓度，即取4.785 ml的过氧化氢标准溶液加入95.215 ml培养基中为工作液。见图1。

图1 CCK8检测细胞H2O2 溶液处理的最适浓度（n=6）

2.2 流式细胞术检测SCN细胞增殖、凋亡情况

与正常组比较，H2O2 组细胞凋亡率上升（P＜0.05）；与H2O2 组比较，miR-520c-3p组、LY294002组细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与miR-520c-3p组、LY294002组比较，miR-520c-3p+LY294002组细胞凋亡率降低（P＜0.05）。见图2～3。

图2 流式细胞术测定脊髓神经元细胞凋亡

图3 各组脊髓神经元细胞凋亡率比较（n=3）

与正常组比较，aP＜0.05；与H2O2 组比较，bP＜0.05；与miR-520c-3p组比较，cP＜0.05；与LY294002组比较，dP＜0.05。

2.3 各组细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平比较

与正常组比较，H2O2 组PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与H2O2 组比较，miR-520c-3p组、LY294002组中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与miR-520c-3p组比较，miR-520c-3p+LY294002组中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与LY294002组比较，miR-520c-3p+LY294002组中p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平降低（P＜0.05）。见图4～5。

图4 Western blot蛋白条带

图5 各组PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平比较（n=3）

与正常组比较，aP＜0.05；与H2O2 组比较，bP＜0.05；与miR-520c-3p组比较，cP＜0.05；与LY294002组比较，dP＜0.05。

2.4 各组细胞中miR-520c-3p及凋亡因子的基因表达水平比较

与正常组比较，H2O2 组细胞中的Bcl-2 mRNA表达量下降，Caspase-9、FasLmRNA表达量上升（P＜0.05）；与H2O2 组比较，miR-520c-3p组细胞中的miR-520c-3p、Bcl-2 mRNA表达量升高，Caspase-9、FasL的mRNA表达量降低，而LY294002组中的Bcl-2 mRNA表达量升高，Caspase-9、FasL的mRNA表达量下降（P＜0.05）；与miR-520c-3p组比较，miR-520c-3p+LY294002组Bcl-2、miR-520c-3p mRNA表达量升高，Caspase-9、FasL的mRNA表达量降低（P＜0.05）；与LY294002组比较，miR-520c-3p+LY294002组miR-520c-3p的mRNA表达量升高（P＜0.05）。见图6。

图6 各组细胞中miR-520c-3p及相关凋亡因子相对基因表达水平比较（n=3）

与正常组比较，aP＜0.05；与H2O2 组比较，bP＜0.05；与miR-520c-3p组比较，cP＜0.05；与LY294002组比较，dP＜0.05。

2.5 miR-520c-3p可以靶向调控PIK3CA

经过基因预测发现miR-520c-3p与PIK3CA之间存在结合位点，miR-520c-3p可在PIK3CA基因3’UTR的第182～189位形成典型的8mer类型结合位点，其context++score为-0.27。双荧光素酶报告实验中，与pPGK-NC+NC组比较，PIK3CA-WT+miR-520c-3p组共转双荧光素酶活性比值显著下调（P＜0.01），而pPGKNC+miR-520c-3p组、PIK3CA-WT+NC组、PIK3CAMUT+NC组 及PIK3CA-MUT+miR-520c-3p组的活性无显著变化，证实miR-520c-3p可特异性结合PIK3CA 3’UTR野生型序列，见图7。

图7 miR-520c-3p和PIK3CA的靶向关系

A：miR-520c-3p和PIK3CA的结合位点；B：双荧光素酶检测结果。与PPGK-NC+NC组比较，aaP＜0.01。

3 讨论

SCI后的继发性损伤后会出现大量神经元细胞凋亡，会导致人体出现肢体相关的功能性障碍[12-13]。研究发现，过表达miR-520c-3p能够促进细胞增殖，抑制细胞凋亡[14]。此外，miR-520c-3p可能通过激活PI3K/ Akt/NF-κB信号传导，影响细胞的增殖与凋亡的进程[15]。本研究结果显示，经过PI3K抑制剂的干预后，LY294002组中miR-520c-3p的mRNA表达水平低于miR-520c-3p组；与miR-520c-3p组比较，miR-520c-3p+LY294002组中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的蛋白表达量均降低，提示miR-520c-3p可能抑制PI3K/Akt轴的信号传导。本研究通过生物信息学手段分析了miR-520c-3p与PIK3CA的靶向关系，miR-520c-3p的seed区与PIK3CA 3’UTR182-189nt区域形成完整8mer配对，其配对区域结合能低，结合稳定性良好，提示该结合具有一定的功能抑制潜力。为此，本研究通过双荧光素酶报告实验进一步验证了该靶向关系，实验结果显示，miR-520c-3p显著抑制PIK3CA野生型3’UTR构建体的荧光活性，验证了miR-520c-3p可特异性靶向PIK3CA。以上提示miR-520c-3p可能通过该靶点影响PI3K/Akt通路活性，参与脊髓神经元细胞的凋亡调节过程。

