卵巢癌（ovarian carcinoma，OC）是常见妇科恶性肿瘤，也是全球妇科恶性肿瘤致癌死亡主因。上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）占卵巢癌90%，发病无特异性，难发现，侵袭性强、易远处扩散和复发转移，预后差[1-3]，缺乏有效早期诊断方法，因此寻找新的生物标志物与治疗靶点对其诊断和治疗至关重要。

miR-200c 是提示EOC 细胞侵袭性的分子标志物，其表达水平降低会增加患者治疗后复发风险，可作为癌症复发潜在预测因子和治疗靶点[4]。circRNA在不同恶性肿瘤疾病中存在且有差异性和特异性表达，能调节肿瘤相关基因转录及转录后水平，与肿瘤转移和进展显著相关[5-6]。研究表明，磷酸酶PPM1F是整合素活性负调控因子，对控制肿瘤细胞侵袭至关重要[7]。PPM1F通过调节ITGB1磷酸化影响卵巢癌发生和发展[8]，miR-200c可下调PPM1F抑制乳腺癌迁移侵袭[9]。目前miR-200c、circRNA、PPM1F 三者间调控关系及作用方式不明确。本研究将通过体外实验，研究miR-200c、靶circRNA、PPM1F 间调控关系及对EOC 细胞生长转移等的影响，为EOC 早期诊断及治疗提供新思路和理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂来源

实验所用SKOV3 细胞（货号：iCell-h195）、A2780细胞（货号：iCell-h004）均来自上海赛百慷生物技术股份有限公司。

miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stemloop）（货号：22112-01）购自上海吐露港生物科技有限公司；引物合成、TsingZol Total RNA Extraction Reagent（货号：TSP401）、RNAprep FastPure Tissue&Cell Kit（货号：TSP413）、SynScript®ⅢRT SuperMix for qPCR（+gDNA Remover）（货号：TSK314M）、Arti-CanATM SYBR qPCR Mix（货号：TSE501）购自北京擎科生物科技有限公司；DMEM（货号：SH30243.01B）、胎牛血清（货号：SH30084.03）、双抗（货号：SV30010）购自美国Hyclone公司；胰酶（货号：25200072）购自美国Grand Island Biological Company；PBS（货号：C10010500BT）购自美国Life 公司；FITC Annexin V and PI Apoptosis Kit（货号：C035）购自GeneCodex 公司；jetPRIME Transfection Reagent（货号：PT-114-75）购自法国PolyPlus-transfection 公司；结晶紫（货号：C0121）购自碧云天生物技术有限公司；BD Matrigel（货号：356234）购自美国BD Biocoat 公司；多聚甲醛固定液（中性）（货号：G1101）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；一抗PPM1F（货号：17020-1-AP）、一抗GAPDH（货号：60004-1-Ig）均购自美国Proteintech 公司；羊抗兔二抗（货号：111-035-003）、羊抗鼠二抗（货号：115-035-003）购自美国Jackson公司。

1.2 细胞培养及分组

1.2.1 细胞培养 SKOV3 细胞培养基、A2780 细胞培养基均加入DMEM+10%FBS+1%P/S；培养条件：37 ℃，5% CO2；细胞均处于对数生长期。

1.2.2 分组 Control 组：A2780 细胞系加PBS；NC 组：A2780 细胞系加vector 对照；circ-PHC3-OE 组：A2780细胞系用靶circRNA慢病毒过表达；hsa-miR-200c-3p mimics 组：A2780 细胞系用miR-200c 模拟物转染；circ-PHC3-OE+hsa-miR-200c-3p mimics 组：A2780细胞系用靶circRNA慢病毒过表达＋miR-200c模拟物。

1.3 方法与步骤

1.3.1 hsa-miR-200c 靶向circRNA 的搜索 从mirBase数据库获取hsa-miR-200c序列；查阅targetScan官网，查阅has-miR-200C-3p、hsa-miR-200c-5p 和PPM1F的互作关系；用miRanda软件搜索所有circRNA 序列，对于多个miRNA 对应于同一靶位点的情况，使用贪心算法选取得分最高且自由能最低的一对。运行参数为：-sc 140–en-20-scale 4–strict，获得所有hsamiR-200c靶向的circRNA。

