人体血压存在昼夜节律，表现为白天升高，夜间下降。其紊乱与心脑血管事件风险增加密切相关[1]。生物钟在心血管系统中发挥重要调控作用，尤其心脏昼夜节律对血压和心功能维持至关重要[2-3]。除经典的转录-翻译反馈机制外，昼夜节律还涉及非转录依赖性途径[4]。心血管组织中节律基因与代谢周期紧密相关，因此阐明心脏代谢与时钟基因协同维持血压节律的机制，对高血压及其靶器官损伤防控具有重要意义。

研究表明，针刺可调节Bmal1、Clock等时钟基因表达并改善血压昼夜节律，提示其在生物钟调控方面具有潜在优势[5-8]。但既往研究多聚焦于针灸对时钟基因的直接影响[9]，对心脏时钟基因-代谢相互作用及其在血压昼夜节律维持中的作用仍缺乏系统探讨。基于此，本研究聚焦心脏时钟基因及代谢变化，探讨电针对自发性高血压大鼠血压昼夜节律的调控作用，为电针干预非杓型高血压提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 实验动物

19周龄SPF级雄性自发性高血压大鼠24只及19周龄SPF级雄性WKY大鼠6只，体质量270~300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SYXK（京）2021-0070，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2022-0070，实验动物合格证号：110011241109913051。实验动物饲养条件为室温22~25 ℃，湿度50%，12 h/12 h明暗交替，自由摄取水食。本研究经南京中医药大学附属医院实验动物伦理委员会批准（2023DW-070-01）。

1.2 主要仪器与试剂

华佗牌电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司，型号：SDZ-Ⅲ型）；智能无创血压仪（北京软隆生物技术有限公司，型号：BP-2010A）；ABS型小动物麻醉机（上海玉研科学仪器有限公司）；质谱仪、色谱仪、色谱柱、LP涡旋振荡器（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：Q ExactiveTMHF、Vanquish UHPLC、Hypesil Gold column、88880018）；低温离心机（美国Scilogex公司，型号：D3024R）；分光光度计（美国DeNovix公司，型号：DS-11）；ABI荧光定量PCR仪（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：7500 Fast）；华佗牌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司，规格：0.25 mm×13 mm）。

缬沙坦（瑞士诺华制药有限公司，生产批号：X3485）；异氟烷（瑞沃德生命科技有限公司，生产批号：R510-22-10）；FreeZol Reagent总RNA提取试剂盒、HiScriptⅢ RT SuperMix逆转录试剂盒、SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：R711、R323、Q712）。

1.3 实验分组及处理

1.3.1 实验分组

24只自发性高血压大鼠按照随机数字表法分为模型组、电针组、假电针组和西药组，每组6只；6只WKY大鼠作为对照组。

1.3.2 干预方法

适应性喂养1周后开始干预。所有大鼠予以异氟烷气体麻醉和抓取固定。电针组参照《实验针灸学》取双侧内关穴、厥阴俞穴，斜刺3～5 mm，电针仪为疏密波，频率为2 Hz，电流强度以针柄微颤为度，留针15 min，1次/d，共6周。假电针组在对应穴位旁5 mm处浅刺入皮下并夹持电极但不通电，其余同电针组[10]。西药组根据实验动物等效剂系数折算法予以缬沙坦7.2 mg/（kg·次）灌胃，1次/d，共6周。

1.4 样本处理

干预6周后，给予5%异氟烷麻醉并固定大鼠，剪开胸腔以预冷PBS灌流心脏。取出完整心脏并去除表面水分后置入冻存管，迅速液氮冷冻，-80 ℃保存。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 血压水平变化监测

分别于干预前后6∶00、10∶00、14∶00、18∶00、22∶00时及次日2∶00和6∶00时测量血压。以6∶00、18∶00时分别作为开灯和关灯时间点，设置授时因子时间（zeitgeber time，ZT），即ZT0和ZT12，于ZT0、ZT4、ZT8、ZT12、ZT16、ZT20和ZT24测定大鼠尾动脉收缩压、舒张压和平均动脉压[11]。每个时间点连续测量3次，取平均值；以ZT0~ZT8 3个时间点的平均值计算为昼间血压，ZT12~ZT24 4个时间点的血压平均值计算为夜间血压。

