前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，在中国其发病率显著上升，且不少患者确诊时已为中晚期。多西紫杉醇（Docetaxel，Doc）是此类患者的重要治疗药物，可提高患者的生存率，然而耐药性的出现严重影响其临床效果[1]。DDIT4是应激反应基因，在多种细胞应激条件下被高度诱导，参与细胞自噬、DNA损伤修复、细胞增殖调控、氧化应激应答等关键生物学过程[2]。研究发现，DDIT4可通过不同机制影响多种肿瘤的化疗耐药[3-6]。目前DDIT4在前列腺癌中的作用的相关研究尚鲜见报道，因此本研究拟探讨DDIT4在前列腺癌的Doc耐药中的作用和机制

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

德国蔡司共聚焦显微镜（型号：LSM900）；日本Olympus显微镜（型号：BX-51）；胎牛血清（货号：086-150）购自南京维森特生物技术有限公司；Doc（货号：S1148）购自美国Selleck公司；转染试剂Lipofectamine 3000（货号：TL301-01）、总细胞RNA提取试剂盒（货号：R711-01/02）、RT SuperMix反转录试剂盒（货号：R222-01-AB）和RT-qPCR试剂盒（货号：Q321-02）均购自南京诺维赞生物科技股份有限公司；二抗（货号：ab6721）购自英国Abcam公司；CCK8试剂盒购自苏州NCM生物科技有限公司；抗GAPDH（货号：60004-1-lg）与抗DDIT4（货号：10638-1-AP）抗体购自美国Proteintech公司；抗LC3B（货号：3868 T）购自美国Cell Signaling Technology；p62（货号：A19700）抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。所用引物和小干扰RNA均由擎科生物技术有限公司根据设计合成。

1.2 细胞培养

PC3和C42细胞购自中国浙江百迪生物科技有限公司，分别在含10% FBS的F12K和RPMI-1640基础培养基中培养。细胞在37 ℃、5% CO2条件下培养，每3～4天更换1次培养基，增殖至85%～90%时进行传代。通过逐步递增浓度的Doc持续刺激6个月的方式获得Doc耐药株PC3-DR和C42-DR[7]。

1.3 生物信息学分析

1.3.1 数据获取 从TCGA数据库（http：//sangerbox.com/home.html）中获取前列腺癌肿瘤组织（480例）及从GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中获取GSE70769数据集中前列腺癌肿瘤组织（92例）的RNA-seq和临床数据。从GEO数据库获取GSE190648中的RNA-seq数据。

1.3.2 差异基因分析 使用DESeq2包对C42-DR vs.C42和PC3-DR vs. PC3的RNA-Seq结果及GSE190648的表达矩阵进行差异表达分析，计算每个基因的对数倍变化（Log2FC）和P值，筛选出满足Log2FC＞1且P.adj＜0.05的上调差异基因。

1.3.3 DDIT4的表达及对预后的影响 使用TCGA-PRAD和GSE70769数据库进行前列腺癌的预后分析。根据DDIT4的表达水平，以最优化分界点作为分组阈值，高于最优化分界点的样本被归为高表达组，低于最优化分界点的样本被归为低表达组。使用survival包进行比例风险假设检验并进行拟合生存回归，绘制Kaplan-Meier曲线。

1.3.4 基因富集分析 基于TCGA数据库中获取的前列腺癌患者mRNA-Seq数据，将前列腺癌样本分为高表达组和低表达组，通过基因富集分析DDIT4高表达组和低表达组之间的通路。

1.4 细胞转染

取C42-DR或PC3-DR细胞接种于6孔板中，待细胞密度达70%～80%时，使用Lipofectamine 3000试剂盒按照制造商的方案进行si-NC或si-DDIT4转染，6～12 h后更换完全培养基后进行后续实验。si-DDIT4序列如下，正向序列：5’-GUACUGUAGCAUGAAACAAAGTT-3’；反向序列：5’-CUUUGUUUCAUGCUACAGUACTT-3’。

1.5 细胞活力测定

将C42、C42-DR、PC3、PC3-DR在含有梯度浓度Doc（0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0、256.0 nmol/L）的培养基中培养48 h[7]；C42-DR si-NC组与si-DDIT4组细胞在含有梯度浓度Doc（0、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024 nmol/L）的培养基中培养48 h；PC3-DR si-NC组与si-DDIT4组细胞在含有梯度浓度Doc（0、1、2、4、8、16、32、64、128、256 nmol/L）的培养基中培养48 h[7]，每孔加入10 μl CCK8溶液，继续培养细胞2 h，酶标仪设定450 nm波长测定吸光度，设置3个重复孔。根据生长曲线中的吸光度数据计算各组细胞半数抑制浓度（IC50）。