1.3.2 RT-qPCR检测mRNA 采用Trizol法提取SKOV3细胞和各组A2780细胞总RNA，使用反转录试剂盒将RNA合成cDNA：其中miRNA（hsa-miR-200c-3p与U6）采用含特异性茎环引物的茎环反转录试剂盒，mRNA（GAPDH、PPM1F）与circRNA（circ-PHC3-1、circ-PHC3-2）使用常规反转录试剂盒，然后实时荧光定量PCR 检测，反应体系如下：ArtiCanATM SYBR qPCR Mix 10 μl，正向引物（10 μmol/L）0.4 μl，反向引物（10 μmol/L）0.4 μl，cDNA 模板 100 ng，50×ROX Reference Dye Ⅰ/Ⅱ 0.4 μl，ddH2O加至20 μl；ArtiCanATM SYBR qPCR Mix 25 μl，正向引物（10 μmol/L）1.0 μl，反向引物（10 μmol/L）1.0 μl，模板DNA 250 ng，50×ROX Reference Dye Ⅰ/Ⅱ1.0 μl，ddH2O 加至50 μl；终浓度：ArtiCanATM SYBR qPCR Mix 1×，Forward Primer（10 μmol/L）0.2 μmol/L，Reverse Primer（10 μmol/L）0.2 μmol/L，50×ROX Reference Dye Ⅰ/Ⅱ。

使用移液器吹打混匀体系并短暂离心，置于荧光定量PCR 仪上扩增检测，反应程序：预变形95 ℃1 min，1 个循环；循环反应95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃10～15 s，共40个循环，72 ℃采集荧光信号，用2-ΔΔCt衡量目的基因的相对表达。实验设3 个复孔。引物序列见表1。

表1 引物序列

注 miRNA 检测采用茎环逆转录法，使用特异性茎环引物进行逆转录，后续qPCR 采用miRNA 特异性正向引物与通用反向引物配对扩增；U6作为miRNA检测的内参基因，GAPDH作为mRNA/circRNA检测的内参基因。

基因名称GAPDH正向引物反向引物PPM1F正向引物反向引物circ-PHC3-1正向引物反向引物circ-PHC3-2正向引物反向引物Has miR-200c-3p茎环逆转录引物引物序列（5’~3’）引物长度（bp）115 TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT 154 ACTTTGCTGTGTTTGATGGTCA CTGAGAAACATCTGGTCGGTG 148 TGCTGTACAGTCTGACATTCCTG GTACTGCTGGTTGTTGTTGACAC 135 TCCTGTTGTCTCGTCGTC TGGTGGTACTGCTGGTTG 72正向引物通用反向引物U6（内参）正向引物反向引物GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACTCCA TCAT TGCGCTAATACTGCCGGGTAATG CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT 94 CGCTTCGGCAGCACATATAC AAATATGGAACGCTTCACGA

1.3.3 划痕实验 将各组A2780 细胞以3.5×105 个/孔（6 孔板）进行铺板，设3 个复孔，在5% CO2，37 ℃条件下过夜培养24 h后。用10 μl枪头垂直于孔板制造宽度一致的细胞划痕；吸去细胞培养液，用PBS 冲洗孔板3 次以洗去细胞碎片，加入相应无血清培养基；加入DMEM、10%FBS 和1%双抗处理，将培养板放入培养箱培养，分别在0、24 h 取出拍照。实验重复3次。

1.3.4 Transwell 实验 每个transwell 小室加50 μl 稀释5 倍的基质胶，放入37℃培养箱静置30 min 凝胶化；消化经条件培养48h 的各组A2780 细胞，用PBS 清洗1～2 次，用无血清培养基重悬细胞，调整密度至1.5×105/ml；将200 μl细胞悬液加入transwell小室。在24孔板下室中加入600 μl含10%FBS 的培养基，放入37 ℃培养箱培养48 h；取出transwell 小室并去除孔中培养液，PBS 洗2 次；用4%多聚甲醛固定细胞10 min，PBS洗2 次；用结晶紫染色10 min，PBS 洗2 次，用棉签擦除上室细胞；显微镜下观察迁移细胞，选3 个视野拍照，对染色细胞计数统计，评估细胞迁移能力和侵袭性。实验重复3次。

