嗜酸性粒细胞性食管炎（eosinophilic esophagitis，EOE）是一种由嗜酸性粒细胞浸润导致食管功能障碍的慢性炎症，其发病机制涉及遗传、环境和免疫之间的相互作用[1]。EOE的发病和患病趋势持续增加，基于人群的研究汇总得出EOE全球总发病率和总患病率分别为每10万人年5.31例和每10万人年40.04例，且全球范围差异很大，主要集中在北美和欧洲[2-3]。此外，EOE均可发生在成人和儿童，被认为是多种食管症状的病因，以摄入过敏原激活辅助型T细胞2（T helper 2 cell，TH2）介导免疫反应，从而募集炎症细胞以响应刺激和过敏原，可使嗜酸性粒细胞向食管趋化，长期发展导致重塑纤维化和食管狭窄[4]。EOE的临床表现与年龄密切相关，且与胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GRED）的鉴别诊断仍然具有挑战[5]。成人通常伴有食管功能障碍的慢性症状，如吞咽困难、物嵌塞等典型症状，儿童则会出现一些非特异性症状，包括腹泻、恶心、呕吐等，导致生长发育迟缓，可出现吞咽困难的早期表现。EOE诊断主要以食管鳞状上皮的嗜酸性粒细胞为主，其特征为每高倍视野下嗜酸性粒细胞 ≥15个HFP。EOE在内镜下的结构改变包括食管黏膜环线性裂隙、白色斑块渗出物、黏膜皱纸样改变等，其诊断需综合临床症状、组织学特征和内镜下表现，仍依赖于组织活检，亟须探索有前景的诊断工具提高诊断率，为治疗提供新见解[6]。

单细胞RNA测序通过对单个细胞和分子维度高分辨率下的研究，揭示转录动力学和细胞异质性，这些技术识别细胞群以表征细胞状态，更好地理解疾病驱动因素及发病机制背后的分子改变[7]。既往研究定义了驻留、增殖和瞬态3种EOE肥大细胞亚群，揭示了在单细胞水平上的细胞景观[8]；食管转录组分析结果表明，通过识别EOE分子亚型，表达了特征性免疫反应细胞因子，能更好地理解分子致病机制及异质性基因组特征[9]。为了对特定细胞表达谱进行分析，这项研究进一步结合了Bulk RNA数据以深入研究EOE相关的免疫分子改变，同时，集成机器学习算法确定特征基因提高诊断准确性，旨在确定作为生物标志物的相关免疫分子，增强EOE诊断为进一步研究和开发治疗策略。

1 研究方法

1.1 数据获取

EOE（GSE175930）的单细胞RNA测序数据集来自GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo），分别使用6例活动期疾病样本与4例缓解期样本进行后续研究，活检部位包括食管和十二指肠[10]。此外，进一步从GEO数据库检索并下载5个Bulk RNA EOE患者队列：GSE113341（20例，包含10例活动期EOE、10例对照）、GSE58640（16例，包含10例活动期EOE、6例对照）、GSE148381（17例，为了确保表型的高度特异性，从分析中排除被标注为EOE样炎症性疾病（EOE样食管炎、淋巴细胞食管炎、非特异性食管炎）及胃食管反流病的样本，仅纳入10例活动期EOE、7例对照）、GSE234973（21例，包含8例EOE、13例对照）、GSE197702（27例，包含11例非纤维狭窄性EOE、9例纤维狭窄性EOE及7例对照）。ImmPort数据库（https：//www.immport.org/home）中选择了1 793个免疫相关基因用作后续分析。

1.2 单细胞分析

Seurat R软件包用于整合单细胞基因表达矩阵，“NormalizeData”和“ScaleData”函数对单细胞表达矩阵进行标准化和归一化，设定了以下数据筛选标准以排除低质量细胞：①每个细胞中检测出的基因数（nFeature_RNA）为200～6 000，以过滤掉遗传物质含量过少或过多的细胞；②每个细胞中检测出的线粒体基因占比低于10%；③排除红细胞基因表达量过高的细胞，仅在所有细胞中表达量＞0的基因被保留用于下游分析。采用“Harmony”减少批次效应影响，对Seurat对象进行主成分分析选择前20个主成分作为后续研究的基础，以0.2的分辨率使用“FindClusters”函数对细胞进行聚类，采用统一流形逼近和投影进行非线性降维可视化，使用已知的标记基因对细胞群进行鉴定。

