高草酸尿症是导致草酸盐肾病的重要原因，常继发肾结石形成，可导致间质性肾炎、肾小管坏死、草酸钙结晶等病理表现的急性肾损伤。这些病理改变进一步加剧肾小管上皮细胞的氧化应激损伤与炎症反应，促进肾结石的发展[1-2]。相关研究已发现，氧化应激和炎症级联反应与抗氧化系统平衡在肾小管细胞损伤过程中发挥重要的作用。草酸刺激可破坏细胞内促氧化-抗氧化系统平衡，导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量生成，进而损伤蛋白质、脂质及DNA，同时激活NF-κB信号通路诱发炎症反应，最终促进肾结石形成[3-4]。

Nrf2-ARE信号通路被认为是机体抗氧化防御系统的核心，生理状态下，核转录因子红系2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）主要与其抑制性调节因子KEAP1结合并在细胞质中降解[5]。在氧化应激条件下，Nrf2激活重要机制是通过氧化KEAP1特异性位点的半胱氨酸，使其与KEAP1形成的同源二聚体解离，逃避KEAP1介导的降解，然后游离的和新生成的Nrf2进入到细胞核中，与小肌肉腱膜纤维肉瘤蛋白结合形成二聚体，从而与抗氧化反应元件序列结合，激活一系列抗氧化和细胞保护基因的表达[6-7]。尽管Nrf2在多种疾病中具有抗氧化及细胞保护作用，但其在草酸介导的肾小管上皮细胞损伤中的具体作用及其是否涉及铁死亡调控尚未明确。本研究旨在探讨Nrf2在草酸诱导的肾小管上皮细胞损伤中发挥的作用及潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系来源

NRK-52E细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2 材料和仪器

本研究使用的主要试剂包括乳酸脱氢酶（lactate debydroge-nase，LDH）细胞毒性检测试剂盒（货号：C0016）、ROS检测试剂盒（货号：S0033S）均购自上海碧云天生物技术有限公司；脂质氧化检测试剂盒（货号：A003-1）购自南京建成生物工程研究所；SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒（货号：AG11701）购自湖南艾科瑞生物工程有限公司。兔多抗HO-1（货号：AG2181）、NQO1（货号：AF7614）、Nrf2（货号：AF7623）、GPX4（货号：AF7020）、xCT（货号：AF7992）、TF（货号：AF8124）、ACSL4（货号：QH60809S）和HRP标记的羊抗小鼠二抗（货号：A0216）、羊抗兔二抗（货号：A0208）均购自上海碧云天生物技术有限公司；病毒干扰过表达载体由上海和元生物技术股份有限公司合成，具体为SLenti-U6-shRNA(Nfe2l2)-CMV-mCherryF2A-Puro-WPRE载体、pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-Nfe2l2-3xFLAG-WPER载体。实验仪器主要有电泳仪、化学发光成像仪、酶标仪、流式细胞仪（上海碧云天生物技术有限公司）、荧光定量PCR仪（莫纳生物科技有限公司）等。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞分组及处理 应用慢病毒转染技术构建稳定转染细胞系，转染后进行效率验证，得到稳定敲低和过表达Nrf2基因的NRK-52E细胞系。细胞处理分组如下，①对照组：普通培养基+NRK-52E细胞；②高浓度草酸组：高浓度草酸培养基（800 µmol/ml，处理时间24 h）[8]+NRK-52E细胞；③Nrf2过表达组：高浓度草酸培养基（800 µmol/ml，处理时间24 h）+转染过表达Nrf2的NRK-52E细胞；④Nrf2敲低组：高浓度草酸培养基（800 µmol/ml，处理时间24 h）+转染敲低Nrf2的NRK-52E细胞。