1.3.5 CCK8实验 将各组A2780细胞以10 000个/孔的比例接种到96孔板，于5%CO2，37 ℃培养过夜。每孔加入100 μl细胞悬液，培养24、48 h后，每个时间点每组进行3 次实验，在细胞孔周围孔加入100 μl无菌PBS，细胞转染后，每孔加入10 μl CCK8 溶液，于5% CO2、37 ℃培养箱培养3 h；酶标仪测定各孔450 nm 处的吸光度值。实验重复3次。

1.3.6 Western blot检测 从各组A2780细胞提取蛋白，用BCA法测蛋白浓度。进行电泳和转膜，封闭培育1 h。4℃条件下，一抗PPM1F 25 μg（1∶1 000）、GAPDH 5 μg（1∶5 000）与各组蛋白结合，PBST洗涤3次，每次10 min；羊抗鼠二抗（1∶10 000）、羊抗兔二抗（1∶10 000）都分别和一抗PPM1F（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）温育；PBST 洗涤3 次，每次10 min；显色1.5～2.0 min，翻转PVDF，用凝胶成像系统观察结果。实验重复3次。

1.3.7 流式凋亡实验 收集各组A2780 细胞上清，用0.25%胰酶消化并收集全部细胞，200 g，4 ℃离心5 min，离心半径13cm 收集细胞；PBS 洗涤2 次，每次200 g，4 ℃离心5 min，离心半径13cm；吸弃PBS，加入100 μl 1×Binding Buffer 重悬细胞；加入5 μl Annexin FITC 和2 μl PI，混匀；避光、室温反应15 min；加入400 μl 1×Binding Buffer，混匀后放置于冰上，1 h 内用流式细胞仪检测。实验设3个复孔，实验重复3次。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hsa-miR-200c靶向circRNA搜索结果

从mirBase 数据库获取hsa-miR-200c 序列见图1。

图1 hsa-miR-200c序列

发现hsa-miR-200c 有两个成熟体序列，hsamiR-200c-5p 和has-miR-200c-3P，查阅targetScan 官网，发现has-miR-200C-3P、PPM1F有相互作用关系，hsa-miR-200c-5p无互作关系，见表2。通过miRanda软件搜索circRNA 序列。获得所有hsa-miR-200c 靶向的circRNA。其中has-miR-200C-3P 和circ-PHC3-OE的得分最高且自由能最低，见表3、4。

表2 2hsa-miR-200c和PPM1F结合信息

项目Position 719-725 of PPM1F3’UTRhsamiR-200c-3p Position 719-725 of PPM1F3’UTRhsamiR-200b-3p Position 719-725 of PPM1F3’UTRhsamiR-429 Position 866-873 of PPM1F 3’UTR hsamiR-429 Position 866-873 of PPM1F3’UTR hsamiR-200c-3p靶区（上）与miRNA（下）的预测性关联配对5’...GGUCUAAUUCCGAAGCAGUAUUC...3’AGGUAGUAAUGGGCCGUCAUAAU|||||||位点类型7mer-m8预测靶点的综合分数-0.13预测靶点的综合分数百分位数88加权分值-0.13分支长度5.579物种间进化评分值0.81预测的相对KD-3.885 5’...GGUCUAAUUCCGAAGCAGUAUUC...3’AGUAGUAAUGGUCCGUCAUAAU|||||||7mer-m8-0.13 88-0.135.579 0.81-3.885 5’...GGUCUAAUUCCGAAGCAGUAUUC...3’UGCCAAAAUGGUCUGUCAUAAU|||||||7mer-m8-0.12 87-0.125.579 0.81-3.027 5’...AGGAACCUUUUUUUG--CAGUAUUA...3’UGCCAAAAUGGUCUGUCAUAAU|||||||8mer -0.28 98-0.215.244 0.88-4.017 5’...AGGAACCUUUUUUUGCAGUAUUA...3’AGGUAGUAAUGGGCCGUCAUAAU|||||||8mer -0.26 97-0.205.244 0.88-4.874

