胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是恶性程度极高的消化道肿瘤，预后极差。流行病学数据显示，2022年全球胰腺癌死亡病例约46.7万例，中国同年死亡病例约11万例[1-2]。PDAC占所有胰腺肿瘤的85%～90%[3-5]，治疗手段有限，5年生存率仅为10%左右[6-8]。KRAS突变是PDAC的关键驱动因素，突变率超过90%[9]。其中KRASG12D是最常见亚型（49.6%），其突变导致KRAS蛋白持续活化，通过调控下游信号通路驱动肿瘤的发生和发展[10-12]。

尽管高选择性KRASG12D抑制剂MRTX1133在临床前研究中抑瘤效果显著，但耐药性严重制约其临床应用[13-15]。现有研究表明，KRAS抑制剂普遍存在耐药问题，其机制涉及下游信号通路再激活、旁路补偿及肿瘤微环境重塑等[16-18]。然而，目前研究多聚焦于药物敏感性评估，而对KRASG12D抑制剂特异性耐药机制的研究明显不足[19-20]，特别是缺乏稳定的体外模型，制约了其耐药机制的深入研究。

本研究通过构建MRTX1133耐药的PDAC细胞模型，结合细胞功能实验、转录组分析及RT-qPCR验证，系统探究其潜在耐药机制，为克服临床耐药提供理论依据和新靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞

人胰腺导管腺癌细胞系AsPC-1购自Procell生命科学与技术公司（中国武汉）。AsPC-1 MRTX1133耐药细胞株由本课题组自主筛选构建，亲本细胞记作AsPC-1，耐药细胞记作AsPC-1.RE。

1.2 药品与试剂

MRTX1133（货号：T6910）购自中国陶术生物科技有限公司；RPMI 1640培养基（货号：SH30027.01）购自美国Cytiva公司；0.25%胰蛋白酶溶液（货号：D12021）购自上海达特希尔生物科技有限公司；PBS缓冲液（货号：G4207）与通用型组织固定液（货号：G1101）购自塞维尔生物科技有限公司；胎牛血清（货号：AUS-01S-02-S）购自德国CellBox公司；二甲基亚砜（分析纯）（货号：D2650）购自德国Sigma-Aldrich公司；结晶紫染液（货号：CD001）购自陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司；TRIzol试剂（货号：15596026CN）购自美国Invitrogen公司；PrimeScriptRT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（货号：RR047A、RR820A）购自日本TaKaRa公司。

1.3 细胞培养与药物处理

AsPC-1细胞使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37 ℃、5% CO2条件下培养。在细胞密度达到80%时传代。MRTX1133母液的配制方法为将10 mg MRTX1133溶于1 ml 二甲基亚砜中，过滤后配制成10 mmol/L溶液并保存在80 ℃冰箱中，使用时用RPMI 1640培养基稀释至所需工作浓度。为降低DMSO的潜在细胞毒性并严格控制实验变量，本研究在MRTX1133药物处理组及对照组中，将DMSO的工作浓度统一设定为0.1%。

1.4 耐药细胞系的构建

通过浓度梯度递增法构建MRTX1133耐药细胞系。选取对数生长期的AsPC-1细胞，分别使用0.1、1.0、10.0、100.0 nmol/L和1、10 µmol/L浓度的MRTX1133处理48 h[13,20-21]，计算亲本细胞的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。为诱导耐药性，实验以亲本细胞IC50值的1/4作为起始给药浓度。待细胞恢复对数生长后，逐步递增药物浓度，每次将药物浓度提升一倍，继而按等差数列逐步提高后续浓度。此过程反复进行，直至所获耐药细胞的IC50值达到亲本细胞的5倍以上。本研究测得亲本细胞AsPC-1的IC50为38.11 nmol/L，取近似值，将能够耐受200 nmol/L的AsPC-1的细胞命名为AsPC-1.RE。为维持细胞的耐药性，使用含有200 nmol/L的RPMI 1640培养基进行后续传代培养。

