胃癌是一种高度复发的恶性肿瘤。胃癌的发病率居世界第5位，死亡率排名第3位，仅次于肺癌和结直肠癌[1-2]。近年来，胃癌在中国的发病率与死亡率持续升高，使其成为重要的高发癌症之一[3-4]。尽管手术、放疗、化疗及新辅助治疗手段不断进步，胃癌患者术后仍面临肿瘤扩散、转移的风险，导致高病死率[5-6]。多项研究表明，抑癌基因细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（P16）、E-钙粘蛋白（E-cadherin）在胃癌细胞中表达降低，可促进肿瘤的增殖与发展[7-8]。此外，抑癌基因的过度甲基化可导致肿瘤抑制基因沉默，进而促进胃癌的发生[9]。临床研究表明，葡萄籽原花青素是由儿茶酚和表儿茶素聚合形成的二聚体、三聚体、四聚体、低聚体和聚合物的混合物[10-11]。葡萄籽原花青素对胃癌、肺癌、结直肠癌等多种癌症类型均有显著的抗肿瘤作用[12-15]。尽管葡萄籽原花青素的抗癌特性已得到充分认可，但其发挥抗癌作用的分子机制却知之甚少[16]。这一机制可能与调节P16、E-cadherin抑癌基因的甲基化水平及表达状态有关。本研究主要基于两种抑癌基因P16、E-cadherin的甲基化水平及基因的表达探讨葡萄籽原花青素对胃癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响，为胃癌临床治疗中应用天然药物提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、材料及仪器

本研究所用的人胃癌细胞株MKN45购自中国科学院上海生命科学研究所。100 g纯度≥95%的葡萄籽提取物原花青素（货号：0801012-31）购自天津剑锋天然产物研发公司；PBS缓冲液（货号：GNM20012）购自吉诺生物医药公司；胎牛血清（货号：SH30396.03）购自美国HyClone公司；RP-MI-1640-培养基（货号：SH30027.01）购自美国HyClone公司；CCK8检测试剂盒（货号：GNMC0038）购自碧云天生物技术公司；Hoechst33342试剂（货号：B8040）购自Solarbio公司；DR-200Bs型酶标仪购自Diatek公司；TRIpure（货号：EP013）和EnTurboTM SYBR Green PCR Super Mix（货号：EQ013）试剂盒购自ELK生物技术公司。实验所需引物序列及其他试剂购自武汉金开瑞生物工程有限公司。

1.2 细胞培养、分组及干预

人胃癌MKN45细胞在含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素的RPMI-1640-培养基中培养，培养箱温度为37 ℃、湿度为95%、CO2 浓度为5%，培养期间，隔天换液，细胞密度达到85%左右时，传代处理，并选取处于对数生长期的人胃癌MKN45细胞进行试验。

1.3 CCK8实验检测葡萄籽原花青素对细胞增殖的影响

在培养人胃癌MKN45细胞时，首先收集细胞悬液并用细胞计数精确计数，准备96孔板，每孔接种1×105 个细胞，葡萄籽原花青素分别设立0、5、10、20、40、50 μg/ml 5个浓度梯度，各浓度设置3个复孔，干预24、48、72 h观察细胞的增殖情况。

1.4 细胞分组

将对数生长期的MKN45胃癌细胞分为对照组，葡萄籽原花青素低、中、高浓度组，每组3个复孔并进行3次独立重复实验，以确保数据的准确性。0 μg/ml葡萄籽原花青素组作为对照组，葡萄籽原花青素低、中、高浓度组分别加入5、10、20 μg/ml葡萄籽原花青素干预72 h。

1.5 细胞划痕实验检测葡萄籽原花青素对细胞迁移的影响

用笔在6孔板的背面均匀的划横线，间隔0.5～1.0 cm，每孔至少穿过5条线；将对数期生长的细胞接种至6孔板中，完全培养基培养细胞融合度达90%以上；无菌枪头垂直于所划横线进行划痕，PBS清洗两次，漂洗脱落的细胞，换为不同分组的含药无血清培养基，显微镜下拍照记录0 h；放入细胞恒温培养箱中，48 h显微镜拍照记录。实验重复3次。根据实验数据，计算细胞划痕愈合率（%）=（初始划痕宽度-48 h划痕宽度）/初始划痕宽度×100%。