表3 基于miranda预测的miRNA靶向circRNA统计

miRNA ID 靶circRNA 匹配总得分总匹配自由能最大匹配自由能miRNA长度靶circRNA长度匹配起始位点hsa-miR-200c-164-27.02最大匹配得分164-27.02 23 658 455 3p hsa-miR-200c-3p 168-25.42 168-25.42 23 2580 2242 hsa-miR-200c-3p hsa_circ_0005228|chr3:169863210-169896726-|NM_024947|PHC3 hsa_circ_0041308|chr17:1577039-1584348-|NM_006445|PRPF8 hsa_circ_0041309|chr17:1577039-1584984-|NM_006445|PRPF8 168-25.42 168-25.42 23 2793 2455

表4 miRNA靶向circRNA宿主基因信息

注 “-”表示未知。

circRNA ID 所在染色体起始位置终止位置染色体链方向hsa_circ_0005228 chr3 169863210 169896726所在宿主基因的转录本编号NM_024947所在宿主基因的名称PHC3 hsa_circ_0000294 chr11 45880295 45904786--所在宿主基因的位置注释信息ANNOTATED、CDS、coding、INTERNAL、OVCODE、OVEXON ANTISENSE、CDS、coding、INTERNAL、UTR3 NM_001127457 CRY2

2.2 hsa-miR-200c-3p、circ-PHC3-2、PPM1F在A2780、SKOV3细胞系中的表达

A2780 组hsa-miR-200c-3p mRNA 表达量高于SKOV3组，A2780组circ-PHC3-2、PPM1F mRNA 表达量低于SKOV3组（P＜0.05）。见图2。

图2 各组hsa-miR-200c-3p、circ-PHC3-2、PPM1F mRNA表达量（n=3）

与SKOV3组比较，aP＜0.05。

2.3 miR-200c、靶向circRNA对细胞迁移的影响

与NC 组比较，circ-PHC3-OE 组细胞迁移率（0、24 h）升高，hsa-miR-200c-3p mimics 组细胞迁移率降低（P＜0.05）；与hsa-miR-200c-3p mimics组比较，circ-PHC3-OE+hsa-miR-200c-3p mimics组细胞迁移率（0、24 h）升高（P＜0.05）。见图3、4。

图3 划痕图（n=3）

图4 各组细胞中细胞迁移率（n=3）

与NC组比较，aP＜0.05；与has-miR-200c-3p mimics组比较，bP＜0.05。

2.4 miR-200c与其靶向circRNA对细胞侵袭的影响

Transwell 实验结果显示，与NC 组比较，circ-PHC3-OE 组细胞侵袭率升高，hsa-miR-200c-3p mimics组降低（P＜0.05）；与hsa-miR-200c-3p mimics组比较，circ-PHC3-OE+hsa-miR-200c-3p mimics 组细胞侵袭率升高（P＜0.05）。见图5、6。

图5 显微镜下染色细胞

图6 miR-200c与其靶向circRNA对细胞侵袭的影响（n=3）

与NC组比较，aP＜0.05；与 hsa-miR-200c-3p mimics组比较，bP＜0.05。

2.5 miR-200c与其靶向circRNA对细胞活力的影响

CCK8 实验结果显示，与NC 组比较，circ-PHC3-OE 组细胞活力（24、48 h）升高，hsa-miR-200c-3p mimics 组的降低（P＜0.05）；与hsa-miR-200c-3p mimics 组比较，circ-PHC3-OE+hsa-miR-200c-3p mimics组细胞活力（24、48 h）升高（P＜0.05）。见图7。