1.3.2 Western blot实验 收集NRK-52E细胞，提取细胞总蛋白，使用BCA定量试剂盒检测蛋白浓度。浓缩胶电泳80 V，分离胶电泳120 V，分离蛋白，转至PVDF膜。5% BSA温封闭1 h，TBST洗涤3次（每次5 min）；加一抗（NRF2、HO-1、NQO1、GPX4、xCT、TF、ACSL4，1∶1 000）4 ℃孵育过夜，洗涤后加HRP标记兔二抗（1∶10 000）室温孵育1 h；再用TBST洗涤3次（每次10 min），ECL显影液覆盖条带，曝光显影。重复实验3次。

1.3.3 CCK8实验 将消化重悬的NRK-52E细胞调整至5×104个/ml密度，接种于96孔板（100 µl/孔，6个复孔），37 ℃、5% CO2培养12～24 h贴壁。更换含处理药物的培养基，分别处理12、24、48 h。弃培养基，PBS快速洗2次。每孔加100 µl含10% CCK8的新鲜培养基，37 ℃孵育2～3 h。用酶标仪测定450 nm吸光度值。重复实验3次。

1.3.4 LDH释放实验 按5×104个/ml密度接种NRK-52E细胞至96孔板（100 µl/孔，6个复孔），37 ℃、5% CO2培养12～24 h贴壁。弃培养基，PBS洗涤1次。加入处理药物，继续培养。测前1 h，裂解对照孔加10 µl LDH释放试剂，混匀后孵育。取培养板400 g离心5 min，离心半径15 cm，转移上清至新板。每孔加60 µl LDH检测液，25 ℃避光孵育30 min，测定490 nm吸光度。重复实验3次。

1.3.5 丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测 接种NRK-52E细胞至6孔板（3个复孔），待细胞密度达到70%～80%时，弃培养液，PBS洗2次，每孔加100 µl RIPA裂解液冰上裂解30 min。将裂解液在4 ℃、12 000 r/min离心10 min，离心半径8 cm取上清，BCA法测定蛋白浓度。将样品加入反应体系，混匀后沸水浴45 min，流水冷却，4 000 r/min离心10 min，离心半径8 cm取上清于532 nm波长测定吸光度（1 cm比色皿，蒸馏水调零）。MDA含量（nmol/mgprot）=（A测定-A对照/A标准-A空白）×10。重复实验3次。

1.3.6 流式细胞术检测细胞内ROS 将NRK-52E细胞接种至12孔板（3个复孔），70%～80%密度时加入草酸溶液，37 ℃培养。弃培养基，PBS洗2次。每孔加1 ml含10 µmol/L DCFH-DA的无血清培养基，37 ℃避光孵育20 min。弃探针，无血清培养基洗3次。胰酶消化制备单细胞悬液，流式细胞仪检测平均荧光强度。重复实验3次。

1.3.7 RT-qPCR实验 采用Trizol法提取贴壁细胞总RNA，经PBS清洗、Trizol裂解、三氯甲烷分离和异丙醇沉淀后，洗涤并溶解RNA。随后进行RNA质检，确保浓度和纯度合格（260/280比值1.8～2.0）且电泳条带完整。使用iScript反转录试剂盒将1 µg总RNA合成cDNA。荧光定量PCR使用SYBR Green预混液，在95 ℃预变性5 min后，进行40个循环的95 ℃ 10 s和60 ℃ 30 s扩增，最后通过熔解曲线分析。以ΔΔCT法计算目的基因相对表达倍数。重复实验3次。反应体系（20 µl）：4 µl 5×iScript Reaction Mix，1 µl iScript Reverse Transcriptase，1 µl RNA模版，其余体积用无核酸酶水补足至20 µl。

表1 RT-qPCR引物序列

GAPDH120正向引物CTCAGTTGCTGAGGAGTCCC xCT152正向引物TGCCCGGATCCAGATTTTCC CCATTCCCGAGCCTTTCAAC正向引物反向引物ATGTGCCCATCGATGTCCTT正向引物CCGCCATCGGCTACATCAAG反向引物CTTTGGACTCGCCATCGCT正向引物CTGCCATTCGAAATCAGCGG基因名称引物序列（5’ ~ 3’）扩增长度反向引物ATTCGAGAGAAGGGAGGGCT反向引物CCAAGGGCAACCCCATTAGA GPX4154 ACSL481 TF117反向引物TGACGCTCCACTCATCACAC

