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帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是第二常见的神经退行性疾病，其核心病理特征为中脑多巴胺能神经元进行性丧失，且与神经元内α-突触核蛋白的聚集密切相关[1]。预计2030 年中国PD 患者将达494 万，占全球一半[2]。PD 目前已成为重大公共卫生问题，但病因仍不明确且缺乏根治方法，亟须探索新的发病机制与治疗靶点。

含有Tudor 和KH 结构域蛋白（Tudor and KH domain containing protein，TDRKH）具有重要生物学功能：Tudor 结构域常与RNA 结合或蛋白质互作，KH 结构域可结合特定RNA[3]。其能与PIWI 蛋白形成复合体，调控哺乳动物生殖细胞中piRNA的生物合成和转座子控制，还可结合多种piRNA 维持转座子沉默，从而防止基因组不稳定[3-5]。

长散布核元件-1（long interspersed nuclear element-1，LINE-1）是目前唯一已知的活性自主逆转录转座子，约占人类基因组17%[6]。LINE-1 的异常激活与PD 等多种神经退行性疾病密切相关，可能导致DNA 损伤、基因组不稳定和神经细胞功能受损，甚至引发神经元死亡与神经炎症[7]。

综上所述，piRNA-转座子轴在神经退行性疾病中作用日益凸显。然而，piRNA 通路关键基因（如TDRKH）如何调控LINE-1 活性、是否参与多巴胺能神经元死亡仍不明确。因此，深入探讨TDRKH 在PD模型中对LINE-1 及细胞凋亡的调控作用，对理解PD发病机制、寻找新的治疗策略意义重大。

1 材料与方法

1.1 材料

人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y 来自空军军医大学唐都医院药剂科，人胚胎肾细胞系HEK293T保存于空军军医大学唐都医院外科实验室。细胞培养相关试剂及药物：DMEM 培养基（货号：10013150，美国CORNING 公司）；胎牛血清（货号：FSD500，苏州依科赛生物科技股份有限公司）；青链霉素混合液（货号：P1400，北京索莱宝科技有限公司）；0.25%胰蛋白酶消化液（货号：SL6010，北京酷来搏科技有限公司）；1-甲基-4-苯基吡啶离子（1-Methyl-4-phenylpyridinium，MPP+）（货号：D048，美国Sigma-Aldrich 公司）；嘌呤霉素（货号：ST551，上海碧云天生物技术股份有限公司）；CCK8 试剂盒（货号：HY-K0301，美国MCE 公司）。RT-qPCR 相关试剂及仪器：TRIzol 总RNA 提取试剂（货号：R0016，上海碧云天生物技术股份有限公司）；定量PCR专用反转录试剂盒[货号：RR047Q，宝日医生物技术（北京）有限公司]；定量PCR检测试剂盒（货号：Q331-02，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；荧光定量PCR 仪（型号：LightCycler® 480 Instrument Ⅱ，瑞士Roche 公司）。RIPA 裂解液（货号：P0013B，上海碧云天生物技术股份有限公司）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（货号：KGC4401-125，江苏凯基生物技术股份有限公司）；ECL 化学发光显影剂（货号：170-5061）、Western blot 电泳仪及转膜仪（型号：Mini-PROTEAN® Tetra）、化学发光成像仪（型号：ChemiDoc MP）均购自美国Bio-Rad 公司。TDRKH（货号：PS19752S）、LINE-1 ORF1p（货号：MA8197S）购自艾比玛特医药科技（上海）有限公司；BCL-2（货号：WL01556）、Cleaved Caspase-3（货号：WL02117）购自沈阳万类生物科技有限公司；BAX（货号：A19684）、β-actin（货号：AC026）、HRP 标记山羊抗兔IgG（货号：AS014）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（货号：C1062L，上海碧云天生物技术股份有限公司）；流式细胞仪（型号：CytoFLEX，美国Beckman Coulter公司）。

