肠系膜脂肪组织（mesenteric adipose tissue，MAT）是连接肠道与全身代谢的关键枢纽，其功能紊乱常与胰岛素抵抗、代谢综合征及慢性炎症密切相关[1-3]。然而，MAT高度血管化、神经浸润及免疫微环境复杂的特性，使得传统消化方法难以获得高纯度、高活性的原代细胞，无法建立稳定、可靠的体外细胞模型。目前国内研究普遍采用脂肪细胞系或其他脂肪组织替代，缺乏针对MAT特异性的分离方案，严重限制其在机制研究和药物筛选中的应用。

既往研究虽关注脂肪组织，但针对MAT特异性分离与培养体系的建立仍存在不足。例如，Guilliams等[4]通过单细胞测序揭示MAT中巨噬细胞的异质性，美国JoVE平台发布通用内脏脂肪分离方案[5]，然而这些方法均未针对MAT的血管丰富、免疫微环境复杂等解剖学特点进行优化。2025年文献报道年龄相关脂肪前体细胞驱动内脏脂肪增生的研究，但缺乏对MAT原代细胞的验证模型[6]。Tao等[7]报道MAT沉积与铁代谢的研究，但其工作仍集中于动物模型层面，迄今尚未建立成熟的原代MAT细胞分离与标准化培养体系，这极大地限制对MAT特异性功能的细胞生物学机制探索。故本研究通过优化酶组合、消化时间，建立改良消化分离法，通过形态学与染色鉴定确保细胞纯度，突出方法在稳定性、时间效率和成本方面的优势，为相关代谢疾病研究提供可靠的细胞模型。

1 对象与方法

1.1 实验动物

2只SPF级雄性SD大鼠，4周龄，体质量100 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物合格证号：20220004067740，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004，实验动物使用许可证号：SYXK（京）2014-0041。所有实验操作均严格遵守国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》规定。本研究经中国中医科学院广安门医院动物伦理委员会批准（IACUC-GAMH-2025-060）。

1.2 主要试剂及仪器

DMEM/F12培养基（批号：10018479，Gibco，Thermo Fisher Scientific，USA）；胎牛血清（批号：2130111，Gibco，Thermo Fisher Scientific，USA）；Ⅱ型胶原酶（批号：20231115，北京鼎国昌盛生物有限公司）；油红O染色液（批号：20231208，北京鼎国昌盛生物有限公司）。

超净工作台（型号：SW-CJ-2FD，苏州安泰净化设备有限公司）；水平多功能离心机（型号：Allegra X-15R，Beckman Coulter，USA）；CO2培养箱（型号：HF90，上海力康有限公司）；倒置显微镜（型号：DMi1，Leica，Germany）。

1.3 实验处理

参照文献[8-9]的脂肪细胞分离方法并加以改进，建立原代大鼠肠系膜脂肪细胞分离体系。大鼠麻醉处死后于无菌条件下仔细分离肠系膜脂肪组织，置于预冷PBS中漂洗，剔除可见血管及结缔组织。将组织剪碎至约1 mm3，加入0.1% Ⅱ型胶原酶溶液，于37 ℃恒温水浴振荡消化30 min。消化结束后加入等体积含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，收集滤液，1 000 r/min离心5 min（离心半径：15 cm）；弃去上清液及上层油脂层，沉淀用DMEM/F12+10%FBS完全培养基重悬后，接种于培养皿中，置于37 ℃、5%CO2培养箱内静置培养。24 h后首次全量更换培养液，后续每2 d半量换液1次。本方法缩短了分离流程（仅30 min），降低了试剂消耗，操作简便且成本低，与传统方法相比更具效率。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 细胞生长形态观察 于倒置显微镜下持续观察记录原代培养细胞的形态、分布、贴壁、融合度等生长情况。通过动态观察细胞形态均一性，评估细胞纯度，未见成纤维细胞或巨噬细胞等污染的典型形态。

1.4.2 油红O染色鉴定 待细胞培养7 d后，弃去培养基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定15 min；PBS清洗，加入新鲜配制的油红O工作液浸染30 min；PBS充分洗去浮色，苏木精复染细胞核。镜下观察细胞内脂滴被染成红色，细胞核被染成蓝色，即为成功分离的脂肪细胞。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