1.4 统计学方法

采用SPSS 27.0统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差表示，统计图通过Graph-Pad Prism 10.1.2软件绘制。多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot法检测高浓度草酸对Nrf2抗氧化通路相关蛋白表达的影响

与对照组比较，高浓度草酸组KEAP1蛋白的表达水平升高，Nrf2及其下游靶蛋白HO1和NQO1的表达水平降低（P＜0.05）。见图1。

图1 高浓度草酸对Nrf2抗氧化通路相关蛋白表达的影响（n=3）

2.2 CCK8实验检测Nrf2对高浓度草酸作用下NRK-52E细胞增殖的影响

与对照组比较，高浓度草酸组、Nrf2过表达组、Nrf2敲低组细胞活力降低（P＜0.05）；与高浓度草酸组比较，Nrf2过表达组细胞活力升高，Nrf2敲低组细胞活力降低（P＜0.05）。见图2。

图2 调控Nrf2对高浓度草酸作用下NRK-52E细胞增殖的影响（n=3）

2.3 Nrf2对高浓度草酸作用下NRK-52E细胞损伤的影响

与对照组比较，高浓度草酸组、Nrf2过表达组、Nrf2敲低组LDH释放升高（P＜0.05）；与高浓度草酸组比较，Nrf2过表达组LDH的释放降低，Nrf2敲低组LDH的释放量升高（P＜0.05）。见图3。

图3 调控Nrf2对高浓度草酸作用下NRK-52E细胞毒性的影响（n=3）

2.4 Nrf2对高浓度草酸作用下NRK-52E细胞脂质过氧化损伤的影响

与对照组比较，高浓度草酸组、Nrf2过表达组、Nrf2敲低组MDA生成量升高（P＜0.05）；与高浓度草酸组比较，Nrf2过表达组MDA生成量降低，Nrf2敲低组MDA生成量升高（P＜0.05）。见图4。

图4 调控Nrf2对高浓度草酸作用下NRK-52E细胞脂质过氧化损伤的影响（n=3）

2.5 Nrf2对高浓度草酸作用下NRK-52E细胞内ROS生成的影响

与对照组比较，高浓度草酸组、Nrf2过表达组、Nrf2敲低组ROS含量升高（P＜0.05）；与高浓度草酸组比较， Nrf2过表达组ROS含量降低，Nrf2敲低组ROS含量升高（P＜0.05）。见图5。

图5 调控Nrf2对高浓度草酸作用下NRK-52E细胞内ROS生成的影响（n=3）

2.6 Nrf2对高浓度草酸作用下NRK-52E细胞铁死亡相关分子表达的影响

与对照组比较，高浓度草酸组、Nrf2过表达组、Nrf2敲低组GPX4和xCT蛋白及mRNA表达水平降低，TF和ACSL4蛋白及mRNA表达水平升高（P＜0.05）；与高浓度草酸组比较，Nrf2过表达组xCT和GPX4蛋白及mRNA表达水平升高，TF和ACSL4蛋白及mRNA表达水平降低，Nrf2敲低组xCT和GPX4蛋白及mRNA表达水平降低，TF和ACSL4蛋白及mRNA表达水平升高（P＜0.05）。见图6。