1.2 差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）的筛选与piRNA相关基因的获取

从美国国立生物技术信息中心的GEO 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载PD 相关的基因表达微阵列数据集（ID：GSE8397）。该数据集基于GPL97 芯片平台，包含了15 例PD 患者与8 名健康对照者死后内侧黑质脑组织的基因表达谱。利用GEO数据库内置的GEO2R 在线分析工具，对两组样本进行差异表达分析，获得基因表达矩阵。以“调整后P值（adjust P-value，P.adj）＜0.05 且∣log₂（fold change）∣＞0.58”为阈值，筛选出DEGs。使用R语言（4.2.1版本）中的ggplot2包绘制火山图，可视化差异表达结果。随后，在GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）中以“piRNA”为关键词检索相关基因，为保障基因与piRNA的相关性，设定筛选条件为“Relevance score＞2”且“Protein Coding”，最终获得piRNA 相关基因集合。进一步分析DEGs与piRNA相关基因之间的特异及共有部分，并通过R 语言中的VennDiagram 软件包对结果进行了可视化展示。

1.3 细胞培养、CCK8法检测与PD模型构建

SH-SY5Y和HEK293T细胞均培养于含10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗溶液的DMEM 培养基中，并于37 ℃、5% CO₂的培养箱内进行常规培养，每2～3 d更换1次新鲜完全培养基，并当细胞融合度达到约80%时，以1∶3的比例进行传代。

将SH-SY5Y 细胞悬液按每孔5×103个细胞接种于96 孔板，体积为100 μl/孔。24 h 后，分别加入不同浓度的MPP⁺（0、0.25、0.50 、1.00、2.00 mmol/L），并设置空白对照，每组3 个复孔。培养24 h 后，每孔加入10 μl CCK8 试剂，继续孵育2 h，用酶标仪在450 μm波长处测定吸光值，计算并筛选细胞活力在50%以上的浓度进行后续实验[8]。

为构建PD 细胞模型，当SH-SY5Y 细胞融合度达到80%左右时，在培养基中加入不同浓度的MPP⁺溶液（0、0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L），0 mmol/L 以等体积PBS 作为阴性对照。加药处理后，细胞继续培养48 h，随后收取细胞样本，以备后续实验分析[9-10]。

1.4 shRNA载体构建与慢病毒感染

基于Sigma-Aldrich 公司shRNA 在线设计平台（https://www.sigmaaldrich.cn/），针对人TDRKH 转录本（NM_006862）筛选已验证的特异性shRNA 序列（5’-GAAGACTATGAGCACGACGAT-3’）。随后，依据pLKO.1 载体的shRNA 克隆标准原则，委托擎科生物公司合成相应Oligo DNA 片段。将所得双链Oligo DNA 克隆至pLKO.1-U6-puro 载体中，并以空载体作为阴性对照。随后，将构建成功的重组shRNA 质粒与包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G 按4∶3∶1 的质量比例共转染至HEK293T 细胞中。转染48、72 h 后分别收集病毒上清液，经0.45 μm 滤膜过滤去除细胞碎片。用病毒上清感染SH-SY5Y细胞，继续培养72 h后，更换为含5 μg/ml 嘌呤霉素的选择性培养基进行抗性筛选。每代维持筛选压力，稳定传代培养3 代后，最终获得可稳定敲低TDRKH的细胞株。

1.5 RT-qPCR实验

采用TRIzol法提取样本总RNA，经质量检测合格后，使用反转录试剂盒将其合成cDNA作为qPCR的模板。根据SYBR Green qPCR 试剂盒的使用说明，配置20 μl 反应体系：DNA 模板3 μl、正反向引物各0.5 μl、SYBR Green 试剂10 μl、无酶水6 μl。随后，在LightCycler480系统上测定目标分子的表达量，程序设置为：①预变性（95 ℃ 30 s）、②PCR扩增（95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40个循环）、③融解（95 ℃ 5 s、60 ℃ 60 s）、④降温（50 ℃ 30 s）。以β-actin为内参基因进行归一化，通过2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。LINE-1 引物参照既往经过验证的研究[11-12]；TDRKH 与β-actin 引物序列则通过NCBI网站的Primer-BLAST在线设计工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）获取。各引物序列详细信息见表1。

