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代谢相关脂肪性肝病（metabolic dysfunctionassociated fatty liver disease，MAFLD）是全球最常见的慢性肝脏疾病，严重威胁人类健康[1]。神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）是一氧化氮（nitric oxide，NO）合成的关键酶，包含1个PDZ结构域，在细胞定位及信号传导中较其他合酶展现出更灵活的作用模式[2]。既往研究发现多种病理情况下nNOS在肝脏中会发生细胞定位及表达量的改变，但功能效应不明[3-4]。p38 MAPK是MAPK家族的重要成员，其异常激活可加剧脂质沉积和胰岛素抵抗，并促进促炎性细胞因子的释放[5-6]。蛋白质S-亚硝基化修饰可动态调节靶蛋白的活性、定位及相互作用[7]。有研究显示，在神经系统中p38 MAPK的S-亚硝基化修饰与磷酸化激活有关，但在肝脏代谢调控中的作用尚不明确[8]。鉴于此，本研究基于细胞模型，探索nNOS和P38 MAPK在肝细胞脂肪变性、炎症及凋亡之间的潜在联系，为揭示MAFLD的发病机制提供新方向。

1 材料与方法

1.1 细胞株

小鼠正常肝细胞株（AML12）购自中国科学研究院上海细胞库。细胞复苏后采用DMEM/F12培养基（含10%胎牛血清），于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，传代进行细胞实验。

1.2 主要试剂

TRIzol（货号：KGF5101-100，江苏凯基生物技术股份有限公司）；cDNA第一链合成试剂盒（货号：RR036B，日本TaKaRa公司）；TB Green® Premix Ex Taq™ Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（货号：RR820A，日本Ta-KaRa公司）；Annexin-V APC/PI细胞凋亡检测试剂盒（货号：KGA1107-100，江苏凯基生物技术股份有限公司）；甘油三酯（triglyceride，TG）测定试剂盒（货号：A110-1-1，南京建成生物工程研究所）；KeygenMAX 3000转染试剂（货号：KGA9705-1.5，江苏凯基生物技术股份有限公司）；Rabbit Anti-Biotin（货号：ab53494，英国Abcam公司）；Rabbit Anti-p-p38 MAPK[货号：TA4001，艾比玛特生物医药（上海）有限公司]；Mouse Anti-p38 MAPK（货号：66234-1-Ig，武汉三鹰生物技术有限公司）；Rabbit Anti-kappa B抑制因子激酶β（inhibitor of nuclear factor-κB kinase β，IKKβ）（货号：AF6009，美国Affinity公司）；Rabbit Anti-p-IKKβ（货号：AF3013，美国Affinity公司）；GAPDH（货号：KGC6102-2，江苏凯基生物技术股份有限公司）；Rabbit Anti-Phospho-nNOS（Ser1417）（货号：AF8231，美国Affility公司）；Rabbit Anti-nNOS（货号：AF6249，美国Affility公司）；14～120 kD预染蛋白分子量标准（货号：DM111-02，北京全式金生物技术股份有限公司）；10～180 kD PageRuler预染蛋白分子量标准（货号：26616，美国Thermo Scientific公司）；全蛋白提取试剂盒（货号：KGB5303-100，江苏凯基生物技术股份有限公司）；BCA蛋白含量检测试剂盒（货号：KGB2101-50，江苏凯基生物技术股份有限公司）；生物素转换法试剂盒（货号：10006518，美国Cayman公司）；L-NPA（货号：HY-102062A，美国MedChemExpress公司）。

1.3 主要仪器

XW-80A型涡旋振荡器（海门其林贝尔仪器制造有限公司）；ST16R型高速冷冻离心机（美国Thermo Sorvall）；UV-2450型紫外光度仪（日本SHIMADZU公司）；普通梯度PCR仪（美国ABI Veriti 96 well Thermal cycler）；荧光定量PCR循环仪（美国ABI Step one plus Real time-PCR system）；流式细胞仪（美国BECKMAN COULTER CytoFLEX）；多功能酶标仪（瑞士TECAN SPARK）；PowerPac™基础电泳仪电源（美国Bio-Rad 164-5051）；凝胶成像系统（美国Bio-Rad ChemiDoc Touch）。

