急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）不断恶化会进展成重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP），SAP常伴有一过性脏器功能损伤或以机体出现全身或局部并发症为特征，其病死率高达20%～30%，是一种常见且极其凶险的急腹症[1]。尽管随着AP的多学科综合治疗诊治理念、方式、策略得到更加科学地改善与提升，以及护理与营养模式更合理化，AP的治疗仍是棘手难题。铁死亡是一种新型的铁依赖性细胞死亡[2]，其已被证明参与了心血管疾病[3]、肿瘤[4]、感染性疾病[5]和代谢性疾病的发生和发展过程[6]，调节细胞铁死亡可能成为药物干预疾病的重要靶点。

研究发现AP发生、发展与铁死亡密切关联，如抑制GPX4介导的铁死亡可以缓解急性胰腺炎的炎症坏死[7]。SLC7A11是一种胱氨酸/谷氨酸逆向转运体，其表达具有提高抗氧化酶GPX4活性和抑制细胞铁死亡的作用[8]，且SLC7A11的抑制会导致神经胶质瘤细胞发生铁死亡[9]。而高车前苷（homoplantaginin，Hom）是具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用的中药单体[10]，其能够调节棕榈酸所诱导的内皮细胞的凋亡[11]。miRNA在AP中的作用已被广泛认识，如Qin等[12]发现急性水肿性胰腺炎组miR-22和miR-135a的表达水平上调。也有研究发现，miR-135a可介导AR42J细胞发生凋亡和促进炎症反应[13]，miR-21-3p可通过上调PIAS3和下调HMGB1来调节AP炎症[14]。miR-20b-5p与恶性肿瘤、免疫炎症反应密切相关。circRNA可作为miRNA分子海绵来调控相关基因表达以参与AP的发生和发展。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及模型建立

小鼠胰腺腺泡癌细胞系266-6细胞购自上海富衡生物科技有限公司，培养于DMEM培养基中（10%FBS，1%双抗），置于5% CO2、37 ℃的饱和湿度培养箱中，2～3 d可传代，取处于对数期生长状态良好的细胞加入浓度为100 nmol/L的雨蛙并进行培养24 h，建立AP模型。雨蛙素造模浓度由文献查阅所得[13,15]。

1.2 试剂与药物

胎牛血清（美国Thermo Fisher公司，批号：F8687）；DMEM培养基（美国Thermo Fisher公司，批号：11320033）；青链霉素混合液素（美国Thermo Fisher公司，批号：140675）；细胞培养板（6孔）（美国Thermo Fisher公司，批号：140675）；胰蛋白酶-EDTA（美国Thermo Fisher公司，批号：25200072）；ACCUTASETM细胞消化液（YEASEM公司，批号：40506ES60）；2.0 ml无色离心管（YEASEM公司，批号：83504ES03）；5 ml移液管（YEASEM公司，批号：84503ES03）；PBS缓冲液（美国Thermo Fisher公司，批号：70013032）；细胞培养板（96孔）（德国sigma公司，批号：PSHT004S5）；PTGS2抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：66351-1-Ig）；GPX4抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：30388-1-Ap）；SLC7A11抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：26864-1-Ap）；ACSL4抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：22401-1-AP）；RIPA裂解液（强）（YEASEN公司，批号：20114ES60）；GAPDH内参抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：10494-1-AP）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×，无气味）（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0015）；雨蛙素（美国MCE公司，批号：HY-A0190）；高车前苷（美国MCE公司，批号：HY-N1949）；GPX4抑制剂RSL3（美国MCE公司，批号：HY-100218A）；Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox Plus）（YEASEM公司，批号：11202ES03）；酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：ml001611）；生化检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；RT-qPCR试剂盒（厂家：深圳市达科为生物技术有限公司，批号：8073021）；0.45µm PVDF膜（德国Merck公司，批号：SE4M041I09）。