1.6 平板克隆形成实验

将500～1 000个转染后的C42-DR或PC3-DR细胞接种到6孔板中并进行Doc干预（8 nmol/L或4 nmol/L），分为si-NC+溶媒组、si-DDIT4+溶媒组、si-NC+Doc组和si-DDIT4+Doc组。将细胞孵育14～21 d以形成克隆，随后用4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫溶液染色30 min。最后对克隆进行拍照，并使用 Image J 2.0软件进行统计分析。

1.7 RNA纯化、反转录和RT-qPCR

使用总RNA提取试剂从前列腺癌细胞中提取总RNA。随后，使用HiScript Ⅲ All-in-one RT SuperMix将等量RNA反转录为cDNA。采用Light Cycler® 480 Instrument Ⅱ进行RT-qPCR分析。引物序列见表1。实验独立重复3次，mRNA相对表达水平采用2-ΔΔCt方法进行计算。

表1 RT-qPCR引物序列（5’→3’）

基因名称引物序列引物长度（bp）DDIT4正向引物：GCTGTTTAGCTCCGCCAACTC21反向引物：CTGTTCCGAGCTGTACAGCTTC22β-actin正向引物：TCGTGCGTGACATTAAGGAG20反向引物：ATGCCAGGGTACATGGTGGT20

1.8 Western blot法实验

使用BCA法测定蛋白浓度后，取等量蛋白于100 ℃变性10 min。经SDS-PAGE分离并转膜至PVDF膜。随后，以5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗于4 ℃孵育过夜。TBST洗涤后，再与HRP标记的二抗于室温孵育1 h。最后通过化学发光成像系统进行检测，并采用Image Lab软件分析C42与C42-DR、PC3与PC3-DR细胞及C42-DR和PC3-DR si-NC+Doc组和si-DDIT4+Doc组细胞中DDIT4、LC3B、p62蛋白表达。

1.9 共聚焦荧光显微镜自噬分析

用mRFP-GFP-LC3病毒感染PC3-DR细胞，构建稳定转染细胞系。将感染后的细胞转染si-NC或si-DDIT4并使用溶媒或8 nmol/L Doc处理24 h，对si-NC+溶媒组、si-DDIT4+溶媒组、si-NC+Doc组和si-DDIT4+Doc组使用共聚焦显微镜采集图像。

1.10 统计学方法

采用GraphPad Prism 10.3.0版软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；采用Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析，生存曲线比较采用log-rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 前列腺癌Doc耐药细胞株的建立

CCK8法检测结果显示，C42-DR与PC3-DR的IC50分别为237.80 nmol/L和36.19 nmol/L，均显著高于其亲本细胞的7.08 nmol/L与3.83 nmol/L（图1）。由此计算得出，C42-DR与PC3-DR的耐药指数分别为33.59和9.45，提示耐药细胞株成功建立。

图1 CCK8法检测亲本和耐药细胞活性（n=3）

2.2 DDIT4在前列腺癌Doc耐药细胞中的表达

通过RNA-seq结果及GEO数据库分析，与前列腺癌亲本细胞比较，在C42-DR、PC3-DR细胞及数据集GSE190648的Doc耐药细胞株中，分别筛选出显著上调基因1 845个、329个和1 942个。进一步交叉分析发现，共有7个共同差异表达基因，分别为VEGFA、DDIT4、GRIN2D、ADM、IGF2、DUSP1及ERRFI1（图2A）。其中DDIT4与化疗耐药相关，且在前列腺癌中的研究较少，故选择DDIT4作为后续研究对象，以探究其在前列腺癌Doc耐药中的作用。Western blot法检测结果显示，C42-DR和PC3-DR细胞中DDIT4蛋白表达水平高于亲本细胞C42和PC3（P＜0.05）（图2B）。进一步基于TCGA及GEO数据集GSE70769中的前列腺癌患者队列进行生存分析，发现DDIT4高表达组患者无生化复发生存率均低于低表达组（HR=2.139、5.636，P＜0.05）（图2C、D）。

