酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是因长期大量饮酒引起的肝脏病理性损伤，由肝脂肪变性向肝炎、肝纤维化及肝硬化发展。酒精是我国导致肝损害的第二大病因[1]。其直接毒性作用导致的炎症反应可促进ALD的发病，抗炎治疗是治疗肝病的重要方面[2-3]。目前ALD的各种治疗药物，如美他多辛、糖皮质激素等存在效果欠佳、毒副作用多等问题[4]，因此寻找更加安全且有效的治疗方法具有重要意义。枳葛保肝降脂方出自全国名中医孙同郊教授，该方具有解酒降脂、滋肝补肾的功效，由枳椇子、葛根、山楂、白茅根、青果、桑葚6味中药组成。课题组前期研究表明该方可通过抑制炎症因子的产生，减轻酒精性肝损伤所致的炎症反应[5]，但其具体机制尚不完全清楚。

Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路是经典且关键的炎症反应通路。TLR4作为重要的模式识别受体，在乙醇等刺激下可通过髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖途径激活NF-κB，促进炎症介质释放，导致肝损伤[6-7]。研究显示，TLR4敲除小鼠在酒精干预后肝损伤和脂肪变性显著减轻[8]。NF-κB是酒精性肝病中炎症反应的核心调节因子，贯穿肝炎、纤维化至肝癌的整个过程。在静息状态下，NF-κB与其抑制蛋白α 在胞质中结合；NF-κB抑制蛋白α 磷酸化后释NF-κB p65亚基，后者进一步磷酸化并转入核内启动下游基因转录[9]。此外，TLR4/NF-κB通路还可上调NLR家族含pyrin结构域蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）并促进肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎因子分泌，共同推动ALD进展[10-11]。本研究基于TLR4/NF-κB信号通路探讨枳葛保肝降脂方含药血清对乙醇诱导的人肝LO2细胞炎症损伤的保护作用，以深化该方防治ALD的理论依据，拓展其临床应用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药品

西南医科大学实验动物中心提供的SD雄性大鼠（SPF级）60只，体质量（200±20）g，生产许可证：SYXK（川）2023-0017，使用许可证：SYXK（川）2023-0065。实验已通过西南医科大学实验动物伦理委员会审查（swmu20240110）。适应性喂养7 d，自由饮食、饮水。枳葛保肝降脂方口服液（批号：20190213）由西南医科大学附属中医医院制剂室统一提供。美他多辛（货号：74536-44-0）购于上海吉至生化科技有限公司。

1.2 实验试剂

酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）TNF-α 试剂盒（货号：E-EL-H0109）、IL-1β 试剂盒（货号：E-EL-H0149）、IL-18试剂盒（货号：E-EL-H0253）购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；RIPA裂解液（货号：BL504A）购于北京兰杰柯科技有限公司；磷酸化蛋白酶抑制剂（货号：G2007-1ML）购于武汉赛维尔生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：BL521A）购于北京兰杰柯科技有限公司；GAPDH抗体（货号：AF7021）购于美国Affinity公司；无水乙醇（货号：64-17-5）购于成都市科隆化学品有限公司。

1.3 实验仪器

二氧化碳培养箱（型号CellXpert C170，上海天祺制药机械有限公司）；医用低温保存箱（型号DW-86L626，青岛海尔生物医疗股份有限公司）；水浴锅（型号HH-4，常州国华电器有限公司）；低速离心机（型号SC-2544，安徽中科中佳科学仪器有限公司）；生物显微镜（型号ICX41，宁波舜宇仪器有限公司）；高速低温组织研磨仪（型号KZ-III-F，武汉赛维尔生物科技有限公司）；脱色摇床（型号SLK-O3000-S，美国SCILOGEX，）；酶联免疫分析仪（型号FlexA-200，杭州奥盛仪器有限公司）；电泳仪（型号PowerPac Basic，美国Bio-Rad）；台式高速冷冻离心机（型号VELOCITY18R，英国Dynamica）；生物安全柜（型号BDC-1500IIA2-X，济南鑫贝西生物技术有限公司）等。

1.4 方法

1.4.1 含药血清的制备SD雄性大鼠（SPF级）60只，适应性喂养1周，自由饮食、饮水，使用完全随机分组法将大鼠分为正常组（20只）、枳葛保肝降脂方含药血清组（20只）、美他多辛组（20只）。根据《动物与人体的每千克体质量剂量折算系数表》并参照文献[12]的具体给药剂量公式，结合课题组既往研究结果[13]，使用灌胃方法及剂量：正常组[生理盐水1 ml/（100 g·d）]，枳葛保肝降脂方含药血清组[枳葛保肝降脂方8.85 g生药/（100 g·d）]，美他多辛组[美他多辛0.1 g/（100 g·d）]，每日早晚各灌胃1次，连续7 d。最后1次给药1.5 h后用2%戊巴比妥钠（5 ml/kg）麻醉大鼠，腹主动脉采血后，血液样本经3 000 r/min离心15 min，离心半径9.5 cm分离上清液。同组血清混合后，经超净工作台过滤除菌，56 ℃水浴灭活30 min，最终冻存于-80 ℃备用。