1.3 研究方法

1.3.1 细胞分组和处理 实验一设置了4组：空白组、造模组、高车前苷组和高车前苷联合RSL3组。空白组：小鼠266-6细胞在含有10%FBS的DMEM培养基中培养48 h；造模组：小鼠266-6细胞在含有10%FBS的DMEM培养基中先培养24 h，再加入100 nmol/L雨蛙素继续培养24 h；高车前苷组：小鼠266-6细胞在含有10%FBS的DMEM培养基中先培养24 h，再加入100 nmol/L雨蛙素和62.5 µmol/L高车前苷继续培养24 h；高车前苷联合RSL3组：小鼠胰腺腺泡癌细胞266-6在含有10%FBS的DMEM培养基中先培养24 h，再加入100 nmol/L雨蛙素、62.5 µmol/L高车前苷和5 µmol/L RSL3继续培养24 h。细胞实验二分为造模组、对照组、基因敲低组。造模组：小鼠细胞266-6在含有10%FBS的DMEM培养基中先培养24 h，再加入100 nmol/L雨蛙素继续培养24 h。对照组：以含有10%FBS的DMEM培养基培养（37 ℃，5% CO2）266-6细胞，铺板至6孔板中（5×105个），当汇合度达到80%时，进行转染siRNA-NC，转染成功后再加入100 nmol/L雨蛙素和62.5 µmol/L高车前苷继续培养24 h。基因敲低组：以含有10%FBS的DMEM培养基培养（37 ℃，5% CO2）266-6细胞，铺板至6孔板中（5×105个），当汇合度达到80%时，进行转染siRNA-circDNMT3B，转染成功后再加入100 nmol/L雨蛙素和62.5µmol/L高车前苷继续培养24 h。62.5 µmol/L的高车前苷浓度由文献检索结合预实验而得到[16]。

1.3.2 Western blot法检测 将细胞样品置于1.5 ml EP管中，向其加入1 ml RIPA、10 µl PMSF、20 µl磷酸酶抑制剂，4 ℃裂解1 h，12 000 r/min离心5 min，并将细胞样品进行BCA定量（参照YEASEN BCA蛋白定量试剂盒说明书进行），检测SLC7A11、GPX4、PTGS2、ACSL4表达水平。方法：用1×TBST按照说明书稀释鼠源的目标蛋白一抗，1∶1 000稀释。山羊抗鼠的二抗按1∶20 000稀释。实验独立重复3次。

1.3.3 CCK8检测 转染24 h后，将266-6细胞以1 000个细胞/孔的密度植入96孔板中，在上述条件下进行常规培养。根据制造商的方案，在24 h用CCK8试剂测量细胞活力。通过酶标仪（Bio-Rad，CA，USA）测量450 nm处的光密度（OD）值。每组设置5个复孔，实验重复3次。

1.3.4 流式细胞凋亡术 通过Annexin V/FITC试剂盒计算小鼠胰腺腺泡266-6胞凋亡活性。转染48 h后，将细胞收集到离心管中，以1 000 r/min离心两次，持续5 min，吸出上清液，然后加入1×结合缓冲液重悬，将细胞密度调节至1×106～5×106/ml。然后将100 µl 细胞悬液和5 µl膜联蛋白V/FITC 混合，在室温下避光孵育5 min。检测前，加入10 µl碘化丙啶和400 µl PBS。实验重复3次。

1.3.5 ELISA检测与生化检测 收集细胞上清，参照ELISA试剂盒说明书进行ELISA检测。参照商家GPX4、丙二醛malondialdehyde，MDA）生化试剂盒说明书进行检测。实验重复3次。

1.3.6 RNA提取和RT-qPCR Trizol提取总RNA，反转录酶处理RNA以获得cDNA。荧光定量PCR反应体系的配制总体积20 µl，Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix （Low Rox Plus） 10 µl，正反向引物各0.5 µl，cDNA 1 µl，ddH2O 8 µl。具体扩增条件的设置为扩增曲线：95 ℃ 5 min 1个循环；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 31 s，40个循环。熔解曲线：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。实验重复3次。引物序列见表1。

表1 引物的序列（5’～3’）

引物长度正向引物GCAAAGTGCTCATAGTGCAG20 GTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCTACCT27反向引物mmu_SLC7A11 mmu_circ_DNMT3B正向引物GACAAATCCCGTCTGCTTCC20正向引物GCCAAAAGGGTCATCATCTCC21 GTGATGGCATGGACTGTGGTC21反向引物U6 基因名称引物序列（bp）mmu_miR-20b-5p正向引物CATCATCATCGGCACCGTCAT21反向引物AGCAGTTCCACCCAGACTCGA21反向引物GGTCTTCCAGATTGCCCTTGT21 GAPDH 正向引物CTCGCTTCGGCAGCACA17反向引物AACGCTTCACGAATTTGCGT20

1.3.7 细胞转染 circDNMT3B抑制剂和阴性对照（NC）购自广州瑞博生物。根据说明，将这些片段通过Lipofectamine 2000（Invitrogen，美国卡尔斯巴德）转染至小鼠胰腺腺泡266-6细胞中。

1.4 统计学方法

采用SPSS 27.0统计学软件进行数据分析。作图软件为GraphPad Prism 8.0。计量资料采用均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高车前苷与RSL3对266-6细胞的调控作用