Akt是一种丝氨酸苏氨酸激酶，是PI3K的下游效应器，可调节神经元分化与增殖和抑制神经元凋亡，促进SCI后神经元修复[16-17]。尽管PI3K/Akt通路在神经保护中已被广泛报道，但既往研究多聚焦于通路激动剂，或间接调控miRNA[18-19]。虽有研究发现miR-29a可靶向PIK3CA抑制宫颈癌细胞增殖[20]；但尚未在神经损伤模型中验证，且目前尚未有关于miR-520c-3p与PIK3CA的靶向关系的相关报道。本研究结果显示，经过氧化损伤后miR-520c-3p+LY294002组细胞凋亡率最低，提示使用miR-520c-3p和PI3K抑制剂干预，可以使PI3K/Akt信号通路抑制脊髓神经元细胞凋亡。PIK3CA基因编码的蛋白是PI3K的核心催化亚基，其可以激活下游的Akt/mTOR信号通路，促进细胞生长和抑制凋亡[21]。通过双荧光素酶检测发现，miR-520c-3p可以靶向PIK3CA，可能间接调节PI3K/Akt信号通路，实现对脊髓神经元细胞增殖、凋亡等生命进程的影响，不过其中具体机制还需进一步研究。研究发现，miRNA-134-5p调控PI3K/Akt信号通路后，导致p-Akt水平降低，下游Bcl-2蛋白表达减少，细胞凋亡比例上升[22-23]。

FasL为一种可介导细胞凋亡的膜蛋白，当磷酸化Akt下调FasL的表达后，会下调Fas介导的凋亡途径[24]。Caspase-9为内源性凋亡相关通路中的关键蛋白酶，PI3K/Akt信号通路可以抑制Caspase-9磷酸化，使Caspase-9失去活性，进而抑制脊髓神经元凋亡[25-26]。经过miR-520c-3p干预后，Bcl-2蛋白表达上升，Caspase-9、FasL的蛋白表达水平下降，脊髓神经元细胞凋亡率降低，进一步提示miR-520c-3p对PI3K/Akt信号通路及其下游相关凋亡因子的影响。此外，使用LY294002单药处理虽可抑制PI3K激酶活性，但可能激活mTORC2介导的Akt代偿性磷酸化，不过miR-520c-3p可直接结合PIK3CA 3’UTR的保守位点，阻断PI3K催化亚基表达，达到抑制Akt磷酸化的效果，以此来放大抑制效应。miR-520c-3p与LY294002联用显著降低细胞凋亡率，两者的协同效应可能源于miR-520c-3p抑制PIK3CA表达，降低PI3K基础活性，增强抑制剂敏感性；miR-520c-3p还可能通过靶向其他凋亡相关基因，与PI3K/Akt通路形成协同调控网络，还需进一步实验验证。

本研究发现miR-520c-3p靶向PIK3CA，下调PI3K蛋白表达，抑制Akt磷酸化，通过抑制PI3K/Akt轴的信号传导降低促凋亡因子FasL、Caspase-9的表达，并上调抗凋亡蛋白Bcl-2，抑制脊髓神经元细胞凋亡。目前本研究仍存在一定的不足，该结论只基于体外模型进行验证，后续研究可构建大鼠脊髓损伤模型验证体内疗效筛选miR-520c-3p的全基因组靶标。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Effect of miR -520c -3p targeting PIK3CA to regulate the PI3K/Akt signaling pathway on spinal cord neuronal cell

TAN Bingzhuo1 JIANG Shanshan2 LIN Quanyou1 CAO Yu1 LIANG Yueguang2 SUN Shanbin2

1.The Second Clinical College,Anhui University of Chinese Medicine,Anhui Province,Hefei 230038,China;2.Department of Rehabilitation,the Second Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine,Anhui Province,Hefei 230061,China