图2 DDIT4在前列腺癌耐药细胞中的表达（n=3）

2.3 DDIT4敲降逆转前列腺癌Doc耐药

RT-qPCR结果显示，与si-NC组比较，si-DDIT4组中DDIT4的mRNA表达量下降（P＜0.05）（图3A）。Western blot法结果显示，si-DDIT4组中DDIT4蛋白表达水平低于si-NC组（P＜0.05）（图3B）。CCK8实验结果显示，C42-DR与PC3-DR 细胞中si-DDIT4组的IC50值均低于si-NC组（图3C）。克隆形成实验显示，与si-NC+溶媒组比较，C42-DR与PC3-DR细胞 si-DDIT4+溶媒组细胞的克隆形成能力降低（P＜0.05），且si-DDIT4+Doc组（8 nmol/L或4 nmol/L）的克隆形成能力强于si-NC+Doc组（P＜0.05）（图3D、E）。

图3 DDIT4抑制逆转前列腺癌Doc耐药（n=3）

2.4 DDIT4在前列腺癌耐药细胞中促进细胞自噬

基于TCGA数据库的基因集富集分析结果显示，DDIT4高表达与自噬激活显著相关（NES=1.339，P＜0.001）（图4A）。Western blot法检测结果显示，C42-DR与PC3-DR细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均分别高于C42与PC3细胞（P＜0.05），而p62蛋白水平均分别低于C42与PC3细胞（P＜0.05）（图4B）。与si-NC+Doc组比较，C42-DR和PC3-DR细胞si-DDIT4+Doc组中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值均降低，p62蛋白水平升高（P＜0.05）（图4C）。mRFP-GFP-LC3慢病毒示踪实验进一步显示，PC3-DR细胞si-DDIT4+溶媒组中的自噬流水平低于si-NC+溶媒组，且si-DDIT4+Doc组中自噬流水平低于si-NC+Doc组（图4D）。

图4 DDIT4在前列腺癌耐药细胞中促进细胞自噬（n=3）

3 讨论

前列腺癌是全球男性的第二大常见癌症[8]。近年来，前列腺癌已成为中国发病率增长最快的男性恶性肿瘤[9]。Doc是去势抵抗性前列腺癌患者的一线化疗药物，然而化疗耐药性使临床治疗效果仍不令人满意。DDIT4是应激反应基因，在癌症领域其被报道与肿瘤化疗耐药有关[10-11]。DDIT4在多种细胞应激条件下被高度诱导并参与DNA损伤修复、氧化应激应答和细胞自噬等关键生物学过程[12-13]。本研究通过RNA测序筛选，聚焦于DDIT4基因，通过数据库进一步分析后发现DDIT4表达水平与前列腺癌患者无生化复发生存率密切相关。研究发现前列腺癌耐药细胞中DDIT4的表达量显著增加，提示DDIT4基因可能在前列腺癌Doc耐药中起促进作用，这与DDIT4在其他肿瘤耐药中作用相一致[6,14-15]。本研究在C42-DR和PC3-DR细胞中敲低DDIT4，结果提示耐药细胞对Doc的IC50显著降低，且明显抑制Doc处理后耐药细胞的克隆形成能力。上述研究提示DDIT4在前列腺癌的Doc耐药中发挥重要作用。

目前，自噬激活能够促进化疗药物耐药肿瘤的进展[7,16]。既往研究表明，前列腺癌中Doc耐药性与DNA损伤修复、细胞自噬激活、铁死亡抑制和细胞干性增强[17-20]等多种途径相关。Jia等[21]研究发现，KLF5下调通过促进BECN1表达和Doc诱导的细胞自噬，导致前列腺癌对Doc脱敏。在本研究中，与亲本细胞比较，耐药细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ的比值显著上升，p62蛋白的降解减少，这提示耐药细胞中自噬水平增强。既往研究表明，DDIT4可能通过直接或间接调节与自噬相关的关键分子，进而促进自噬的激活。例如，作为mTORC1的抑制因子，DDIT4可能通过抑制mTORC1的激活从而诱导细胞自噬[22-24]。AMPK-mTORC1信号轴对于肿瘤细胞自噬调节至关重要，抑制mTORC1的激活可以提高细胞的自噬通量[25]。本研究通过TCGA数据库进行基因富集分析发现在前列腺癌中DDIT4高表达与自噬激活相关。敲低DDIT4后发现，前列腺癌耐药细胞和组织中自噬水平下降，多西紫杉醇耐药性明显逆转，这提示DDIT4促进细胞自噬可能是前列腺癌对Doc产生耐药性的机制之一。

本研究在体外模型中验证了前列腺癌中DDIT4对Doc耐药的影响，但因缺少临床样本验证及体内模型验证，仍然存在一定的局限性。此外，DDIT4在前列腺癌化疗耐药中的作用虽得到证实，但对于DDIT4调节自噬激活过程中的具体机制仍需进一步研究。之后应构建前列腺癌Doc敏感和耐药的PDX和类器官模型，在这些模型中验证DDIT4表达，并通过敲低DDIT4以验证其生物学作用；同时，拟补充检测DDIT4敲低后mTOR激活及自噬相关蛋白表达，进一步阐明DDIT4通过诱导自噬促进化疗药物耐药的分子机制。