2.1.1 高车前苷对雨蛙素诱导266-6细胞凋亡的影响造模组凋亡率低于空白组（P＜0.01）；高车前苷组与高车前苷联合RSL3组凋亡率高于造模组（P＜0.01）。见图1。

图1 高车前苷、铁死亡激活剂RSL3对雨蛙素诱导的266-6细胞的凋亡调控作用（n=3）

2.1.2 高车前苷对雨蛙素诱导266-6细胞的炎症因子的影响 各组小鼠胰腺癌腺泡266-6细胞48 h后生长良好，40倍镜下汇合度达到80%（图2A）。与空白组比较，造模组淀粉酶含量降低，IL-1β、IL-18、Fe2+、GSH和MDA水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。高车前苷组较造模组IL-1β、IL-18、Fe2+含量、GSH、MDA水平降低，淀粉酶含量升高（P＜0.05或P＜0.01）。高车前苷联合RSL3组较高车前苷组，细胞Fe2+含量与MDA水平升高（P＜0.01或P＜0.01）。见图2B～G。

图2 高车前苷对雨蛙素诱导的小鼠胰腺癌腺泡细胞的炎症抑制作用（n=3）

2.1.3 高车前苷对雨蛙素诱导266-6细胞铁死亡蛋白表达的影响 与空白组比较，造模组SLC7A11、GPX4蛋白表达水平降低，PTGS2和ACSL4蛋白表达水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。与造模组比较，高车前苷组SLC7A11、GPX4表达水平升高，PTGS2和ACSL4蛋白表达水平降低（P＜0.01）。同时，与高车前苷组比较，高车前苷联合RSL3组SLC7A11、GPX4蛋白表达水平降低，PTGS2和ACSL4蛋白表达水平升高（P＜0.01）。见图3。

图3 高车前苷对细胞铁死亡蛋白表达水平的影响（n=3）

2.2 细胞circDNMT3B、miR-20b-5p、Slc7a11 mRNA表 达水平

与空白组比较，造模组miR-20b-5p、circDNMT3B mRNA表达量升高，SlC7A11 mRNA表达量降低（P＜0.01）。与造模组比较，高车前苷组miR-20b-5p mRNA表达量降低，circDNMT3B、Slc7a11 mRNA表达量升高（P＜0.01）。见图4。

图4 高车前苷对circDNMT3B、SlC7A11、miR-20b-5p 基因表达水平的影响（n=3）

2.3 高车前苷调节细胞circDNMT3B/miR-20b-5p/SLC7A11轴对铁死亡的影响

2.3.1 RT-qPCR检测266-6细胞circDNMT3B的基因 与对照组比较，基因敲低组miR-20b-5p、circDNMT3B、Slc7a11 mRNA表达量减少（P＜0.05）。见图5。

图5 RT-qPCR检测266-6细胞circDNMT3B的基因敲低（n=3）

2.3.2 circDNMT3B基因敲低对细胞损伤的影响 流式细胞凋亡实验结果显示，对照组细胞凋亡率高于造模组，基因敲低组细胞凋亡率低于对照组（P＜0.01）。对照组细胞活力低于造模组，基因敲低组细胞活力高于对照组（P＜0.05）。造模组细胞的淀粉酶含量低于对照组，基因敲低组细胞淀粉酶含量高于对照组（P＜0.05或P＜0.01）。对照组炎症因子IL-1β、IL-18、IL-6表达水平高于造模组，基因敲低组炎症因子IL-1β、IL-6表达水平高于对照组（P＜0.05）。见图6。

图6 circDNMT3B的基因敲低对细胞炎症水平、细胞凋亡的影响（n=3）

2.3.3 circDNMT3B基因敲低对细胞铁死亡的影响 与对照组比较，基因敲低组SLC7A11、GPX4蛋白表达水平降低，PTGS2、ACSL4蛋白表达水平升高（P＜0.05）。基因敲低组Fe2+含量、GSH和MDA的表达水平高于对照组（P＜0.05或P＜0.01）。见图7。

图7 circDNMT3B的基因敲低对AP细胞铁死亡的影响（n=3）

3 讨论

AP是一种炎症性疾病，常见病因多是胆结石或者酒精性因素。AP多采用保守治疗，而AP缺乏的特异性靶向治疗可能是导致其高病死率主要原因[17]，这也意味着需要对AP的临床发病机制进行更深入的研究。多项研究表明，AP的发生、发展与胰腺腺泡细胞铁死亡密切相关[18-19]，且SAP往往伴随肺[20]、肾等器官的损伤甚至衰竭[21]。而关于铁死亡如何促进AP的发生、发展，甚至进展为重症AP的研究机制尚不明确。