于倒置显微镜下进行动态观察，接种后24 h可见圆形的细胞开始贴壁，分散分布于培养皿底部（图1A）；培养3 d后，以肠系膜组织为中心，目的细胞“出芽式”迁移爬出（图1B～C）；培养7 d后贴壁细胞数量增多，细胞形态由圆形逐渐向多角形伸展，折光性良好（图1D～F）。

图1 原代细胞生长情况观察

2.2 油红O染色前细胞形态学观察

细胞培养7 d后可见绝大多数贴壁细胞的胞浆内富含大量透亮、大小不一的脂滴，高倍镜下呈空泡状，环绕核周或散布胞质中。见图2。

图2 油红O染色前细胞状态评估

2.3 油红O特异性染色结果

镜下观察发现鲜艳的红色信号特异性定位于细胞浆内的脂滴结构中。脂滴被染成红色，形态完整，清晰可辨；脂滴大小不等，小者呈点状，大者呈圆球状，相互融合或串联成串，密集地围绕于细胞核周围。见图3。

图3 油红O特异性染色观察

2.4 苏木精复染结果

复染后可见细胞核呈清晰的蓝色，多位于细胞中央呈卵圆形。部分细胞中巨大的脂滴将细胞核挤压至细胞边缘，形成扁平的半月形“印戒样”形态。见图4。

图4 苏木精复染观察

3 讨论

本研究首次采用改良消化分离法成功从大鼠MAT中分离出高纯度、高活性的原代脂肪细胞，并系统建立从分离、培养到鉴定的标准化技术体系，为肠系膜脂肪在代谢性疾病中的作用机制研究提供了可靠的体外实验模型[10-13]。尽管本研究未使用流式细胞仪进行表面标志物量化，但通过严格的形态学观察和油红O染色鉴定，细胞呈现高度均一的脂肪细胞特征，未见成纤维细胞或巨噬细胞等污染，符合原代脂肪细胞鉴定的常用标准[14-16]。未来研究可进一步结合流式细胞术以提供量化纯度指标。

在肠系膜脂肪细胞的提取方法上，本研究在已发表文献[8-9]的基础上重新优化。其核心原理是使用0.1% Ⅱ型胶原酶、将消化时间控制在30 min，即温和解离组织的同时最大限度保持细胞膜完整性，避免细胞内脂滴泄漏。消化完成后离心可去除上清液中的游离油脂和细胞碎片，收集底层细胞沉淀及组织块并以完全培养基重悬接种；培养24 h后换液以去除非贴壁杂质，获得形态完整、折光性强的脂肪细胞群。与传统方法相比，该方案在细胞获得率、贴壁速度和增殖能力上具有明显优势：细胞在7 d内即可完成形态学观察与染色鉴定，且操作简便、成本低、重复性高，有效缩短实验周期并提高产出率。

在肠系膜脂肪细胞的鉴定方面，本研究采用形态学与组织化学染色相结合的多重验证体系。细胞形态观察显示，刚分离的细胞呈圆形且折光性较强，与王慧等[14]报道的刚分离的脂肪细胞形态相似，提示其具有较高的细胞活性；贴壁后显微镜下可见细胞内含有大量透亮的脂滴，与蒋茂莹等[15]提到的成熟脂肪细胞的典型特征一致；油红O染色显示脂滴被特异性染成红色，借此来显示活跃的脂质储存功能，与相关研究[16-17]报道的油红O染色的描述相符合，进一步证实细胞的脂肪细胞特性；采用苏木精复染揭示成熟脂肪细胞的典型“印戒样”形态——巨大脂滴将细胞核挤压成半月形位于细胞边缘，同时亦可见细胞核居中央、环状分布多个脂滴的前体脂肪细胞，提示所得细胞群体包含不同分化阶段的脂肪细胞，真实模拟体内细胞组成的异质性。本研究从形态与功能角度证实所分离细胞确为肠系膜源性脂肪细胞。