1.5.2 血压昼夜节律参数计算

血压昼夜节律分析以收缩压为主要指标，将采集的7个时间点的收缩压绘制曲线变化图；并采用Halberg单个余弦法进行分析，节律参数通过Matlab R2023A（V9.14）软件进行余弦拟合，拟合公式：y=M+A×cos[（2×π÷24）×x+φ][12]，其中M为中值、A为振幅、φ为时相。杓型率=（活动期收缩压平均值-静息期收缩压平均值）/活动期收缩压平均值×100%。

1.5.3 RT-qPCR检测心脏时钟基因表达

提取心脏组织总RNA并测定浓度后反转录为cDNA。反应体系：1 µl cDNA，正、反引物各0.2 µl，5 µl SYBR和3.6 µl DEPC水。反应程序：50 ℃ 20 s，95 ℃ 10 min；随后进入40个循环（95 ℃ 15 s和60 ℃1 min）。扩增结束进行熔解曲线分析：95 ℃ 15~30 s，60 ℃保持15 s后升至95 ℃连续采集荧光以判断特异性。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt方法计算时钟基因的相对表达量。PCR引物由上海英潍捷基公司合成，引物序列见表1。

表1 时钟基因引物序列

（bp）反向引物：GCCCTCATTGTCTGGTTCACTGTC Clock 114 正向引物：CGGCGAGAACTTGGCATTGAG 反向引物：CCTTTCCAGTGCTTCCTTGAGAC反向引物：AACTTGGTGTGTGCCGTGTG Per2 正向引物：GCAGGCAGCAGTGATACAAGTC 102 Cry1 正向引物：CCTTCTAATCCTAATGGGAACG 102 反向引物：ACCACTTCCTTGAGAGCAGTTT Cry2 正向引物：AAGACAGTCACCAACAGACAGAG 118 反向引物：CATGGGCATAGGTGAAGATTTCTβ-actin 正向引物：CCCATCTATGAGGGTTACGC 150 基因名称引物序列（5’~3’）引物长度Bmal1 正向引物：AGGACTTCGCCTCCACCTGTTC 137 Per1 正向引物：CCGTGCTGCCTGCTCATTG 100 反向引物：ACTCTCCTCCGTGTCTGTGATC反向引物：AGCACAGGCAACATTCAGGAT Rev-erbα 正向引物：ACAGCTGACACCACCCAGAT 101 反向引物：TTTAATGTCACGCACGATTTC

1.5.4 非靶向代谢组学检测

1.5.4.1 样品制备 取100 mg心脏组织液氮研磨，加入500 µl 80%甲醇，涡旋、冰浴5 min后15 000 g、4 ℃离心20 min（离心半径为8.2 cm）。取上清液以质谱级水稀释至甲醇浓度为53%，15 000 g、4 ℃离心20 min（离心半径：8.2 cm）后用于检测。取各样本上清液等体积混合制备QC样本。

1.5.4.2 上机检测 采用超高效液相色谱法检测，色谱柱为Hypersil GOLD C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 µm），流动相A：0.1%甲酸+5 mmol/L醋酸铵，流动相B：甲醇。洗脱梯度：0.0~1.5 min，2%B；1.5~3.0 min，2%→85%B；3.0~10.0 min，85%→100%B；10.0~10.1 min，100%→2%B；10.1~12.0 min，2%B。进样量4 µl，柱温40 ℃；流速0.2 ml/min。质谱扫描范围m/z 100~1 500，ESI参数：喷雾电压3.5 kV，鞘气35 psi，辅助气10 L/min，管温320 ℃（正、负离子）；离子导入射频电平60；辅助气体加热350 ℃。

1.5.4.3 数据处理 原始数据经MSDIAL 4.48软件进行峰提取、对齐与峰面积计算。代谢物结构通过精确质量数和二级谱匹配鉴定。正、负离子数据分别进行总峰面积归一化合并，Python 3.12.2软件完成数据预处理。MetaboAnalyst 5.0软件用于主成分分析（principal componet analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），以VIP值＞1和P＜0.05为标准筛选差异代谢物；差异代谢物丰度采用Wilcox检验计算，并进行京都基因与基因组百科全书分析。