本研究采用小鼠胰腺腺泡266-6细胞系造模AP体外模型[22]，发现高车前苷能够逆转雨蛙素诱导的AP细胞凋亡抑制作用，而铁死亡诱导剂RSL3会促进AP细胞死亡。雨蛙素诱导AP的发生、发展与细胞铁死亡密切相关，细胞的铁死亡可能促进了AP的发展。本研究中GPX4抑制剂RSL3会促进雨蛙素诱导的AP细胞死亡，发现铁死亡可能参与了细胞凋亡的调控。细胞凋亡水平与AP炎症严重程度呈负相关，高水平凋亡能保护细胞免受损伤[23]。同时，高车前苷能够降低雨蛙素诱导的AP细胞的炎症作用，这种炎症调控能力可能是通过调节细胞铁死亡水平来实现的。雨蛙素诱导AP组SLC7A11、GPX4表达水平明显降低，而PTGS2、ACSL4表达增多，这提示AP抗氧化能力降低，铁死亡发生增多。但高车前苷可以上调SLC7A11、GPX4的表达，下调IL-1β、IL-18、Fe2+、MDA、PTGS2、ACSL4的表达水平，提示高车前苷可以通过调节细胞铁死亡水平从而降低炎症损伤。

值得注意的是，本研究发现高车前苷能够通过上调circDNMT3B的表达、降低miR-20b-5p的表达来实现细胞SLC7A11、GPX4表达的上调，从而调控细胞铁死亡与AP的炎症水平。而SLC7A11的表达能够让细胞恢复氧化还原稳态与存活[24]，而且SLC7A11可以保护细胞免受铁死亡[25]。高车前苷能够调节雨蛙素诱导后的小鼠胰腺腺泡细胞增殖活性，提示其对雨蛙素导致的细胞损伤具有一定保护作用。本研究中，高车前苷降低了细胞炎症介质水平，但造成淀粉酶水平反而升高的现象。这可能提示高车前苷具有良好的抗炎作用，但在此时高车前苷未能足够早地阻止造模引发的初始细胞损伤。GPX4是依赖于GSH的含硒酶，在线粒体与细胞质中可以催化过有毒的过氧化脂质还原成无毒的脂醇[26]，其与SLC7A11能够在细胞抗氧化系统中一起抵抗铁死亡的发生[27]，是细胞GSH-GPX4抗氧化系统中重要组成成员[28]，细胞发生铁死亡时表达减少。MDA是细胞铁死亡脂质氧化的中间代谢产物，Fe2+的积累是铁死亡的标志之一，而PTGS2是铁死亡相关基因[29]，它们表达的升高往往提示铁死亡的发生。PTGS2负责催化前列腺素的合成，其活性的增加导致脂质过氧化物的生成导致铁依赖性的程序性死亡[30]。

高车前苷能够在抗氧化系统中发挥作用，可以调节circDNMT3B、miR-20b-5p与SLC7A11之间的分子机制，从而实现降低AP细胞炎症与保护细胞的作用[31]。有文献报道，高车前苷通过AMPK/TFEB途径促进自噬，能够减轻高血糖导致的血管内皮细胞凋亡[32]。circDNMT3B存在与miR-20b-5p互补的碱基，其靶基因是miR-20b-5p[33]。本研究发现，circD-NMT3B基因的敲低能使细胞凋亡水平降低，同时细胞淀粉酶含量、Fe2+、IL-1β、IL-6、MD、PTGS、ACSL4表达水平升高，而SLC7A11、GPX4表达降低，提示circDNMT3B基因的敲低可以促进AP细胞铁死亡的发生，也意味着circDNMT3B基因在AP中起到保护性作用。circDNMT3B基因在雨蛙素诱导的266-6细胞中可能起着一定的保护性作用，circDNMT3B的基因敲低可以导致AP细胞损伤，表现为细胞的炎症水平增加、淀粉酶含量的增加、细胞凋亡的抑制。也有文献发现，沉默circDNMT3B基因的表达可以促进脓毒症大鼠的氧化损伤并影响肠道组织中炎症因子水平[33]。