1.6 Hoechst染色法检测葡萄籽原花青素对细胞凋亡的影响

在培养板（如6孔板）的每个孔内放入一块无菌的盖玻片（如22 mm×22 mm的盖玻片放入6孔板），然后将细胞悬液接种到盖玻片上，让细胞在盖玻片上贴壁生长。弃去培养基，用PBS溶液清洗3次，每次持续5 min。随后，用4%浓度的多聚甲醛对细胞进行20 min固定，固定后再次用PBS清洗3次，每次清洗5 min。随后，滴加Hoechst33342染料进行细胞核染色，于室温下避光孵育20～30 min，孵育结束后再次用PBS清洗。最后，用镊子取出盖玻片，用吸水纸吸掉边缘多余液体。在载玻片上滴加1滴抗荧光淬灭封片剂，将盖玻片有细胞的一面朝下，倒置封片到载玻片上，轻轻按压排出气泡，并在荧光显微镜下进行观察，并拍照记录。

1.7 MSP检测葡萄籽原花青素对P16、E-cadherin基因甲基化影响

反应体系如下：将亚硫酸氢钠处理后的DNA（2.0 μl）作为模板，分别用甲基化特异性引物（M）和非甲基化特异性引物（U）进行PCR扩增反应，10 μmol/L正反向引物各1.0 μl，EnTurboTM SYBR Green PCR Super Mix 10.0 μl，ddH2O 5 μl。PCR引物信息见表1。PCR扩增及凝胶电泳，取0.2 ml PCR管，配制如下反应条件：预变性98 ℃，4 min；变性98 ℃，30 s；退火56 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；末段延伸72 ℃，10 min。40个循环。PCR扩增程序为：用浓度为2.0%的琼脂糖凝胶将扩增产物进行电泳分离，并用溴化乙锭染色。在凝胶成像系统中观察并记录电泳结果。

表1 PCR引物信息

1.8 RT-qPCR检测葡萄籽原花青素对P16、E-cadherin基因表达的影响

人胃癌MKN45细胞，经过1600×g离心处理5min，离心半径16 cm，弃去上清，从中提取总RNA，使用分光光度计对RNA浓度进行精确测定，逆转录成cDNA，按SYBR试剂盒的使用说明进行实验：SYBR Premix-ExTaqTMⅡ（2×）5.0μl，10μmol/L正反向引物各0.25μl，cDNA1μl，ddH2O 3.5 μl。具体的反应条件设置为95 ℃30 s、95 ℃5 s、60 ℃30s，合计40个循环，以β-actin为内参，用2-△△Ct 法计算目的基因的mRNA相对表达量。引物序列见表2。

表2 RT-qPCR引物信息

1.9 统计学方法

采用SPSS 21统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析进行统计学分析，若方差分析结果显示差异有统计学意义，则进一步使用t检验进行组间两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 葡萄籽原花青素对MKN45细胞活力的影响

葡萄籽原花青素处理MKN45细胞导致细胞活力显著降低。在葡萄籽原花青素处理后72 h观察到显著的抑制作用。同时与0 μg/ml葡萄籽原花青素比较，当葡萄籽原花青素浓度≥20 μg/ml、处理时间为72 h时对MKN45细胞存活产生明显影响，且葡萄籽原花青素浓度≥40 μg/ml时细胞存活率显著下降至50%以下，对细胞毒性过强。因此，选择葡萄籽原花青素5、10、20 μg/ml浓度梯度进行实验。见图1。

图1 CCK8实验检测葡萄籽原花青素对人胃癌MKN45细胞活力的影响

2.2 葡萄籽原花青素对MKN45细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验结果显示，与对照组比较，葡萄籽原花青素低、中、高浓度组划痕愈合率均降低（P＜0.01）。见图2。

图2 细胞划痕实验检测葡萄籽原花青素对人胃癌MKN45细胞迁移能力的影响（n=3）

A：各组细胞划痕实验检测其细胞迁移能力；B：各组细胞划痕愈合率统计。与对照组比较，aP＜0.01。

2.3 葡萄籽原花青素对MKN45细胞凋亡能力的影响

Hoechst染色结果进一步揭示显示，对照组细胞核形态呈圆形且为淡蓝色，而葡萄籽原花青素低、中、高浓度组细胞则展现出明显的凋亡特征，如细胞核固缩、染色质凝聚，形成明亮的月牙状、不规则圆形或椭圆形蓝白色亮点。与对照组比较，葡萄籽原花青素低、中、高浓度组，凋亡细胞的数量增多（P＜0.05）。见图3。