图6 调控Nrf2对高浓度草酸作用下NRK-52E细胞铁死亡相关分子的影响（n=3）

3 讨论

本课题前期研究已表明高浓度草酸（800 µmol/L）可诱导NRK-52E细胞氧化应激损伤模型[8]；在此研究基础上，本研究检测了Nrf2抗氧化通路蛋白的表达情况，发现高浓度草酸可显著降低NRK-52E细胞中Nrf2及其下游抗氧化蛋白HO-1、NQO1的表达，该结果与既往研究一致[8]。正常生理状态下，Nrf2与KEAP1结合并降解，而氧化应激时KEAP1半胱氨酸位点氧化导致Nrf2释放并激活ARE信号通路。然而在本研究中草酸处理后KEAP1表达升高、Nrf2表达降低，提示草酸可能通过强化KEAP1-NRF2结合来抑制抗氧化反应，这一机制也有类似报道[9]。

为了研究Nrf2在草酸诱导肾小管上皮细胞损伤中的作用，进一步检测LDH、MDA及ROS生成情况。本研究结果显示，Nrf2过表达可降低草酸诱导的LDH释放、MDA生成及ROS积累，而Nrf2敲低则加重上述损伤，提示Nrf2在草酸诱导NRK-52细胞损伤中发挥保护作用。这与Nrf2在顺铂诱导肾损伤中的保护作用一致，在顺铂导致急性肾损伤过程中，Nrf2被激活后进入细胞核，激活下游的HO-1蛋白，通过减轻氧化应激、抑制细胞凋亡、抗铁死亡三种路径发挥保护作用[10]。上述结果显示Nrf2是肾小管上皮细胞抵御氧化应激损伤的关键分子。

本研究揭示Nrf2在草酸诱导肾小管上皮细胞损伤中发挥保护作用，其机制可能通过调控铁死亡实现。草酸可诱导铁死亡，在此基础上敲低Nrf2进一步加重铁死亡，即促进铁死亡正向蛋白（TF、ACSL4）表达并抑制铁死亡负向蛋白（xCT、GPX4）表达；而过表达Nrf2则能有效拮抗草酸对上述关键铁死亡调控蛋白的表达。铁死亡的特征是脂质过氧化物积累和GPX4功能缺失，其中xCT介导的胱氨酸摄取是合成谷胱甘肽的关键步骤[11]。本研究中Nrf2敲低导致xCT表达下降，可能通过抑制谷胱甘肽合成使细胞对脂质氧化更敏感，这与Erastin诱导的铁死亡模型中xCT下调现象一致[12]。GPX4作为铁死亡的核心抑制因子，其表达受Nrf2直接调控[13]。本研究中草酸处理后GPX4表达降低，而Nrf2过表达可逆转其水平，提示Nrf2可能通过转录激活GPX4来抑制脂质过氧化。此外，ACSL4催化长链脂肪酸合成酰基辅酶A，促进过氧化磷脂生成[14]，本研究中ACSL4表达与Nrf2呈负相关，进一步证实Nrf2可通过多靶点调控阻断铁死亡进程。

草酸诱导的ROS爆发既是氧化应激的标志，也是触发铁死亡的关键因素。本研究中 ROS水平与铁死亡标志物表达呈正相关，支持“氧化应激-铁死亡”级联反应在肾结石形成中的作用[15]。Nrf2可能通过双重机制发挥保护作用：一方面直接激活HO-1、NQO1清除ROS；另一方面通过调控xCT/GPX4/ACSL4轴抑制铁死亡，这种多通路调控模式为抗结石药物开发提供了新思路。

临床上，高草酸尿症患者肾小管上皮细胞常表现出铁死亡特征性病理改变，如线粒体嵴消失和脂质沉积[16]。本研究结果提示，激活Nrf2可能成为预防草酸钙结石的潜在策略。例如，萝卜硫素作为Nrf2激动剂，已在动物模型中证实可减轻肾脏氧化损伤[17]，其是否通过调控铁死亡发挥作用值得进一步研究。