1.5.5 相关性分析与网络建设

使用RStudio 4.2.3软件的Spearman包对时钟基因和差异代谢物进行相关性分析，相关性显著阈值设置为q＜0.01。使用Cytoscape 3.10.1软件构建相关性系数r＞0.6，P＜0.05的时钟基因-心脏差异代谢物的调控网络。

1.6 统计学方法

采用SPSS 29.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差表示，多组间采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey事后检验；两组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠昼间和夜间血压水平比较

与对照组比较，模型组大鼠昼间和夜间收缩压、平均动脉压和舒张压升高（P＜0.05）；假电针组与模型组昼间和夜间收缩压、平均动脉压和舒张压比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与假电针组比较，电针组昼间和夜间收缩压，昼间平均动脉压和夜间舒张压降低（P＜0.05）。见图1。

图1 各组大鼠昼间和夜间血压水平比较（n=6）

2.2 各组大鼠收缩压和血压杓型率比较

与对照组比较，模型组收缩压谷、峰值升高，杓型率降低（P＜0.05）；假电针组与模型组收缩压谷、峰值和杓型率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与假电针组比较，电针组收缩压谷、峰值降低，杓型率升高（P＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠收缩压和血压杓型率比较（n=6）

2.3 各组大鼠血压节律曲线和余弦拟合度比较

干预前，除对照组外，模型组、电针组及假电针组收缩压水平和昼夜节律波动幅度相当；干预后，电针组收缩压水平降低，昼夜节律曲线更加清晰。对照组和电针组余弦拟合度更高（P＞0.05），模型组和假电针组的余弦拟合度较差（P＜0.05）。见图3、4。

图3 各组大鼠干预前后收缩压昼夜节律曲线比较（n=6）

图4 各组大鼠干预后收缩压昼夜节律的单余弦拟合曲线（n=6）

2.4 各组大鼠血压振幅、中值和时相比较

与对照组比较，模型组振幅降低，中值升高（P＜0.05）；假电针组与模型组振幅、中值、时相比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与假电针组比较，电针组振幅升高，中值降低（P＜0.05）。见图5。

图5 各组大鼠血压振幅、中值和时相比较（n=6）

2.5 各组大鼠心脏时钟基因表达比较

与对照组比较，模型组Bmal1、Per2、Rev-erbαmRNA表达降低，Clock、Per1、Cry1、Cry2 mRNA表达升高（P＜0.05）。假电针组与模型组Bmal1、Clock、Per1、Per2、Cry1、Cry2、Rev-erbα mRNA表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与假电针组比较，电针组Bmal1、Per2 mRNA表达升高，Per1、Cry1、Cry2 mRNA表达降低（P＜0.05）。见图6。

图6 各组大鼠心脏时钟基因表达比较（n=6）

2.6 各组大鼠PCA、PLS-DA结果

PCA结果显示，对照组和模型组呈现一定的分布差异，但存在部分重叠；而电针组和模型组在整体分布上出现分离趋势，见图7A、B；PLS-DA结果显示，对照组、模型组、电针组明显分离，见图7C、D。

图7 各组大鼠PCA和PLS-DA结果

2.7 差异代谢物分析及筛选

模型组与对照组筛选出134个差异代谢物（79个上调，55个下调）；电针组与模型组筛选出92个差异代谢物（66个上调，26个下调），有18个代谢物向对照组回调，见图8。箱式图进一步显示，电针组可以有效回调9种体内差异代谢物相对丰度，见图9。