图3 Hoechst实验检测葡萄籽原花青素对人胃癌MKN45细胞凋亡能力的影响（n=3）

A：各组细胞；B：各组细胞凋亡数量统计。与对照组比较，aP＜0.01。

2.4 葡萄籽原花青素对MKN45细胞P16、E-cadherin甲基化的影响

MSP检测结果显示，在胃癌细胞中，用针对处理后甲基化DNA链的引物（P16 M、E-cadherin M）均能扩增出片段，提示该被检测的位点存在甲基化，而葡萄籽原花青素处理后甲基化水平减弱。见图4。

图4 MSP实验检测人胃癌细胞中P16、E-cadherin的甲基化状态

A：P16；B：E-cadherin。

2.5 葡萄籽原花青素对MKN45细胞P16、E-cadherin基因表达的影响

RT-qPCR结果显示，与对照组比较，葡萄籽原花青素低、中、高浓度组P16、E-cadherin基因表达均增加（P＜0.01）。见图5。

图5 葡萄籽原花青素对人胃癌细胞P16、E-cadherin基因表达的影响（n=3）

与对照组比较，aP＜0.01。

3 讨论

来自葡萄籽提取物的原花青素是各种多酚的极好来源，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多重作用[17]。葡萄籽原花青素作为一种天然去甲基化剂，其定位与去甲基化剂截然不同。其“温和、多靶点、安全性高和多重健康效益”的特点，使其特别适合于需要长期干预的场景。而去甲基化剂作用是强效的、不可逆的，但具有细胞毒性和基因毒性。因此葡萄籽原花青素在疾病预防和慢性病辅助管理领域展现出独特价值。近年来多项研究表明，葡萄籽原花青素可通过调节细胞增殖、周期及凋亡等生理过程发挥其显著的抗癌作用[18-19]。关于葡萄籽原花青素在胃癌方面的研究，Ye等[14]研究发现，葡萄籽原花青素对MCF-7胃腺癌细胞的浓度和时间依赖性细胞毒作用。Rossana等[20]发现葡萄籽原花青素通过阻碍MDM2通路发挥促凋亡作用，从而能够在不同的间皮瘤细胞系中诱导细胞凋亡并降低癌症特性。以上研究提示，葡萄籽原花青素通过调控多种信号通路发挥其显著的抑癌活性。本研究结果显示，葡萄籽原花青素可显著降低人胃癌MKN45细胞的增殖及侵袭能力，同时增强细胞凋亡率，且随葡萄籽原花青素浓度增加，对人胃癌MKN45细胞的抑制作用更大。

抑癌基因P16、E-cadherin在人胃癌细胞中的表达降低[21]。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P16（CDKN2A），作为预测胃癌风险的潜在生物标志物，能在G1 期初期阻滞细胞周期进程，因此过表达P16可抑制胃癌的发生、发展[22]。E-cadherin作为细胞黏附连接的核心组成部分，维持组织结构的完整，在多种癌症中的表达均降低，当其功能丧失时，细胞容易从原发灶脱落，发生浸润和转移[23]。这些研究强调了P16和E-cadherin在肿瘤起始与发展阶段的核心调控作用。本研究也发现，与对照组比较，经葡萄籽原花青素处理的各组胃癌细胞中P16、E-cadherin基因表达升高，且随葡萄籽原花青素浓度的增加，P16、E-cadherin基因表达逐渐升高，提示葡萄籽原花青素可通过促进抑癌基因的表达来调节其生物学功能。

肿瘤抑制基因的DNA高甲基化可导致其转录水平的沉默，促进胃癌的发展及转移[24]。在肠化生、胃腺瘤直至胃癌的样本中，P16基因的甲基化水平从2.1%逐渐升高至11.5%，并最终达到42.2%，这一趋势提示P16基因的高甲基化可能在胃癌前病变的演进过程中发挥重要作用[25]。P16甲基化与胃癌的淋巴结转移、远处转移及病变的浸润深度显著相关，P16基因因启动子区高甲基化时，细胞增殖失控，驱动肿瘤发生[26]。E-cadherin甲基化则更常见于低分化、弥漫型胃癌，E-cadherin基因的高甲基化可调控胃癌的起始与进展过程，E-cadherin甲基化的胃癌患者通常表现出不良预后[27-28]。这些研究强调了P16（CDKN2A）和E-cadherin（CDH1）基因的启动子异常甲基化，是胃癌发生和发展中两种非常重要的表观遗传学改变。它们分别通过影响细胞周期调控和细胞间黏附，在胃癌的启动、进展和转移中发挥关键作用。本研究发现葡萄籽原花青素用药后，胃癌细胞中P16、E-cadherin甲基化水平显著降低，提示葡萄籽原花青素可抑制P16、E-cadherin基因甲基化，促进其表达，从而发挥抗肿瘤的作用。