1.4 研究方法

1.4.1 细胞培养和传代小鼠AML12细胞复苏后，用DMEM/F12培养基于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养，24 h换液，细胞融合至80%～90%时传代：弃培养基，PBS冲洗2次，0.25%胰蛋白酶液消化1～2 min，镜下观察细胞回缩变圆后加等体积含血清培养基终止消化。细胞悬液1 000 r/min室温离心5 min，弃上清，1～3 ml新鲜培养基重悬后按1∶3接种，继续培养备用。

1.4.2 nNOS过表达细胞模型构建构建pcDNA3.1（+）nNOS及空载体质粒，采用脂质体转染法，取对数生长期AML12细胞至培养板，换无抗培养基使转染时细胞密度达70%～80%，2 μg质粒与5 μl KeygenMAX 3000及增强剂分别用250 μl Opti-MEM稀释，混匀后室温孵育20 min，加入细胞培养孔孵育4～6 h后，更换新鲜培养基，继续培养24 h后验证转染效率[9-10]。

1.4.3 AML12细胞脂肪变性模型的构建及实验分组将200 μmol/L油酸和100 μmol/L棕榈酸配置为游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）溶液诱导细胞脂质沉积。实验分为：对照组、S-亚硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO）组、FFA组、FFA+L-NPA组、FFA+OE-NC组、FFA+OE-nNOS组、FFA+OE-nNOS+L-NPA组，每组3个复孔。细胞均培养72 h后收样。具体处理流程：先转染质粒24 h，再加FFA孵育48 h，L-NPA于FFA处理后24 h加入，GSNO于收样前2 h加入。L-NPA为nNOS的高选择性和强效抑制剂，根据预实验结果及文献[11-12]，L-NPA的使用浓度为5 μmol/L，GSNO的使用浓度为500 μmol/L。

1.4.4 RT-qPCR 细胞培养72 h后，弃培养基，PBS清洗。TRIzol试剂提取总RNA。酶标仪检测A260nm/A280nm值（1.8～2.1）。取1 μg RNA反转录合成cDNA，稀释10倍后行qPCR反应。反应体系含cDNA 1 μl、正反向引物各1 μl、2×qPCR预混液10 μl、0.1% DEPC H2O 7 μl；扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃退火15 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 40 s，共40个循环，72 ℃延伸5 min，每组设3复孔。以GAPDH作为内参，采用2-△△Ct法计算nNOS、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，Fas）、硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearoyl-CoA desaturase 1，Scd1）、固醇调节元件结合因子1（sterol regulatory elementbinding factor 1，Srebf1）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的相对表达量。引物序列信息见表1。

1.4.5 Western blot法细胞培养72 h后，预冷PBS洗涤2次，加入含1% PMSF和蛋白酶抑制的RIPA裂解液冰上裂解15 min。4℃、12 000 r/min离心15 min取上清。BCA法定量后加入5×SDS上样缓冲液煮沸变性。取50 μg蛋白行10% SDS-PAGE电泳，湿转至PVDF膜。5%脱脂牛奶室温封闭2 h，TBST洗涤3次后加入稀释后的一抗[p-nNOS（1∶1 000）、nNOS（1∶500）、p-IKKβ（1∶500）、IKKβ（1∶500）、p-p38 MAPK（1∶500）、p38 MAPK（1∶2 000）、GAPDH（1∶5 000）]，4 ℃孵育过夜。加入HRP标记二抗（稀释比例1∶2 000）1～2 h。ECL化学发光显影，G:BOX chemiXR5系统采集图像，每组重复3次。Image J分析条带灰度值，计算磷酸化蛋白与总蛋白灰度比值，确定蛋白相对表达量。

1.4.6 甘油三酯（triglyceride,TG）测定细胞培养72 h，PBS洗涤2次。加入300 μl 1% Triton X-100，37 ℃孵育30 min裂解细胞。收集裂解液，按照试剂盒说明书操作，酶标仪检测540 nm处光密度值，计算细胞内TG含量，每组重复3次。