图8 各组大鼠差异代谢物谱图

图9 各组大鼠心脏代谢物相对丰度比较（n=6）

2.8 电针对大鼠心脏代谢通路的影响

电针组与模型组相关性较高的通路有磷酸戊糖途径及不饱和脂肪酸合成途径。见图10。

图10 大鼠心脏代谢通路

2.9 电针干预后心脏时钟基因与差异代谢物的关联分析

相关性热图显示，辅酶Q2和D-景天庚酮糖-7-磷酸分别与Bmal1、Per2呈正相关，与Cry1、Cry2呈负相关；与二十二五碳烯酸与Bma1呈正相关，与Cry2呈负相关（P＜0.05）；L-谷氨酸单钠盐与Bmal1与Per2呈负相关（P＜0.05）；长春新碱与Per2呈负相关（P＜0.05）；D-赤藓糖-4-磷酸与Bma1、Per2呈负相关，与Per1、Cry1和Cry2呈正相关（P＜0.05）；4-羟基间苯二甲酸二甲酯与Bma1呈负相关，与Cry1、Cry2呈正相关（P＜0.05）；5-磷酸脱氧核糖与Bam1呈负相关，与Per1呈正相关（P＜0.05）。见图11。

图11 电针干预后心脏时钟基因与差异代谢物的相关性可视化

3 讨论

中医重视昼夜节律对生理的重要性。血压呈“双峰一谷”，与阴阳消长及营卫运行相应。《灵枢·营卫生会》载：“营在脉中，卫在脉外，五十而复大会，阴阳相贯，如环无端，”说明营卫循行具有节律属性，其失调可致血压节律紊乱[13-14]，故营卫气血失衡可能是其重要病机。现代研究认为，血压节律由中枢—外周生物钟共同维持[15]；从中医角度看，“心为君主之官，神明出焉”，提示心不仅主血脉，还可上位统摄神志，从而影响脑部节律。心脏亦是关键外周时钟器官，其节律状态可反向调节中枢节律与整体代谢；视交叉上核虽参与节律信号整合，但可视为心-脑节律体系的一部分，其失衡亦类似“气血逆乱”。因此，本研究以心为调控枢纽，通过电针改善心脏节律与代谢稳态，以恢复血压昼夜节律，并据此选择兼具调节营卫与心血脉作用的内关、厥阴俞作为干预穴位。

本研究结果显示，电针可有效调节Bmal1、Per1/2、Cry1/2等核心时钟基因，提示心脏时钟基因参与血压昼夜节律形成，并可能是电针的关键靶点；电针主要作用于磷酸戊糖途径及不饱和脂肪酸代谢途径。磷酸戊糖途径是维持NADPH的关键途径。本研究发现，电针下调辅酶Q2、D-景天庚酮糖-7磷酸和D-赤藓糖-4-磷酸，并与Bmal1、Per2、Cry1/2表达相关，提示磷酸戊糖途径的代谢物可能在生物钟-代谢耦合中发挥作用[16]。此外，磷酸戊糖途径限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）亦参与节律调控。其变化可影响Bmal1水平[17-18]，同时有研究提出电针可调控G6PD/NADPH轴[19]，进一步支持电针通过调控磷酸戊糖途径调节心脏时钟基因表达。此外，电针促进心脏具有抗炎特性的二十二五碳烯酸生成[20]，并与Bmal1、Cry2表达相关，不饱和脂肪酸可通过炎症途径反向调节时钟基因[21]。提示电针可能通过改善炎症与脂质代谢，与时钟基因形成耦合调控，从而改善血压节律。

本研究虽然在生物钟-代谢关联方面取得初步进展，但仍存在一定的局限性：①本研究未能呈现完整的24 h血压与时钟基因节律，后续需通过连续监测验证；②异氟烷麻醉虽可能轻度抑制自主神经，但因各组一致，对结论影响有限；③目前结论基于关联分析，后续将采用二十二五碳烯酸、G6PD等抑制剂进行因果验证。

综上所述，电针可改善自发性高血压大鼠血压昼夜节律紊乱，提高昼夜振幅和杓型率，其机制可能通过调控心脏糖脂代谢、氧化还原及营养代谢，维持心脏时钟基因稳态表达。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Exploration of the effect of electroacupuncture on blood pressure circadian rhythm in spontaneously hypertensive rats and its possible mechanisms based on clock gene-metabolic association analysis

ZHANG Cong CHEN Yiying ZHANG Bei HU Wenxin XIE Ruizi LI Jiaqin CHEN Li

Department of Acupuncture Rehabilitation, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Jiangsu Province, Nanjing 210029, China