1.3 免疫相关细胞群的鉴定

Scissor算法可基于相关矩阵和细胞间相似网络，将Bulk RNA表达矩阵、表型数据与单细胞RNA数据相结合，随后根据回归系数的Symbol，识别出与表型最相关的细胞亚群[11]。这项研究中Scissor输入Bulk数据为：GSE113314、GSE58640，通过算法鉴定出的Scissor+与Scissor-分别与EOE疾病进展相关呈正相关与负相关，在进一步的下游分析中使用R包“scMetabolism”表征Scissor细胞的代谢活性。“FindMarkers”函数用于筛选Sciccor+与Scissor-进行差异表达基因（differentially expressed genes，DEG），通过与IRGs的DEG结果得到共表达基因用于进一步分析。

1.4 机器学习模型构建

12种机器学习算法用于建立模型：弹性网络、最小绝对收缩和选择算子（LASSO）、岭回归、逐步广义线性回归、支持向量机、线性判别分析、梯度增强线性模型、广义线性模型的偏最小二乘回归、随机森林、广义提升回归模型、极限梯度提升、朴素贝叶斯。在机器学习模型训练阶段，采用十折交叉验证策略来优化模型超参数并评估模型稳定性，随机划分为大小相近的子集，保持每个子集中病例与对照的比例与原始数据集基本一致，对于需要调参的算法采用基于十折交叉验证的平均曲线下面积（area under the cueve，AUC）选择最优超参数组合；“glmnet”包用于生成λ序列，覆盖最大收缩系数至最小λ，最优λ通过交叉验证的最小误差值（lambda.min）及最小误差范围内的最大λ值（lambda.lse）确立。模型评估指标采用AUC，选取了平均AUC排名前10位的模型并评估其灵敏度、特异度、准确率、阳性预测值和阴性预测值。共构建113种机器学习模型组合，其中训练集包括GSE113341、GSE58640、GSE148381，验证集包括GSE234973、GSE197702。机器学习构建的Hub基因进一步使用Gene MANIA数据库（http://genemania.org/）进行互作分析。

1.5 Hub基因与免疫通路的相关性分析

使用Cibersort反卷积算法评估Hub基因在免疫细胞的差异表达，Cibersort输出结果选择P＜0.05进行归一化，Spearman检验确定免疫细胞浸润性与Hub基因之间的相关性，“LinkET”“ggplot2”用于可视化结果。

1.6 细胞通讯分析

使用“CellChat”包从单细胞测序数据中预测配体-受体相互作用及细胞通讯网络，根据配受体对的表达计算每个信号通路的通讯概率，对Hub基因所代表的特定信号通路进行深入分析及可视化，采用基于置换的检验方法来计算其通讯概率的显著性， 对于所有计算出的原始P值，统一使用了Benjamini-Hochberg方法进行错误发现率校正，将校正后的P＜0.05作为判断细胞通讯是否具有统计显著性的唯一标准。

1.7 统计学方法

采用R4.4.1统计学软件及相关R包进行数据分析，Pearson相关系数用于评估变量之间的相关性，使用Wilcoxon检验估计P值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单细胞 RNA 测序数据分析

为了阐明EOE样本来源细胞组成，本研究纳入10例sc-RNAseq作为发现队列，其中包括6例诊断为活动样EOE与4例缓解期EOE，取样部位分别来自食管与十二指肠，经初步质量控制后共鉴定出21 978个细胞，基于Maker基因进一步聚类和可视化后获得了12种细胞类型（图1A～C）：由CD19和MS4A1标记的B细胞；处于细胞增殖状态的Cycling亚群高表达TOP2A和MKI67；由VMF和CDH5标记的内皮细胞；由RBP2和FABP2标记的肠上皮细胞；由CHGA和CHGB标记的肠内分泌细胞；标记的食管上皮细胞高表达亚群KRT5和KRT13；DCN与COL3A1标记的成纤维细胞；由CCR3和NCF2标记的粒细胞；TPSAB1和GATA2标记的肥大细胞；LZY和CD86标记的髓样细胞；IGJ和IGHA1标记的浆细胞；CD3D和CD3E标记的T细胞。随后，提取这些细胞所对应的聚类富集通路，深入了解标记的细胞对应的功能注释（图1D）。