1.4.7 细胞凋亡检测细胞培养48 h后，0.25%胰酶消化收集细胞并洗涤2次。调整细胞浓度至1×106个/ml，取100 μl细胞悬液，加入500 μl结合缓冲液重悬，依次加入5 μl Annexin V-APC和5 μl碘化丙啶混匀，室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.4.8 蛋白S-亚硝基化检测采用生物素转换法检测，每组重复3次。细胞裂解后按试剂盒说明书操作：加入含有阻断试剂的缓冲液A，4 ℃孵育30 min封闭游离巯基，冰丙酮沉淀蛋白，离心后加入含有还原试剂和生物素标记试剂的缓冲液B室温反应1 h，链霉亲和素磁珠富集生物素标记蛋白，经SDS-PAGE和Western blot法分析目标蛋白的S-亚硝基化修饰水平。

1.5 统计学方法

数据采用GraphPad Prism 8 for Windows（Graph-Pad Software，San Diego，USA）软件进行分析并作图。计量资料以均数±标准差（

）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 nNOS过表达模型的构建

FFA+OE-nNOS组nNOS mRNA及蛋白表达水平高于FFA组（P＜0.01）。见图1。

2.2 FFA诱导AML12细胞脂肪变性对nNOS磷酸化水平及活性的影响

FFA组p-nNOS（Ser1417）蛋白水平高于对照组（P＜0.01），FFA+OE-nNOS组的p-nNOS表达水平高于FFA组（P＜0.01）；而FFA+OE-nNOS+L-NPA组p-nNOS表达水平低于FFA+OE-nNOS组（P＜0.05）。见图2。

2.3 nNOS对AML12细胞凋亡及TG含量的影响

FFA组细胞凋亡率高于对照组（P＜0.01），FFA+OE-nNOS组细胞的总凋亡率高于FFA组（P＜0.01）。FFA组TG含量高于对照组（P＜0.01），FFA+L-NPA组TG含量低于FFA组，FFA+OE-nNOS组TG含量高于FFA组（P＜0.01），而FFA+OE-nNOS+L-NPA组TG含量低于FFA+OE+nNOS组（P＜0.01）。见图3。

2.4 nNOS对AML12细胞脂代谢相关基因及炎症因子mRNA表达的影响

与FFA组比较，FFA+L-NPA组Scd1、Fas、Srebf1和IL-1β和TNF-α的mRNA表达量均降低（P＜0.05），FFA+OE-nNOS组Scd1、Fas、Srebf1和IL-1β和TNF-α的mRNA表达量高于FFA组（P＜0.01），FFA+OE-nNOS+L-NPA组Fas、Scd1、Srebf1和IL-1β和TNF-α的mRNA表达量低于FFA+OE-nNOS组（P＜0.01）。见图4。

2.5 nNOS对FFA诱导AML12细胞脂肪变性后IKKβ磷酸化的影响

GSNO组及FFA组AML12细胞p-IKKβ蛋白表达高于对照组（P＜0.05），FFA+L-NPA组p-IKKβ蛋白表达低于FFA组（P＜0.01）。FFA+OE-nNOS组p-IKKβ蛋白表达水平高于FFA组（P＜0.01），FFA+OE-nNOS+L-NPA组的p-IKKβ蛋白表达低于FFA+OE-nNOS组（P＜0.01）。见图5。

2.6 nNOS对FFA诱导AML12细胞脂肪变性后P38 MAPK亚硝基化及磷酸化的影响

GSNO组及FFA组SNO-P38 MAPK及p-P38 MAPK蛋白表达水平均高于对照组（P＜0.05）；FFA+L-NPA组细SNO-P38 MAPK及p-P38 MAPK蛋白表达水平低于FFA组（P＜0.05）。进一步通过FFA诱导过表达nNOS的AML12细胞后，FFA+OE-nNOS组p-P38 MAPK表达高于FFA组（P＜0.01），FFA+OE-nNOS+L-NPA组p-P38 MAPK表达低于FFA+OE-nNOS组（P＜0.05）。见图6。

3 讨论

本研究聚焦于nNOS在肝细胞脂质沉积、炎症激活及凋亡过程中的作用机制，通过细胞凋亡、脂质代谢及信号通路分析，揭示nNOS可通过S-亚硝基化修饰激活p38 MAPK信号通路，进而促进肝细胞脂质沉积与炎症反应。