1.6 Western blot实验

在收集细胞后，使用预先冷却的RIPA裂解缓冲液（其中含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂）在冰上对细胞裂解30 min。在4 ℃条件下12 000 r/min离心15 min，收集上清液以获得总蛋白样品。采用BCA 法来测定蛋白浓度，并取20 μg 的总蛋白样品与5×SDS 上样缓冲液进行混合，之后在95 ℃下加热5 min，以确保蛋白质的充分变性。使用10%或12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，并将蛋白转印至0.22 μm的PVDF膜上。在室温下，使用含有3%脱脂牛奶的TBST溶液封闭膜1 h，随后在4 ℃下过夜孵育相应的兔源一抗：TDRKH（1∶1 000）、LINE-1 ORF1p（1∶1 000）、BCL-2（1∶1 000）、Cleaved Caspase-3（1∶1 000）、BAX（1∶5 000）、β-actin（1∶10 000）。第2天，将膜与HRP标记的山羊抗兔二抗（1∶10 000）在室温下孵育1 h，随后通过ECL化学发光系统进行显影，并使用ImageJ软件对灰度值进行分析。

1.7 流式细胞术

使用Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒，严格按照试剂商给予的说明进行操作，然后通过流式细胞仪测定SH-SY5Y细胞的凋亡百分比。

1.8 统计学方法

统计学分析及可视化使用GraphPad Prism 软件（9.5.0 版本）或R 语言（4.2.1 版本）完成。计量资料采用均数±标准差（ pagenumber_ebook=67,pagenumber_book=61

±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析或Tukey检验，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD患者内侧黑质区中piRNA相关基因表达下调

生物信息学分析显示，与HC组比较，PD组中存在364个下调基因和67个上调基因。从GeneCards 数据库中筛选到72个与piRNA密切相关的基因，将364个下调基因与这72个基因进行交集分析，发现两个基因显著重叠：HENMT1和TDRKH。见图1。

2.2 MPP+诱导SH-SY5Y细胞的PD模型中TDRKH的表达

CCK8 法检测显示，与0 mmol/L 组比较，各MPP+浓度组细胞活力下降（P＜0.01），2.00 mmol/L 时已降至50%以下细胞存活率低，不利于后续实验，因此该浓度组被舍弃。RT-qPCR结果显示，HENMT1在SHSY5Y 细胞中的表达量极低，几乎检测不到其mRNA水平，因此本研究未对其进行深入探讨。与0 mmol/L组比较，0.50、1.00 mmol/L 组TDRKH mRNA 及蛋白表达量下降（P＜0.01），1.00 mmol/L 组最为明显该浓度将用于后续实验。见图2。

2.3 敲低TDRKH对LINE-1异常激活的影响

与shCtrl 组比较，shTDRKH 组LINE-1 各区域转录本的表达量升高（P＜0.01）。与shCtrl 组比较，shTDRKH 组TDRKH 蛋白表达水平降低、LINE-1 ORF1p的蛋白表达水平升高（P＜0.01）。见图3。

2.4 在PD 细胞模型中TDRKH 的低表达对细胞凋亡的影响

Western blot 法结果显示，与shCtrl 组比较，shCtrl+MPP+组BCL-2/BAX 比值降低（P＜0.01），而shTDRKH+MPP+组较shCtrl+MPP+组进一步下降（P＜0.01）。与shCtrl 组比较，shCtrl+MPP+组Cleaved Caspase-3 蛋白表达水平升高（P＜0.01），shTDRKH+MPP+组较shCtrl+MPP+组则进一步升高（P＜0.01）。流式细胞术结果表明，与shCtrl+MPP+组比较，shTDRKH+MPP+ 组凋亡细胞比例升高（P＜0.01）。见图4。