1.4.2 细胞复苏及培养 从液氮罐中取出人肝LO2细胞冻存管，将冻存管置于37 ℃水浴箱中恒温解冻，2 min内尽快融化管内冻存液，待冻存管内仅剩小块未溶解冻存液时将冻存液全部移至12 ml离心管，缓慢加入2 ml提前配好的完全培养基（10%胎牛血清+1%双抗+DMEM培养基），1 000 r/min离心5 min（离心半径9.5 cm），吸除废液，加入1 ml完全培养基轻柔吹打后转至T25培养瓶中，加入4 ml完全培养基后放入37 ℃、5%CO2 培养箱中培养，分别于12、24、48 h观察细胞生长状态，待细胞铺满培养瓶85%左右时可再次传代培养，直至满足实验需求量。

1.4.3 造模方法及分组 乙醇浓度筛选、酒精性肝损伤肝细胞模型建立及枳葛保肝降脂方含药血清对肝细胞损伤的有效作用浓度的筛选参考课题组前期实验结论[14]，干预时间为24 h，无水乙醇干预浓度为2.5%，含药血清高、中、低浓度分别为10.0%、5.0%、2.5%。将人肝LO2细胞分为正常组（10%正常大鼠血清+89%DMEM培养基+1%青链霉素）、诱导组（10%正常大鼠血清+2.5%无水乙醇+86.5%DMEM培养基+1%青链霉素）、美他多辛组（10%美他多辛含药血清+2.5%无水乙醇+86.5%DMEM培养基+1%青链霉素）和高、中、低浓度枳葛保肝降脂方含药血清组，其中高、中、低浓度枳葛保肝降脂方含药血清组简称高浓度组（10%枳葛保肝降脂方含药血清+2.5%无水乙醇+86.5%DMEM培养基+1%青链霉素）、中浓度组（5%枳葛保肝降脂方含药血清+2.5%无水乙醇+91.5%DMEM培养基+1%青链霉素）、低浓度组（2.5%枳葛保肝降脂方含药血清+2.5%无水乙醇+94%DMEM培养基+1%青链霉素），培养24 h后，在此基础上进行后续相关指标检测。

1.4.4 ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-18水平 取人肝LO2细胞在96孔板接种，24 h后分别在各组中加入按实验要求配置完成的培养基，每组设置4个复孔，培养24 h后，消化离心收集细胞，PBS缓冲液重悬，1 000 r/min离心5 min后（离心半径9.5 cm），取沉淀裂解30 min，5 min震荡1次，再于4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清后于-20℃保存。按ELISA试剂盒说明书进行相关指标检测。

1.4.5 Western blot法检测TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1、p-NF-κB-p65蛋白表达水平 将人肝LO2细胞接种于6孔板，待培养至细胞铺满约80%后分别在各组中加入按实验要求配备完成的培养基，培养24 h后消化，离心，洗涤，加入RIPA裂解液（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），用低速离心机充分混匀，冰浴30 min，期间反复吹打细胞确保其完全裂解。12 000×g离心5 min（离心半径5 cm）后收集上清，BCA法测蛋白浓度，计算得出上样量，加入上样缓冲液，变性后放入-80 ℃冻存；制胶、电泳、转膜，转膜后将膜放入封闭液（2.5 g脱脂奶粉溶于50 ml的1×TBST）中室温封闭1 h。加入TLR4抗体（1∶1 000）、MyD88抗体（1∶1 000）、Caspase-1抗体（1∶1 000）、p-NF-κB-p65抗体（1∶1 000）、NF-κB-p65抗体（1∶2 000、GAPDH抗体（1∶5 000），NLRP3抗体（1∶5 000），4 ℃孵育过夜。用TBST在摇床上洗3次，每次5 min。将相应二抗（山羊抗兔二抗-HRP、山羊抗鼠二抗-HRP）用TBST按1∶10 000比例稀释，室温下孵育1 h后，用TBST在摇床上洗3次，每次5 min。重复实验3次。最后显影采集图像。Image J测量灰度值。