1.5 耐药指数（resistance index，RI）检测

取对数期AsPC-1、AsPC-1.RE细胞分别接种于96孔板，每孔5×103个细胞。培养24 h后，弃掉原培养基，分别更换为含0.1、1.0、10.0、100.0 nmol/L和1、10 µmol/L浓度的MRTX1133的新鲜培养液[13,20-21]。培养48 h后，每孔加入含10% CCK8的新鲜培养液，孵育1 h，酶标仪检测450 nm处吸光度值。使用GraphPad Prism 8.0计算IC50值，计算RI，RI=AsPC-1.RE IC50值/AsPC-1 IC50值。

1.6 克隆形成实验

取对数期细胞按照1×103个/孔种植于6孔板中，将细胞分为亲本细胞对照组、亲本细胞MRTX1133处理组（50 nmol/L）、耐药细胞对照组、耐药细胞MRTX1133处理组（50 nmol/L）。每孔加2 ml培养基，当培养皿中出现肉眼可见的细胞克隆时终止培养。弃去培养液，使用PBS清洗两次，随后加入1 ml 4%多聚甲醛溶液，室温固定20 min。弃去固定液，再次使用PBS清洗两次，加入1 ml 0.1%结晶紫染色液，室温染色15 min，流水洗去染液，空气干燥后拍照计数。

1.7 转录组测序与富集分析

使用爱基百客公司提供的转录组测序服务，对AsPC-1和AsPC-1.RE细胞进行对比分析。基于原始测序数据，本研究以FDR＜0.05作为统计学显著性阈值，并筛选表达量发生两倍以上变化（|log2FC|＞1）的基因，从而获得在AsPC-1.RE耐药细胞系中发生显著差异表达的基因列表。利用Metascape在线分析平台对该差异基因集合进行基因本体（gene ontology，GO）功能注释分析和京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.8 RT-qPCR实验

为验证转录组测序中关键差异基因的表达，选取细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重塑、PI3K/Akt及AGE/RAGE等通路中关键基因进行RT-qPCR分析。所用引物由北京擎科生物科技公司设计与合成。使用TRIzol法提取细胞总RNA并逆转录为cDNA，以SYBR Green法在LightCycler 480系统上进行扩增。反应体系（20 µl）包含：cDNA模板3 µl、正反向引物各0.5 µl、SYBR Green预混液10 µl及无酶水6 µl。反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40个循环；最后进行融解曲线分析。以GAPDH为内参基因，通过2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验独立重复3次。各引物序列详细信息见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

COL1A1正向引物GAGGGCCAAGACGAAGACATC21 CCGAAGTACACAGTGTTCTGG21反向引物PIK3CG Akt3正向引物TGTGGATTTACCTTATCCCCTCA23正向引物TGAGACAGGGCTCTTCACACT21反向引物AGGTCAGGGTTACGGTTCCA20反向引物TTGAGTAAGGAAGTGAGGTTGAG23 CCL2正向引物CAGCACACTCGATATGGACCA21反向引物CCTCGGGCTCAGGATAGTCT20正向引物TACAGGCTGGCTCAGGACTAT21反向引物CGCAACATTTTGTAGCACTCTG21 GAPDH基因名称引物序列（5’-3’）序列长度（bp）反向引物CAGATCACGTCATCGCACAAC21 ITGA3正向引物CTACCACAACGAGATGTGCAA21正向引物GGCGAAACGCCCATCAAAAA20反向引物GACTCCCGTGCAGTCATCC19反向引物GTTTGGCTTTGGTCGTTCTGT21 AGER NFKB1正向引物CACAGCTGGAGGGAAGTAAAT21正向引物CAGCCAGATGCAATCAATGCC21反向引物TGGAATCCTGAACCCACTTCT21 TGFB2 BCL2 Bax正向引物CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG21反向引物CCAGCCCATGATGGTTCTGAT20正向引物GGAGTCCACTGGCGTCTTCA20反向引物GTCATGAGTCCTTCCACGATACC23

1.9 统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析，统计图表由GraphPad Prism 8.0软件生成。计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用重复测量方差分析，两两比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MRTX1133耐药PDAC细胞系的构建及生长特性改变