铁死亡促进AP炎症反应，可能与miR-20b-5p有关。miR-20b-5p已被研究证明能够在细胞增殖、分化、细胞凋亡和血管生成中起到调控作用[34-35]。有学者构建的大鼠模型和体外模型研究证明miR-20b-5p可以通过靶向Akt3来调节自噬，进而抑制炎症和细胞凋亡，进而抑制SAP发生[36]。而在高车前苷抑制雨蛙素诱导AP细胞铁死亡实验中，circDNMT3B、SLC7A11的表达是升高的，miR-20b-5p表达是降低的。这表明三者可能存在靶向调控关系，circDNMT3B与SLC7A11在雨蛙素诱导的AP铁死亡中发挥重要作用，而miR-20b-5p起到促进AP炎症作用，且circD-NMT3B可以负调控miR-20b-5p的表达[37]。本研究的局限性是使用小鼠胰腺腺泡266-6细胞作为AP的模型，也不能反映AP时机体胰腺与各自器官的联系与免疫反应作用、以及真实人体胰腺腺泡细胞的完整性作用。因此，miR-20b-5p、circDNMT3B与SLC7A11之间具体的靶向关系仍然需要进一步验证，未来需要更多的体内实验验证，下一步继续动物体内验证这个调控机制作用。

综上所述，本研究通过构建体外小鼠胰腺腺泡细胞AP模型，研究发现高车前苷能够通过调控circD-NMT3B/miR-20b-5p基因的表达，使SLC7A11与GPX4在细胞中表达升高，从而降低雨蛙素诱导的小鼠266-6细胞铁死亡水平和对AP细胞损伤起到保护性作用。且circDNMT3B基因能够在雨蛙素诱导的小鼠AP细胞损伤中起到保护性作用，这有可能为研究AP治疗与铁死亡发生、发展提供一个新的切入点。

作者贡献声明：盛山峰负责实验操作、研究过程的实施、论文起草、论文框架及统计分析；滕肖和盘明圆负责数据校对和制图；庄智全负责论文修订、翻译及最终定稿；李峥负责项目设计、争取资金、确定写作思路、指导写作过程及最终定稿。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Study of mechanistic on how homoplantaginin influence ferroptosis in acute pancreatitis cells through the regulation of the circDNMT3B/miR-20b-5p/SLC7A11 axis

SHENG Shanfeng1 TENG Xiao1 PAN Mingyuan2 ZHUANG Zhiquan1 LI Zheng1

1.Wuming School of Clinical Medicine, Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530199, China; 2.Second Clinical Medical College, Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region,Nanning 530007, China

[Abstract] Objective To explore the molecular mechanisms by which homoplantaginin regulates ferroptosis in acute pancreatitis (AP) cells through the circDNMT3B/miR-20b-5p/SLC7A11 axis. Methods Experiment 1 involved the blank group, the model group, the homoplantaginin treated group, and the homoplantaginin combined with RSL3 treated group. Experiment 2 involved the model group, the control group, and the gene knockdown group. The AP cell model was induced in mouse 266-6 cells using caerulein. The biological characteristics of caerulein-treated 266-6 cells were assessed using CCK8, flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay, RT-qPCR, and Western blot analysis. Results Compared with the control group, the cells in the high rutin group showed decreased levels of interleukin (IL) -1β, IL-18, malondialdehyde, PTGS2 and ACSL4, as well as Fe2+ content and glutathione, while the expression levels of SLC7A11 and GPX4 increased (P＜0.05). Compared with the control group, the expression of miR-20b-5p in the high rutin group was downregulated, while the expressions of circDNMT3B and Slc7a11 were upregulated(P＜0.05). Compared with the control group, the inflammatory level of cells in the gene knockdown group increased, the content of amylase increased, and the apoptosis of AP cells decreased (P＜0.05). Conclusion Homoplantaginin can regulate ferroptosis in AP cells by modulating the circDNMT3B/miR-20b-5p/SLC7A11 axis, upregulating circDNMT3B expression, and downregulating miR-20b-5p expression, thereby enhancing the expression of SLC7A11 and GPX4. This modulation ultimately reduces the inflammation levels in AP cell induced by caerulein and protects cells from ferroptosis. Furthermore, the circDNMT3B gene can play a protective role in AP cell damage induced by caerulein.

[Key words] Homoplantaginin; Acute pancreatitis; Ferroptosis; SLC7A11; circDNMT3B

[中图分类号] R57

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）02（b）-0027-09

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25071319

[基金项目] 广西自然科学基金资助项目（2023GXNSFAA026206）。

[通讯作者] 李峥（1973.1-），男，硕士，主任医师，硕士生导师；研究方向：急性胰腺炎，器官损伤。

（收稿日期：2025-07-06）

（修回日期：2025-11-17）