图7 miR-200c与其靶向circRNA对细胞活力的影响（n=3）

与NC组比较，aP＜0.05；与 hsa-miR-200c-3p mimics组比较，bP＜0.05。

2.6 miR-200c 与其靶向circRNA 对PPMIF 蛋白相对表达量的影响

Western blot法检测结果显示，与NC组比较，circ-PHC3-OE 组的PPMIF 蛋白表达水平升高，hsa-miR-200c-3p mimics 组降低（P＜0.05）；与hsa-miR-200c-3p mimics 组比较，circ-PHC3-OE+hsa-miR-200c-3p mimics组PPMIF蛋白表达水平升高（P＜0.05）。见图8。

图8 miR-200c、靶向circRNA对PPMIF蛋白相对表达量的影响（n=3）

A：蛋白条带图。1～5：Control组、NC组、circ-PHC3-OE组、hsa-miR-200c-3p mimics组、circ-PHC3-OE+hsa-miR-200c-3p mimics组。B：细胞中PPMIF蛋白相对表达水平。与NC组比较，aP＜0.05；与 hsa-miR-200c-3p mimics组比较，bP＜0.05。

2.7 miR-200c与其靶向circRNA对细胞凋亡的影响

流式凋亡实验结果显示，circ-PHC3-OE 组早晚期及总细胞凋亡率最低，hsa-miR-200c-3p mimics 组最高。与NC 组比较，circ-PHC3-OE+hsa-miR-200c-3p mimics 组早期、晚期及总细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与has-miR-200c-3p mimics 组比较，circ-PHC3-OE+has-miR-200c-3p 组早期、晚期及总细胞凋亡率降低（P＜0.05）。见图9、10。

图9 流式凋亡图

图10 早晚期及总细胞凋亡率（n=3）

与NC组比较，aP＜0.05；与hsa-miR-200c-3p mimics组比较，bP＜0.05。

3 讨论

EOC分为Ⅰ型及Ⅱ型。Ⅰ型为早期肿瘤，病情发展缓慢，主要含低级别子宫内膜癌、卵巢浆液性腺癌等；Ⅱ型在患者中占比高，具侵袭性生长等特点，主要含高级别浆液性癌及子宫内膜癌等，患者死亡率高，主因化学耐药导致的复发死亡[10]。目前OC 治疗方案有减瘤术、术后辅助治疗及分期手术，多数患者需术后辅助治疗，包括靶向治疗、免疫治疗等[11]。肿瘤治疗多以促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖为方向[12]。因此明确miR-200c、circRNA、PPM1F 调控EOC 增殖侵袭凋亡等的作用机制，有助于更好治疗EOC并预防复发。

已有研究发现环状RNA（circRNA）是恶性肿瘤重要调节因子，通过调节自噬在肿瘤发生、发展中发挥重要作用[13-14]。研究发现circRNA 可调控卵巢癌耐药，抑制复发[15]。在喉鳞状细胞癌、甲状腺癌等肿瘤中起促癌作用。circRNA 000121 在PTMC（L）患者甲状腺癌组织标本中高表达[16]。本研究中circ-PHC3-2在EOC 细胞系中也高表达。研究显示上调circRNA ID 可加快喉鳞状细胞癌细胞增殖、侵袭，降低凋亡[17]。本研究上调circRNA 后，EOC 细胞迁移与侵袭加快、凋亡降低、活力增加。可见，circRNA 在EOC 中也起促癌作用。

微RNA（microRNA，miRNA）是非编码小分子RNA，在肿瘤的发生、发展中起重要的作用[18]。既往研究表明，miR-200c 是肿瘤抑制性miRNA，在多种癌症中存在，其高表达与改善预后相关，是影响EOC 发生的保护因素[19-21]。本研究表明，过表达miR-200c可抑制EOC 细胞迁移与侵袭、降低细胞活力、促进细胞凋亡，遏制EOC 进展。研究发现circRNA_0044556 下调通过miR-665 抑制三阴性乳腺癌细胞的恶性进展和紫杉醇耐药性[22]。为了进一步证明miR-200c 与circRNA 的调控关系，本研究在hsa-miR-200c-3p mimics 的基础上加上circ-PHC3-OE 来干预EOC 细胞，结果显示，靶circRNA 可通过吸附miR-200c，上调EOC细胞增殖、侵袭与迁移，增加细胞活力，下调细胞凋亡，促进了EOC进展。