1.4.6 RT-qPCR法检测TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1 mRNA的表达量 于培养皿中接种人肝LO2细胞培养24 h后，分别在各组中加入提前配制好的培养基，培养24 h后按照总RNA提取试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，根据RT-qPCR试剂盒说明书逆转录 成cDNA，扩 增TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1基因，以GAPDH为内参，反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，进行40个循环。每个样本设置3个复孔，重复实验3次。反应体系为：2×qPCRMasterMix 10.0 μl，7.5 μmol/L基因引物mix 1.2 μl，反转录产物2.0 μl，ddH2O 6.8 μl。用2-△△Ct 法计算各指标mRNA的相对表达量。引物序列及产物长度见表1。

表1 RT-qPCR基因所用引物序列及产物长度

1.5 统计学方法

运用GraphPad Prism10.1.2软件进行处理分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，使用单因素方差分析进行组间比较，两两比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组TNF-α、IL-1β、IL-18水平比较

与正常组比较，诱导组TNF-α、IL-1β、IL-18水平升高（P＜0.01）；与诱导组比较，低、中、高浓度组TNF-α、IL-1β、IL-18水平降低（P＜0.01）。见图1。

图1 各组TNF-α、IL-1β、IL-18水平比较（n=4）

与正常组比较，aaP＜0.01；与诱导组比较，bbP＜0.01。TLR4：Toll样受体4；MyD88：髓样分化因子88。

2.2 各组TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1、p-NFκBp65/NF-κBp65蛋白表达水平比较

与正常组比较，诱导组中TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1、p-NF-κBp65/NF-κBp65蛋白表达水平升高（P＜0.01）；与诱导组比较，中、高浓度组TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1、p-NF-κBp65/NF-κBp65蛋白表达水平降低（P＜0.01），低浓度组中Caspase-1、p-NF-κBp65/NF-κBp65的蛋白表达水平降低（P＜0.05）。见图2、3。

图2 TLR4/NF-κB通路相关蛋白条带图

图3 各组TLR4、MyD88、Caspase-1、NLRP3、p-NF-κBp65/NF-κBp65蛋白表达水平比较（n=3）

与正常组比较，aaP＜0.01；与诱导组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01。TLR4：Toll样受体4；MyD88：髓样分化因子88。

2.3 各组TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达比较

与正常组比较，诱导组TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达量升高（P＜0.01）。与诱导组比较，低、中、高浓度组TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达量降低（P＜0.01）。见图4。

图4 各组TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达量比较（n=3）

与正常组比较，aaP＜0.01；与诱导组比较，bbP＜0.01。TLR4：Toll样受体4；MyD88：髓样分化因子88。

3 讨论

目前，ALD的具体病理生理机制尚不完全清楚，但由乙醇诱导的炎症反应可促进ALD的发生、发展[2]。本研究中，经乙醇干预后，诱导组IL-1β、IL-18和TNF-α 表达较正常组升高，提示使用2.5%无水乙醇干预24 h可成功建立人肝LO2细胞炎症损伤模型，这与课题前期实验结果一致[14]。

枳葛保肝降脂方源自全国名中医孙同郊教授，本方由枳椇子、葛根、山楂、白茅根、青果、桑葚共6味中药组成，《千金要方》记载：“以鲜葛根捣汁可治酒醉不醒者。”《医方考》记载“枳椇子，解酒，过于葛花。今后凡遇伤酒中酒者，宜用之。”课题组前期对枳葛保肝降脂方治疗ALD的相关研究较多，有扎实的实验基础，从糖脂代谢[15]、氧化应激[16]、炎症[5]方向进行了体内外相关验证，在临床上已广泛用于ALD的预防和治疗。研究发现，枳葛保肝降脂肪中富含多糖，其多糖组分在体外具有显著的抗炎活性[17]，本研究结果显示，低、中、高浓度组IL-1β、IL-18和TNF-α 蛋白、mRNA表达水平较诱导组均降低，再一次提示该方能有效减轻乙醇诱导的细胞炎症损伤。

TLR4/NF-κB是经典的炎症通路，当炎症诱导剂与TLR4结合时，MyD88依赖途径被激活，通过介导NF-κB和促炎性细胞因子TNF-α，引起NLRP3蛋白表达上调，促使NLRP3与凋亡相关斑点样蛋白、pro-Caspase-1组装成炎症小体，通过活化Caspase-1，导致炎症介质IL-1β 和IL-18的大量释放，进而导致靶组织的损伤，引发一系列炎症反应。相关研究表明，中药单药提取物如茯苓多糖提取物[18]、葛根提取物[19]及中药复方参苓白术散[20]可通过抑制TLR4/NF-κB炎症信号通路，有效缓解酒精引起的肝脏炎症损伤，并遏制酒精性肝病的进展。本研究中，诱导组TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达水平升高，IL-1β、IL-18、TNF-α 产生明显增多，提示经乙醇诱导后，TLR4/NF-κB通路被激活，释放大量炎症因子。而与诱导组比较，含药血清中、高浓度组TLR4、MyD88、NLRP3和Caspase-1 mRNA的表达量降低，TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1、p-NF-κB p65/NF-κB p6蛋白表达水平降低，且IL-1β、IL-18、TNF-α产生也明显减少，提示枳葛保肝降脂方含药血清可能通过下调TLR4、MyD88，抑制NF-κB p65的磷酸化及促炎因子TNF-α 的产生，引起NLRP3蛋白表达下调，减少Caspase-1的活化，进而减少炎症因子IL-1β、IL-18的产生，从而减轻无水乙醇诱导的肝LO2一系列炎症反应损伤。