此外，本研究重视实验的标准化与可重复性，其中包括实验动物的规范化选择[18]。本研究均采用4周龄体质量为100 g的SPF级雄性SD大鼠，该年龄段大鼠正处于代谢活跃期，脂肪组织增殖能力强，细胞活性高，有利于原代细胞的成功分离和体外培养。SPF环境确保细胞处于相对“静息”的生理状态，有效避免潜在病原体感染导致脂肪组织的慢性炎症[19-20]。使用雄性大鼠可排除实验动物因雌激素周期性波动对脂质代谢、胰岛素敏感性及炎症反应的潜在影响，最大限度控制混杂变量，为实验结果的准确性、可重复性和生物学一致性提供重要保障。

本研究亦存在需深化之处。本研究方案虽可获得高纯度的脂肪细胞群体，但未来若需进行极高纯度分选或单细胞测序，可进一步结合特异性脂肪细胞标志物进行流式分选或免疫磁珠富集。同时，本研究主要聚焦于方法学建立与形态功能鉴定，后续可利用该模型深入探讨肠系膜脂肪细胞在炎症刺激下的脂解功能变化、特异性脂肪因子分泌谱及其与免疫细胞的相互作用机制，从而深化其对代谢调控功能的认知。

综上所述，本研究建立的改良消化分离法可高效、稳定、成功分离出具有典型形态与功能特征的原代肠系膜脂肪细胞，在时间效率、成本控制和稳定性上优于常规方案，结合标准化动物模型与系统鉴定策略，为后续深入研究肠系膜脂肪在代谢性疾病、肠道免疫的细胞机制提供了“种子细胞”模型。未来可进一步利用此模型开展细胞共培养、脂解功能检测及脂肪因子谱分析等深入研究，推动相关领域向细胞与分子层面深化。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Extraction of primary mesenteric adipocytes of rats by modified digestion method and identification by oil red O staining

LAI Suyu1 YUAN Run2 WANG Yichang1 WANG Zhuo1 JIA Fei1 WANG Xiaofeng1

1.Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100053, China; 2.China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

[Abstract] Objective To establish a stable and efficient method for the isolation, culture, and identification of primary mesenteric adipocytes in rats, providing an in vitro model for study of mesenteric fat-related metabolic diseases.Methods The modified digestion and separation method was adopted. That was, 0.1% type Ⅱ collagenase was used to digest the mesenteric adipose tissue of rats for 30 minutes. After centrifugation, the cell precipitates were collected. After being resuspended and inoculated in complete medium, the cell adhesion and proliferation morphology were dynamically observed. Lipid droplet morphology and nuclear localization were identified via oil red O staining and hematoxylin counterstaining. Results Highly active primary mesenteric adipocytes were successfully isolated. The cells exhibited highly homogeneous adipocyte characteristics with no significant contamination from fibroblasts or macrophages. Cells adhered within 24 h post-inoculation, exhibiting a round shape and strong refractivity; after three days of culture,cells migrated and expanded in a “budding” pattern from the tissue blocks; after seven days of culture, cell morphology transitioned to polygonal or short spindle shapes with transparent lipid droplets visible intracellularly. The lipid droplets were stained red,appearing as “beaded” rings around the nucleus or forming“signet-ring” mature adipocytes. Conclusion The improved digestive isolation method established in this study efficiently yields primary rat mesenteric adipocytes with typical morphological and functional characteristics. This method is stable, time-efficient, cost-effective, and can be used for subsequent functional research on related metabolic diseases.

[Key words] Mesenteric adipocytes; Primary culture; Improved digestive isolation method; Oil red O staining; Rat

[中图分类号] R-33

[文献标志码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）02（b）-0001-05

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25100542

[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（81673980）；中央高水平中医医院临床研究和成果转化能力提升项目（HLCMHPP2023075）；中国中医科学院科技创新工程重大攻关项目（CI2021A02109）。

[作者简介]

赖素玉（1997.12-），女，中国中医科学院广安门医院2024级中医外科学专业在读博士研究生；研究方向：中西医结合治疗盆底疾病。

[通讯作者] 王晓锋（1974.6-），男，医学博士，主任医师，博士生导师，博士后合作导师；研究方向：中西医结合治疗盆底疾病。

（收稿日期：2025-10-11）

（修回日期：2025-11-19）