[Abstract] Objective To explore the effect of electroacupuncture on blood pressure circadian rhythm, cardiac clock genes and metabolites in spontaneously hypertensive rats,as well as the mechanism by which it improves circadian rhythm disorders. Methods Twenty-four 19-week-old SPF-grade male spontaneously hypertensive rats were selected and were divided into model group,electroacupuncture group, sham electroacupuncture group,and western medicine group by random number table method, with 6 rats in each group; another 6 WKY rats were selected as the control group. All rats were anesthetized with Isoflurane gas and fixed by grasping; in the electroacupuncture group, electroacupuncture was performed on both nèiguān and juéyīnshù points for 15 minutes each time; the sham electroacupuncture group made a shallow puncture 5 mm away from the same acupoint without applying electricity; and the western medicine group was administered Valsartan at a dose of 7.2 mg/(kg· time) by gavage, and each group was intervened for six weeks. The blood pressure levels and blood pressure circadian rhythm changes in each group of rats were detected; the mRNA expressions of cardiac Bmal1, Clock,Rev-erbα, Per1/2, and Cry1/2 of rats in each group were observed by RT-qPCR; metabolomics technology was used to detect the levels of cardiac metabolites in rats; and Spearman was used to evaluate the correlation between clock genes and differential metabolites. Results Compared with the control group, the daytime and nighttime systolic blood pressure,mean arterial pressure, and diastolic blood pressure of rats in the model group increased (P＜0.05); compared with the sham electroacupuncture group, the daytime and nighttime systolic blood pressure, the daytime mean arterial blood pressure, and the nighttime diastolic blood pressure in the electroacupuncture group were decreased (P＜0.05).Compared with the control group, the trough, peak, and median of systolic blood pressure in the model group increased,while the ladder-shaped rate and amplitude decreased (P＜0.05). Compared with the sham electroacupuncture group, the trough, peak, and median of systolic blood pressure in the electroacupuncture group decreased, while the dipper rate and amplitude increased (P＜0.05). Compared with the control group, the expressions of Bmal1, Per2, and Rev-erbα mRNA in the model group decreased, while the expressions of Clock, Per1, Cry1, and Cry2 mRNA increased (P＜0.05).Compared with the sham electroacupuncture group, the expressions of Bmal1 and Per2 mRNA in the electroacupuncture group increased, while the mRNA expressions of Per1, Cry1 and Cry2 mRNA decreased (P＜0.05). There were 134 differential metabolites (79 up-regulated and 55 down-regulated) between the control group and the model group; there were 92 differential metabolites (66 up-regulated and 26 down-regulated) between the electroacupuncture group and the model group, and there were nine key differential metabolites among the three groups. The pathways with a relatively high correlation between the electroacupuncture group and the model group include the pentose phosphate pathway and the unsaturated fatty acid synthesis pathway. The clock genes (Bmal1, Per1/2, Cry1/2) were correlated with coenzyme Q2,oxalic acid and D-erythrito-4-phosphate (P＜0.05). Conclusion Electroacupuncture can improve the blood pressure circadian rhythm disorder in spontaneously hypertensive rats. Its effect may be achieved by regulating the interaction between cardiac clock genes and key metabolites, involving the pentose phosphate and the regulation of unsaturated fatty acid metabolism, to restore the homeostasis of the circadian rhythm.

[Key words] Hypertension; Electroacupuncture; Blood pressure circadian rhythm; Metabolomics; Clock genes

[中图分类号] R245

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）03（a）-0029-10

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25100478

[基金项目] 江苏省科技计划专项资金（重点研发计划社会发展）项目（BE2023794）；江苏省中医院科主任学术提升专项课题（Y2022ZR31）；江苏省研究生科研与实践创新计划项目（KYCX23_2010）。

[作者简介]

张聪（1986.9-），男，硕士，副主任中医师，主要从事针灸效应规律及机制的基础与临床研究工作。

[通讯作者] 陈理（1971.1-），男，博士，主任中医师，主要从事针灸临床疗效评价研究工作。

（收稿日期：2025-10-11）

（修回日期：2025-12-25）