综上所述，枳葛保肝降脂方含药血清能够通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，对乙醇诱导的人肝L-O2细胞炎症损伤发挥保护作用。作为药食同源的中药制剂，枳葛保肝降脂方对酒精性肝病的抗炎作用体现了中医“治未病”的理念。深入研究枳葛保肝降脂方在炎症反应中的作用机制，有助于在临床治疗ALD中实现中医“既病防变”的目标，充分发挥中医药的优势，为开发防治酒精性肝病的中药新药奠定理论基础。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Effect of Zhige Baogan Jiangzhi Fang on ethanol-induced inflammatory injury in human hepatic LO2 cells via the TLR4/NF-κB pathway

KANG Yan1 LI Zhongting1 CHEN Hui2 LIU Peng3

1.School of Integrated Chinese and Western Medicine，Southwest Medical University，Sichuan Province，Luzhou 646000，China;2.Department of Spleen-Stomach&Rheumatology-Immunology，Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine，Southwest Medical University，Sichuan Province，Luzhou 646000，China;3.Department of Hepatobiliary Diseases，Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine，Southwest Medical University，Sichuan Province，Luzhou 646000，China

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of Zhige Baogan Jiangzhi Fang medicated serum on ethanol-induced inflammatory injury in human hepatic LO2 cells by focusing on the TLR4/NF-κB signaling pathway.Methods Human hepatic LO2 cells were divided into the normal group (10%normal rat serum)，the induced group(10%normal rat serum+2.5%anhydrous ethanol)，the Metadoxine group (10%Metadoxine-containing serum+2.5%anhydrous ethanol)，and the low-，medium-，and high-dose Zhige Baogan Jiangzhi Fang drug-containing serum groups (referred to as “low-，medium-，and high-dose groups”) (10.0%，5.0%，2.5%Zhige Baogan Jiangzhi Fang drug-containing serum+2.5%anhydrous ethanol).The contents of tumor necrosis factor-α (TNF-α)，interleukin(IL)-1β and IL-18 in the cell lysates of each group were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.Western blot was used to detect the protein expression level of Toll-like receptor 4(TLR4)，myeloid differentiation factor 88(MyD88)，NLR family pyrin domain-containing protein 3(NLRP3)，caspase-1，and phosphorylated nuclear factor κB p65 subunit/nuclear factor κB (p-NF-κBp65/NF-κBp65) in each group.The expression of TLR4，MYD88，NLRP3，and caspase-1 mRNA in each group was detected by RT-qPCR.Results Compared with the normal group，the levels of TNF-α，IL-1β，and IL-18，the protein expression levels of TLR4，MyD88，NLRP3，caspase-1，and the p-NF-κB p65/NF-κB p65 ratio，as well as the mRNA expression levels of TLR4，MYD88，NLRP3，and caspase-1 were increased in the model group (P＜0.01).Compared with the model group，the levels of TNF-α，IL-1β，and IL-18，the protein expression levels of TLR4，MyD88，NLRP3，caspase-1，and the p-NF-κB p65/NF-κB p65，and the mRNA expression levels of TLR4，MYD88，NLRP3，and caspase-1，and the p-NF-κB p65/NF-κB p65 were decreased in both the medium-and high-dose groups(P＜0.01).Furthermore，the reductions were more pronounced in the high-dose group compared to the medium-dose group.Conclusion The medicated serum of Zhige Baogan Jiangzhi Fang exerts protective effects against anhydrous ethanol-induced inflammatory damage in human hepatic LO2 cells，and this action may be mediated through the TLR4/NF-κB signaling pathway.

[Key words] TLR4/NF-κB signaling pathway;Zhige Baogan Jiangzhi Fang;Alcoholic liver injury;Inflammation;Human hepatic LO2 cells

[中图分类号] R256.4

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）01（c）-0084-06

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25070005

[基金项目] 四川省泸州市科技计划项目（2024JYJ040）。

（收稿日期：2025-07-01）

（修回日期：2025-11-05）