[Abstract] Objective To investigate the molecular mechanism by which miR-520c-3p inhibits apoptosis of spinal cord neuronal cells through regulating the PI3K/Akt signaling pathway.Methods Primary spinal cord neuron(SCN)cells isolated from neonatal SD rats were used as the cell model,and the H2O2-induced oxidative damage cell model was established;the SCN cells were divided into the normal group (cells were cultured under normal conditions),the H2O2 group (cells were treated with H2O2),the miR-NC group (cells were transfected with negative control siRNA followed by H2O2 treatment),the miR-520c-3p group (cells were transfected with miR-520c-3p mimics followed by H2O2 treatment),the LY294002 group(cells were pretreated with a PI3K inhibitor followed by H2O2 treatment),and the miR-520c-3p+LY294002 group (cells were co-transfected with miR-520c-3p mimics and pretreated with the PI3K inhibitor)prior to H2O2 treatment.Apoptotic rate of cells were measured by flow cytometry.Protein levels of PI3K,p-PI3K,Akt,and p-Akt were assessed by Western blot.mRNA expression of miR-520c-3p and apoptosis-related genes (Bcl-2,FasL,caspase-9) was quantified by RT-qPCR.Direct targeting of PIK3CA by miR-520c-3p was validated by dual-luciferase reporter assay.Results Compared with the normal group,the apoptosis rate of cells in the H2O2 group increased,the protein expression levels of PI3K,p-PI3K,Akt,and p-Akt increased,the expression level of Bcl-2 mRNA decreased,and the mRNA expression levels of caspase-9 and FasL increased (P＜0.05).Compared with the H2O2 group,the apoptosis rate of cells in the miR-520c-3p group and the LY294002 group decreased,and the protein expression levels of PI3K,p-PI3K,Akt,and p-Akt decreased (P＜0.05).Meanwhile,the mRNA expression levels of miR-520c-3p and Bcl-2 in the miR-520c-3p group increased,while the expression levels of caspase-9 and FasL mRNA decreased (P＜0.05),and the expression level of Bcl-2 mRNA in the LY294002 group increased.The expression levels of caspase-9 and FasL mRNA decreased (P＜0.05).Compared with the miR-520c-3p group,the apoptosis rate of cells in the miR-520c-3p+LY294002 group decreased,the protein expression levels of PI3K,p-PI3K,Akt and p-Akt decreased,and the mRNA expression levels of Bcl-2 and miR-520c-3p increased.The mRNA expression levels of caspase-9 and FasL decreased (P ＜0.05);compared with the LY294002 group,the apoptosis rate of cells in the miR-520c-3p+LY294002 group decreased(P＜0.05);the mRNA expression levels of p-PI3K,Akt,and p-Akt in the miR-520c-3p+LY294002 group decreased (P＜0.05),while the mRNA expression level in the miR-520c-3p group increased (P＜0.05).Dual-luciferase reporter assay fined that the ratio of dual-luciferase activity in the PIK3CA-WT+miR-520c-3p co-transfection group was significantly downregulated compared with the pPGK-NC+NC group (P ＜0.01).Conclusion miR-520c-3p regulates the PI3K/Akt signaling pathway,inhibits the expression of downstream apoptotic factors,thereby alleviating spinal cord neuronal cell apoptosis,and provides a potential therapeutic target for spinal cord injury treatment.

[Key words] Spinal cord injury;miR-520c-3p;PI3K/Akt signaling pathway;PIK3CA;Spinal cord neuronal；Cell apoptosis

[中图分类号] R34

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）01（a）-0047-08

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.2026.25061417

[基金项目] 安徽省高等学校科学研究项目（2023AH050804）；安徽省中医药传承创新科研项目（2024CCCX254）；国家优势专科康复科建设项目（国中医药医政函〔2024〕90号）；安徽中医药大学第二附属医院人才支持计划（杏林计划）项目（院发〔2023〕118号）。

[作者简介] 谭炳卓（2000-），男，安徽中医药大学第二临床学院2023级针灸推拿专业在读硕士研究生；研究方向：针灸的临床应用及机制研究。

[通讯作者] 梁月光（1991-），男，硕士；研究方向：针灸对神经系统疾病的临床及基础研究。

（收稿日期：2025-06-21）

（修回日期：2025-10-20）