本研究仅在细胞水平验证了Nrf2的保护机制，尚未在动物模型中探讨其体内效应。此外，草酸诱导铁死亡的具体上游信号（如铁离子代谢、NADPH氧化酶亚型）仍需明确。未来研究可结合基因敲除小鼠模型，深入解析Nrf2在草酸代谢、肾小管上皮修复及结石形成中的时空作用，同时探索Nrf2与其他应激通路（如NF-κB、MAPK）的交互调控机制[18]。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Role of Nrf2 in oxalate-induced renal tubular epithelial cell injury

SUN Jiahao SUN Xiaosong CHEN Bin QIAN Xiaoyuan

Department of Urology, Xiangyang Central Hospital, Hubei University of Arts and Sciences, Hubei Province, Xiangyang 441021, China

[Abstract] Objective To investigate the role and underlying molecular mechanisms of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) in oxalate-induced renal tubular epithelial cell (NRK-52E) injury. Methods NRK-52E cells were studied as the subjects. The oxidative stress injury model of NRK-52E cells was induced by high-concentration oxalic acid, knockdown and overexpression of Nrf2 was constructed by lentivirus transfection technology. The experiment was divided into control group, highconcentration oxalic acid group, Nrf2 overexpression group, and the Nrf2 knockdown group. The expression levels of Nrf2, HO1, NQO1, and KEAP1 in the normal control group and the high concentration oxalic acid group were detected by Western blot. The CCK8 assay, lactate dehydrogenase (LDH) release assay,malondialde-hyde (MDA) assay, and flow cytometry were applied to detect the cell viability, membrane injury degree,oxidative stress injury and reactive oxygen species (ROS)level in each group. The protein and gene expression levels of TF and ACSL4, as well as SLC7A11, and GPX4 were detected by Western blot and RT-qPCR in each group. Results Compared with the control group, the expression level of KEAP1 protein in the highconcentration oxalic acid group increased, while the expression levels of Nrf2 and its downstream target proteins HO1 and NQO1 decreased (P＜0.05). Compared with the control group, the cell viability in the highconcentration oxalic acid group, Nrf2 overexpression group, and Nrf2 knockdown group decreased (P＜0.05);compared with the highconcentration oxalic acid group, the cell viability in the Nrf2 overexpression group of cells increased, and the cell viability in the Nrf2 knockdown group decreased (P＜0.05). Compared with the control group, the release of LDH, the generation of MDA, and the content of ROS in the highconcentration oxalic acid group, Nrf2 overexpression group, and Nrf2 knockdown group increased (P＜0.05); compared with the highconcentration oxalic acid group, the release of LDH, the generation of MDA, and the content of ROS in the Nrf2 overexpression group decreased,and in the Nrf2 knockdown group increased (P＜0.05). Compared with the control group, the expression levels of xCT and GPX4 proteins and their mRNAs in the highconcentration oxalic acid group, Nrf2 overexpression group, and Nrf2 knockdown group decreased, while the expression levels of TF and ACSL4 proteins and their mRNAs increased(P＜0.05); compared with the high-concentration oxalic acid group, the expression levels of xCT and GPX4 proteins and their mRNAs in the Nrf2 overexpression group increased, the expression levels of TF and ACSL4 proteins and their mRNAs decreased, and the expression levels of xCT and GPX4 proteins and their mRNAs in the Nrf2 knockdown group decreased, while the expression levels of TF and ACSL4 proteins and their mRNAs increased (P＜0.05). Conclusion Nrf2 exerts a protective effect in oxalate-induced NRK-52E cell injury, which may regulate ferroptosis.

[Key words] Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2; Oxidative stress injury; Renal tubular epithelial cells;Ferroptosis

[中图分类号] R34；R692.4

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）03（a）-0038-07

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25090062

[基金项目] 湖北省自然科学基金资助项目（2023AFB866）。

[作者简介]

孙嘉豪（2001.4-），男，湖北文理学院2023级外科学专业在读硕士研究生；研究方向：肾结石成因。

[通讯作者] 乾孝园（1992.9-），男，博士；研究方向：肾结石成因。

（收稿日期：2025-09-01）

（修回日期：2025-12-22）