3.1 nNOS加剧FFA诱导的肝细胞脂质沉积与凋亡

肝细胞内TG蓄积是肝脏脂肪变性的核心病理特征，而脂质合成基因的异常激活是TG堆积的关键驱动因素[13-14]。本研究结果显示，FFA诱导AML12细胞后，nNOS Ser1417位点的磷酸化水平显著升高，Ser1417位点磷酸化是nNOS酶活性激活的重要标志，提示FFA可通过激活nNOS增强其酶活性。nNOS过表达显著增加AML12细胞内TG含量；抑制nNOS活性后，TG水平显著下降，进一步基因表达分析发现，nNOS过表达可上调Fas、Scd1、Srebf1等脂质代谢相关基因的mRNA表达。已有研究发现，在肝脏脂代谢中，Fas、Scd1和Srebf1分别通过调控脂肪酸从头合成、脂肪酸去饱和修饰及脂代谢关键转录因子活性，共同维持肝脏脂质稳态[15-16]；研究显示，长期高脂饮食或胰岛素抵抗的情况下，Srebf1会过度激活，导致FAS、Scd1等基因过度表达，引起脂肪酸合成剧增，引发严重的肝脏脂肪变性[16-17]。本研究进一步发现L-NPA处理可有效逆转上述效应，提示nNOS是调控肝细胞脂质代谢的关键因子之一。

另外，本研究结果发现，FFA处理显著诱导AML12细胞凋亡，而nNOS过表达进一步将凋亡率提升，提示nNOS可加剧FFA介导的肝细胞损伤。这一结果与既往研究中nNOS在氧化应激条件下促进细胞凋亡的结论一致[18-19]。

3.2 nNOS通过激活IKKβ通路参与细胞炎症反应

炎症反应是脂肪变性进展为脂肪性肝炎的核心转折点，IKKβ作为NF-κB炎症通路的上游关键激酶，其磷酸化激活是炎症信号放大的核心步骤[20-21]。本研究结果显示，nNOS过表达可增强FFA诱导的AML12细胞促炎因子IL-1β、TNF-α的转录水平及IKKβ磷酸化水平，而L-NPA则显著逆转上述变化。提示nNOS可能通过促进IKKβ磷酸化激活NF-κB通路，上调IL-1β、TNF-α的转录释放，推动肝脏脂肪变性向脂肪性肝炎进展。

3.3 nNOS介导P38 MAPK亚硝基化及磷酸化过程

p38 MAPK通路参与氧化应激、脂质代谢及炎症调控。S-亚硝基化是一种可逆的翻译后修饰，并与磷酸化修饰常存在协同调控关系，共同精准调控激酶活性及信号传导效率[22-23]。肥胖小鼠肝组织中p38 MAPK可通过干扰胰岛素信号、促进糖脂沉积及激活NF-κB通路引发肝脏脂肪变和炎症[5,24]。并且，其半胱氨酸211位点的亚硝基化修饰能显著增强其激酶活性。缺血性脑损伤模型中，nNOS激活产生的NO可靶向修饰p38 MAPK 位点并促进其磷酸化，进而诱导星形胶质细胞活化及炎症反应，抑制该亚硝基化修饰则能显著减轻脑损伤[8]。GSNO作为外源性NO供体，可在细胞内通过多种机制分解并释放NO，进而介导蛋白质的S-亚硝基化修饰。在肝细胞模型中本研究发现，GSNO及FFA均可显著上调p38 MAPK的亚硝基化水平，且该亚硝基化修饰与p38 MAPK磷酸化水平的升高呈同步趋势，同时L-NPA可抑制上述修饰，提示nNOS可能通过催化p38 MAPK的S-亚硝基化，增强其激酶活性，进而激活下游信号通路，最终导致肝细胞脂肪变性及凋亡。

综上所述，本研究结果揭示nNOS可通过促进P38 MAPK的S-亚硝基化和磷酸化，推动肝细胞脂质合成、炎症因子释放及细胞凋亡，该发现为MAFLD的防治提供了潜在分子靶点。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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【作者机构】	西湖大学医学院附属杭州市第一人民医院内分泌科；杭州市老年病医院内分泌科；浙江省人民医院杭州医学院附属人民医院老年医学科
【分类号】	R587.1
【基金】	浙江省中医药科技计划项目（2025ZL454）杭州市医药卫生科技项目（A20230111）。

nNOS对游离脂肪酸诱导肝细胞脂肪变性及炎症反应的作用及机制

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