CCK8实验结果显示，亲本细胞的MRTX1133 IC50值小于耐药细胞的MRTX1133 IC50值（P＜0.01）（图1A）。通过计算，MRTX1133在耐药细胞中的RI为19.87，提示本研究构建的耐药细胞系符合耐药标准。克隆形成实验结果显示，耐药细胞对照组克隆形成数量少于亲本细胞对照组（P＜0.01）；耐药细胞MRTX1133处理组克隆形成数量多于亲本细胞（P＜0.01）（图1B、C）。

图1 AsPC-1亲本和耐药细胞的IC50测定及克隆形成能力比较（n=3）

2.2 MRTX1133耐药细胞和亲本细胞的差异表达基因筛选

根据AsPC-1与AsPC-1.RE细胞的转录组测序结果，按照|log2FC|＞1且FDR＜0.05的标准，共筛选到5 388个差异表达基因。其中，AsPC-1.RE中表达水平升高的基因有2 811个，表达水平降低的基因有2 577个。见图2。

图2 AsPC-1亲本和耐药细胞的差异表达基因火山图

2.3 差异表达基因的GO功能注释与KEGG通路富集分析

GO分析结果显示，在AsPC-1.RE细胞的上调基因中，生物学过程显著集中于细胞发育与分化相关条目，包括神经元分化、细胞突起组织及细胞发育调控等；细胞组分则显著富集于轴突、神经元突起及细胞突起；分子功能类别主要涉及细胞骨架蛋白结合、微管蛋白结合及细胞黏附分子结合（图3A）。而下调基因则主要富集于脂质代谢和有机酸代谢等小分子代谢过程，细胞组分多位于细胞连接结构，分子功能以氧化还原酶活性和受体调节活性为主（图3B）。KEGG通路分析提示，差异表达基因在多个与肿瘤进展及耐药性形成相关的通路中显著富集。上调基因显著关联的通路包括胚胎发育、ECM重塑、PI3K/Akt信号通路、AGE/RAGE信号通路等（图4A）。下调基因则主要富集于Ras信号通路、NOD样受体信号通路和细胞凋亡等通路（图4B）。

图3 差异表达基因的GO功能注释分析

图4 差异表达基因的KEGG通路富集分析

2.4 RT-qPCR验证潜在耐药通路中关键基因的表达水平

结果显示，与亲本细胞比较，耐药细胞AsPC-1.RE中COL1A1、ITGA3、PIK3CG、AKT3、AGER、NFKB1、CCL2、TGFB2、BCL2 mRNA表达上调，而BAX表达下调（P＜0.05）。见图5。

图5 RT-qPCR验证潜在耐药通路关键基因表达差异（n=3）

3 讨论

KRASG12D作为PDAC中最常见的驱动突变基因，已成为靶向治疗开发的重要靶点。尽管MRTX1133在临床前研究中表现出显著的抗瘤效果，但耐药性严重制约了其临床应用。本研究构建并验证了MRTX1133耐药细胞模型，结合转录组分析及RT-qPCR实验，揭示了PDAC对MRTX1133的潜在耐药机制。

转录组分析表明，多条信号通路的变化与既往报道的KRAS耐药机制一致。研究表明，KRAS抑制剂治疗患者可因PIK3CA基因突变或扩增导致PI3K/Akt通路再激活，进而拮抗药物诱导的细胞死亡[22-24]。AGE/RAGE信号通路则通过增强巨胞饮作用来抵抗治疗诱导的氧化应激[25]。此外，ECM重塑能激活下游生存信号，形成物理和生化双重屏障[26-27]。

同时，本研究还识别出其他潜在耐药相关通路。首先，O-连接糖基化修饰在肿瘤相关巨噬细胞中已被证实可通过调控Cathepsin B活性促进肿瘤转移和耐药[28]，提示肿瘤细胞也可能通过此机制影响药物胞内滞留或降解，进而导致耐药。其次，胚胎及多种器官发育相关通路的富集，提示肿瘤细胞可能通过获得干性参与耐药。这些发现为理解MRTX1133耐药提供了新的视角。