葡萄籽原花青素在临床应用中展现出广阔前景，但仍面临诸多挑战。面临着生物利用度低，代谢快；动物实验效果显著，但高质量人体临床数据依然缺乏；总体安全性较好，但需关注高剂量长期使用的潜在风险等多方面的挑战[29-30]。然而，葡萄籽原花青素在抗肿瘤、代谢性疾病（如糖尿病、心血管疾病）和神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）中的多靶点调控作用为其临床转化提供了独特优势。未来，通过递送技术革新（如靶向纳米颗粒）、标准化成分分析及个体化用药策略，葡萄籽原花青素有望成为慢性病辅助治疗及癌肿预防的重要天然药物，但其广泛应用仍需更多临床前及Ⅲ期试验数据的支持。

4 小结

本研究中葡萄籽原花青素抑制人胃癌MKN45细胞的生物学特性（抑制细胞增殖及迁移、促进细胞凋亡），其机制可能涉及逆转抑癌基因P16及E-cadherin的异常甲基化，从而增强其表达来实现的。该研究为高效、低毒的天然药物治疗胃癌的研究提供新的方向，具有较好的应用前景。同时，也为葡萄籽原花青素在抗癌领域的研究提供了宝贵的实验基础，奠定了坚实的理论依据。但本研究仍有许多不足，只初步在细胞水平研究葡萄籽原花青素可抑制P16、E-cadherin基因甲基化，促进其表达，从而达到改变肿瘤细胞生物学行为的目的，未来仍需要进一步的研究说明葡萄籽原花青素在体内肿瘤模型中的作用。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Effect and mechanism of grape seed proanthocyanidins extract on the biological behavior of human gastric cancer cells

DONG Yifei1 CHEN Xiaoling1 HUANG Ying2 ZHANG Zheng2
1.Department of Laboratory Medicine,Wuhan City Eighth Hospital,Hubei Province,Wuhan 430000,China;2.Department of Hepatobiliary Gastrointestinal Surgery,Hankou Hospital of Wuhan City,Hubei Province,Wuhan 430000,China

[Abstract] Objective To investigate the effects of grape seed proanthocyanidins on the malignant biological behaviors(proliferation,migration,apoptosis) of human MKN45 gastric cancer cells,and to explore the mechanism of their related actions.Methods The experiment was divided into control group and the low-,medium-,and high-concentration grape seed proanthocyanidins extract group.MTT assay,cell scratch assay,and Hoechst staining were used to detect cell proliferation,migration and apoptosis,and the effects of proanthocyanidins in grape seed on the mRNA expression and methylation of two tumor suppressor genes P16 and E-cadherin were detected by RT-qPCR and MSP.Results Compared with the control group,each grape seed proanthocyanidins extract group had lower cell survival rate,lower cell scratch healing rate,and decreased the number of apoptotic cells,the gene expression of P16 and E-cadherin increased,while the methylation level decreased(P＜0.01).Conclusion Grape seed proanthocyanidins extract can inhibit the methylation of P16 and E-cadherin genes and promote their expression,and thus affecting the biological behavior of gastric cancer cells.

[Key words] Gastric cancer;Grape seed proanthocyanidins extract;Tumor suppressor gene;Methylation;Cell proliferation;Cell migration;Cell apoptosis

[中图分类号] R284.1

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）01（b）-0052-06

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25072495

[基金项目] 湖北省武汉市中医药科研项目（WZ22C24）。

[作者简介] 董毅飞（1980-），女，硕士，副主任医师；研究方向：分子遗传及细胞遗传。

[通讯作者] 张征（1978-），男，硕士，副主任医师；研究方向：肝胆胰血管。

（收稿日期：2025-07-31）

（修回日期：2025-10-27）