3 讨论

本研究通过整合生物信息学与体外细胞实验，系统揭示了piRNA 通路关键因子TDRKH 在PD 中的表达下调，导致对LINE-1 逆转录转座子的抑制作用丧失，最终引起多巴胺能神经元的凋亡。本研究结果显示，PD 细胞模型及患者黑质组织中TDRKH 的表达显著降低；鉴于LINE-1 全长转录本罕见，多因5’截断、缺失和倒位而失效[13-14]，检测其不同区域转录本的mRNA 水平，发现敲低TDRKH 可显著上调LINE-1 的mRNA 及蛋白表达，且TDRKH 低表达会加剧细胞凋亡[15]。这一结果不仅强化转座子失调参与神经退行性过程的观点，也与LINE-1插入多态性与PD 进展相关的结论相呼应[16-17]，为PD的分子机制提供了新的表观遗传解释。

近年来，多项研究报告逆转录转座子异常激活是阿尔茨海默病[18]、肌萎缩侧索硬化[19]等神经退行性疾病的重要推动因素，表明转座子调控失常可能是多种大脑疾病的共同通路。本研究将TDRKH 这一在生殖细胞中已明确参与piRNA 介导转座子沉默的基因引入PD 研究[20]，拓展了对piRNA 系统在神经元稳态中功能的理解。值得注意的是，TDRKH 表达下降与LINE-1 激活之间的相关性在细胞模型中得到了验证，表明其可能作为一种“表观遗传守卫”在神经元中抑制转座活性。

关于TDRKH 下调导致LINE-1 激活及细胞凋亡的具体机制，结合已有文献提出以下几种待验证的可能性：①TDRKH 是PIWI 复合体的关键组分，可通过锚定PIWIL1/2 于线粒体外膜为piRNA 加工提供平台，其下调可能通过影响piRNA 的生物合成或功能成熟，进而间接调控LINE-1 沉默，后续可通过RIPseq 等技术验证TDRKH 是否直接结合LINE-1 转录本或相关piRNA[21]。②LINE-1 激活可能引发DNA 双链断裂，激活p53 依赖的DNA 损伤应答通路诱导凋亡[22-23]。本研究中观察到的Cleaved Caspase-3 上调和BCL-2/BAX 比值下降与此机制一致，后续可使用逆转录酶抑制剂（如拉米夫定）阻断LINE-1 逆转录活性[24]，观察是否能挽救TDRKH 敲低所诱导的凋亡表型。③LINE-1 的RNA:DNA 杂交体或胞质DNA 可能激活免疫信号通路，加剧神经炎症与细胞死亡，已有研究发现胞质LINE-1 cDNA 可通过cGAS-STING通路诱导Ⅰ型干扰素反应，促进小胶质细胞激活[11,25]。④TDRKH 可能存在piRNA 非依赖性功能，其KH 结构域或直接结合并调控凋亡相关mRNA 稳定性[20]，可通过RNA-seq 鉴定其靶基因集合，揭示神经保护机制。

尽管本研究取得了一定进展，但仍存在一些局限性：首先，SH-SY5Y 细胞模型虽然经典，但无法完全模拟体内多巴胺能神经元的复杂微环境和衰老相关变化，后续研究可采用iPSC 来源的多巴胺能神经元或PD 动物模型以进一步提升生理相关性；其次，TDRKH 调控LINE-1 的具体分子机制尚未完全明确，是否依赖PIWI-piRNA 复合体或其他RNA 结合蛋白参与仍需阐明；再次，尽管本研究建立了TDRKH 与LINE-1 及凋亡的关联，但LINE-1 在其中的因果作用需通过逆转录酶抑制剂或LINE-1特异性shRNA进行实验验证。

综上所述，本研究发现TDRKH 在PD 中介导LINE-1 沉默及神经元保护的作用，强化了piRNA-转座子轴在维持神经稳态中的关键意义。未来的研究可着眼于开发以TDRKH/LINE-1 通路为靶点的小分子或表观遗传干预工具，为延缓或逆转PD 进展提供新思路。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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【作者机构】	空军军医大学唐都医院实验外科
【分类号】	R742.5
【基金】	陕西省重点研发计划项目(2023-ZDLSF-52)

基于LINE-1活性与细胞凋亡探讨TDRKH在帕金森病中的作用及机制

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