在转录组分析的基础上，本研究通过RT-qPCR实验对筛选出的核心基因进行验证，进一步发现PI3K/Akt、AGE/RAGE等通路在耐药细胞中被激活。这些结果共同证实上述通路在耐药细胞中异常激活，提示联合干预上述通路是克服MRTX1133耐药的潜在策略。

本研究存在一定局限性：实验主要在体外耐药模型中进行，缺乏动物模型或临床样本验证。此外，未直接验证潜在通路和基因在介导MRTX1133耐药中的关键作用。在后续研究中，本研究拟通过基因敲除技术、多组学分析及体内实验模型，进一步验证各通路在耐药中的作用，并评估其与MRTX1133协同用药的疗效。

综上所述，本研究通过构建MRTX1133耐药的PDAC细胞模型，初步揭示了ECM重塑、PI3K-Akt和AGE-RAGE等信号通路的异常激活在MRTX1133耐药中的潜在作用。该研究为克服治疗耐药提供实验与理论依据，有望推进KRASG12D抑制剂的临床转化并改善PDAC患者的治疗困境。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Establishment of KRASG12D-inhibitor-resistant cell line of pancreatic ductal adenocarcinoma and study of the resistance mechanism

ZHANG Liang LIU Jingyi WANG Hongrui LIU Yubo ZHAO Ting LI Junqiang WANG Ronglin SU Haichuan

Department of Oncology, Tangdu Hospital, Air Force Medical University, Shaanxi Province, Xi’an 710038, China

[Abstract] Objective To establish a pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cell line resistant to the KRASG12D inhibitor MRTX1133 and to investigate its resistance mechanism. Methods The human PDAC AsPC-1 cells were induced using a concentration gradient increase method to construct the MRTX1133-resistant cell line AsPC-1.RE.The effect of MRTX1133 on cell proliferation ability was evaluated through the colony formation assay; differentially expressed genes were screened using transcriptome sequencing technology, and gene ontology function and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analyses were conducted; the expression levels of differentially expressed genes in key pathways were verified by RT-qPCR. Results The IC50 value of MRTX1133 for the parental strain was lower than that of the resistant strain (P＜0.01), the resistance index was 19.87. The number of clone formations in the resistant cell control group was less than that in the parental cell control group(P＜0.01); the number of clone formations in the resistant cell MRTX1133 treatment group was greater than that in the parental cells (P＜0.01). The KEGG enrichment analysis revealed that the differentially expressed genes were significantly enriched in extracellular matrix remodeling, PI3K/Akt, and AGE/RAGE signaling pathways. The RT-qPCR experiment showed that compared with the parental cell line AsPC-1, the mRNA expressions of COL1A1, ITGA3,PIK3CG, Akt3, AGER, NFKB1, CCL2, TGFB2, and BCL2 were upregulated in the drug-resistant cell line AsPC-1.RE,while the expression of BAX was downregulated (P＜0.05). Conclusion This study successfully established an MRTX1133-resistant PDAC cell model. Through transcriptomic analysis and RT-qPCR validation, it preliminarily revealed the potential role of abnormally activated signaling pathways—including extracellucar matrix remodeling, PI3K/Akt, and AGE/RAGE—in MRTX1133 resistance. This provides crucial experimental evidence and potential intervention targets for overcoming clinical drug resistance.

[Key words] Pancreatic neoplasms; KRAS; Tumor resistance; MRTX1133; PI3K/Akt/mTOR pathway; AGE/RAGE pathway

[中图分类号] R979.1；R735.9

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）02（a）-0045-07

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25091894

[基金项目] 陕西省肿瘤疾病临床研究中心项目（2024SF-LCZX-13）；陕西省卫生健康肿瘤精准免疫治疗科研创新团队项目（2024TD-04）。

[作者简介]

张良（1996-），男，空军军医大学唐都医院2023级肿瘤学专业在读硕士研究生，主要从事肿瘤早期诊断及发生机制研究工作。

[通讯作者] 苏海川（1970-），男，博士，主任医师，教授，博士生导师，主要从事肿瘤早期诊断与生物治疗研究工作。

（收稿日期：2025-09-24）

（修回日期：2025-12-23）