综上所述，DDIT4在前列腺癌Doc耐药细胞中呈高表达，促进多西紫杉醇耐药的产生。靶向DDIT4在体内外可显著下调耐药细胞自噬水平，增强耐药细胞对化疗药物的敏感性，从而为前列腺癌治疗提供新思路。

本研究发现DDIT4在前列腺癌Doc耐药细胞中呈高表达，并通过促进自噬介导Doc耐药。靶向DDIT4可逆转前列腺癌耐药细胞对Doc耐药，为克服耐药提供新视角。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Role and mechanism of DDIT4 in Docetaxel resistance in prostate cancer

ZHENG Yuanji1 LIANG Sudong2 LI Qipeng1 Mierzhayiti Batuer1 LIN Jianzhong1

1.Department of Urology, the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Jiangsu Province, Nanjing 210011, China; 2.Department of Urology, Taizhou People’s Hospital, Jiangsu Province, Taizhou 225300, China

[Abstract] Objective To explore the role and mechanism of DDIT4 in regulating Docetaxel (Doc) resistance in prostate cancer. Methods Docetaxel-resistant cell lines C42-DR and PC3-DR were established by continuous stimulation with gradually increasing concentrations of Doc. Differential gene expression was analyzed via RNA-seq, and mRNA and protein levels were detected by qRT-PCR and Western blot method, respectively. The relationship between DDIT4 expression and patient prognosis was analyzed using data obtained from the TCGA and GEO databases. Gene expression was knocked down by small interfering RNA transfection, and cells were divided into si-NC group and si-DDIT4 group;the effect of DDIT4 silencing on the IC50 of Doc in resistant cells was evaluated by CCK8 assay. Cells were further grouped into si-NC+vehicle group, si-DDIT4+vehicle group, si-NC+Doc group, and si-DDIT4+Doc group, and the impact of DDIT4 silencing on Doc efficacy was assessed by colony formation assay. Gene set enrichment analysis was performed to evaluate the association between DDIT4 and the autophagy pathway in prostate cancer. Expression of autophagy-related proteins was detected by Western blot, and autophagic flux was monitored using mRFP-GFP-LC3 lentiviral tracing. Results RNA-seq results showed that DDIT4 was elevated in C42-DR and PC3-DR cells compared with C42 and PC3 cells. Western blot analysis indicated that DDIT4 protein expression was significantly higher in C42-DR and PC3-DR cells than in C42 and PC3 cells, respectively (P＜0.05). Survival analysis using online database data revealed that patients in the high DDIT4 expression group had a shorter biochemical recurrencefree survival than those in the low expression group (HR=2.139, 5.636, P＜0.05). Compared with the si-NC group, the IC50 of Doc was significantly reduced in the si-DDIT4 groups of C42-DR and PC3-DR cells. The colony formation assay demonstrated that the clonogenic ability of cells in the si-DDIT4+Doc group was significantly lower than that in the si-NC+Doc group (P＜0.05). Gene set enrichment analysis identified that high DDIT4 expression in prostate cancer was associated with autophagy activation (P＜0.05). Compared with C42 and PC3 cells, the LC3-Ⅱ/Ⅰ ratio was increased and p62 protein expression was decreased (P＜0.05) in C42-DR and PC3-DR cells. In PC3-DR cells, the si-DDIT4+Doc group showed a significantly lower LC3-Ⅱ/Ⅰ ratio and less degradation of p62 protein than the si-NC+Doc group(P＜0.05). Moreover, the intracellular autophagic flux was markedly reduced in the si-DDIT4+Doc group. Conclusion DDIT4 could mediates docetaxel resistance in prostate cancer by promoting autophagy.

[Key words] DNA damage-inducible transcript 4; Prostate cancer; Autophagy; Docetaxel resistance

[中图分类号] R737.25

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）04（a）-0001-07

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25110231

[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（82473432）。

[作者简介]

郑元继（2000.7-），男，南京医科大学第二临床医学院2023级泌尿外科专业在读硕士研究生；研究方向：前列腺肿瘤。

[通讯作者] 林建中（1982.1-），男，博士，副教授，副主任医师，主要从事前列腺肿瘤及肿瘤耐药方向研究工作。

（收稿日期：2025-11-14）

（修回日期：2026-02-01）