PPM1F 被证明在多种肿瘤的进展中发挥多种生物学功能，其再表达挽救了miR-149介导的细胞迁移和侵袭抑制[23]。如敲低PPM1F可抑制裸鼠肿瘤形成[8]。本研究为验证circRNA、miR-200c与PPM1F的调控关系，用PPM1F 慢病毒感染EOC 细胞系，结果显示，miR-200c 与PPM1F 在EOC 细胞中表达呈负相关，circRNA 促进PPM1F 蛋白在EOC 细胞中的表达，miR-200c抑制PPM1F蛋白在EOC细胞中的表达。结合本研究miR-200c、circRNA 对EOC的细胞功能实验结果，发现miR-200c 通过负调控PPM1F 的表达遏制EOC的进展。

靶circRNA 通过吸附miR-200c，上调肿瘤的增殖、侵袭、迁移，下调肿瘤细胞凋亡，从而促进上皮性卵巢癌的进展；miR-200c 通过负调控PPM1F 的表达遏制上皮性卵巢癌的进展。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Effect of miR-200c and its targeted circRNA regulating PPM1F on the growth and metastasis of epithelial ovarian cancer

ZENG Zhiping1 XU Xinyan2 WEI Mengke1 WEI Qiankun3 LI Fengjuan4 ZHANG Jing2
1.School of Public Health, Xinjiang Medical University, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830000, China;2.Department of Gynecology, Urumqi Maternal and Child Health Hospital, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830001, China; 3.School of Medicine, Shihezi University, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Shihezi 832000, China;4.Health Management Center, Urumqi Youai Hospital, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830049, China

[Abstract] Objective To investigate effects of PPM1F, miR-200c and its target circRNA on epithelial ovarian cancer cell growth and metastasis, and regulatory relationships among them.Methods miRanda software predicted target circRNA for miRNA.RT-qPCR assessed expression levels of miR-200c, target circRNAs and PPM1F in transfected SKOV3 and A2780 cells.Cells were cultured in DMEM with 10%FBS and 1% P/S.In the A2780 cell line, the following treatments were applied: addition or use of PBS (control group), vector control (NC group), overexpression of target circRNA by lentivirus (circ-PHC3-OE group), transfection with miR-200c mimics (hsa-miR-200c-3p mimics group),and overexpression of target circRNA combined with miR-200c mimics (circ-PHC3-OE+hsa-miR-200c-3p mimics group).Migration distance was calculated in scratch assay,and migration rate was determined.Transwell assay was measured invasion capacity, CCK8 assay was measured cell viability, the expression relationship between the target circRNA, miR-200c and PPM1F was detected by Western blot method, and apoptosis and cell cycle assays were assessed cell apoptosis and proliferation.Results Compared with NC group, circ-PH C3-OE group had increased cell migration, invasion, viability, and PPMIF protein expression, and reduced apoptosis; hsa-miR-200c-3p mimics group had opposite effects (P＜0.05).Compared with hsa-miR-200c-3p mimics group, circ-PH C3-OE+hsa-miR-200c-3p mimics group cell migration, invasion, viability， and PPMIF protein expression increased, and apoptosis reduced (P＜0.05).Conclusion Targeted circRNA promotes epithelial ovarian cancer progression by binding miR-200c to upregulate tumour proliferation, invasion and migration and downregulate apoptosis.Conversely, miR-200c inhibits progression by negatively regulating PPM1F expression.

[Key words] miR-200c; circRNA; PPM1F; Epithelial ovarian cancer

[中图分类号] R737.3

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）02（c）-0045-09

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25072487

[基金项目] 新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目（2021D01A43）。

[通讯作者] 张晶（1982.3-），女，硕士，主任医师，乌鲁木齐市妇幼保健院妇科副主任，硕士生导师；研究方向：妇科肿瘤、妇科内分泌、盆底重建技术。

（收稿日期：2025-07-31）

（修回日期：2025-12-04）