图1 EOE的细胞群鉴定和功能富集分析

2.2 单细胞分辨率下 Scissor 细胞的细胞亚群谱和基因差异表达

通过Scissor算法鉴定了感兴趣的Scissor+细胞与Scissor-细胞，Bulk表型对二者进行分类，分布在12种细胞类型的Scissor+细胞主要以T细胞和食管上皮细胞为主，而Scissor-细胞集中在肥大细胞和髓样细胞（图2A、B）。考虑到Scissor细胞与Background细胞（非存活细胞）之间的转录组差异，进而汇总了每种细胞中的Scissor细胞基因表达差异，“FindAllMarkers”函数生成了Marker基因在每个Scissor细胞中特异性表达的上调基因（图2C）。在图2D中展示了Scissor+与Scissor-细胞亚群之间的代谢活性，包括氨基糖和核苷酸糖代谢、脂肪酸代谢、氮代谢、鞘脂代谢等代谢途径。进一步比较Scissor+与Scissor-细胞之间的差异，DEG分析汇总291个显著上调和下调基因，通过识别Scissor差异表达基因与免疫相关基因的共有基因，共获得了54个相交的差异基因（图2E）。

图2 Scissor细胞的代谢活性和差异表达

2.3 机器学习诊断模型的开发和验证

将以上54个差异表达基因代入机器学习模型中，以十折交叉验证对GSE113341、GSE58640、GSE148381训练数据集进行拟合，并计算在GSE234973、GSE197702验证数据集中的AUC值，共生成113种机器学习组合模型，其中LASSO+随机森林展现了较好的模型稳健性，该模型在验证集的综合AUC值为0.972，进一步加强其作为诊断工具的潜力（图3A）。随后，使用LASSO模型设置惩罚系数实现自变量的筛选，根据最优λ确定了非零系数特征，随机森林根据均方误差（MSE）和GINI系数对这些特征进行排序，模型突出2个关键基因，即CTSG与IL1RL1（图3B、C）。最后，使用GeneMANIA对这些Hub基因构建互作网络，该网络展示20个与Hub基因具有潜在相互作用及共表达的基因，揭示血管功能相关的免疫调节（图3D）。

图3 机器学习诊断模型的开发和特征基因的验证

2.4 Hub基因的免疫相关性和免疫浸润分析

CTSF、IL1RL1、TNFSF10、PTPN6、FCGRT、CSF1 6个基因的表达在EOE组中显著上调且均高于对照组，其中CTSG与IL1RL1展示较大的表达差异性，相关性检验结果显示CTSG与其余基因之间的较强相关性（P＜0.05）（图4A）。使用Cibersort评估不同组别之间免疫细胞浸润的丰度，与对照组比较，EOE组中的静息肥大细胞与激活肥大细胞显著增加（P＜0.05）（图4B）。此外，研究还发现，CTSG与静息肥大细胞、激活肥大细胞、CD4记忆激活T细胞和M0巨噬细胞呈显著正相关，而嗜酸性粒细胞、M1巨噬细胞、调控T细胞、单核细胞、初始CD4T细胞、中性粒细胞和初始B细胞与目标基因呈负调控关系，在IL1RL1中静息肥大细胞与激活肥大细胞也展现了较强的正相关性，因此集中分析二者在肥大细胞中表达的相关性，CTSG在静息与激活肥大细胞中的基因表达相关系数分别为0.89和0.87，IL1RL1在静息与激活肥大细胞中的基因表达相关系数分别为0.40和0.41，均具有统计学意义（图4C～E）。进一步验证CTSG与IL1RL1在单细胞水平上的表达，结果表明二者在肥大细胞中的表达量显著升高，进而分析Hub基因与免疫细胞之间相关性的概况，均展示了目标基因与肥大细胞较强的相关性（图4F）。

图4 Hub 基因的免疫相关性和免疫浸润分析

2.5 肥大细胞中CTSG 和 IL1RL1的细胞通讯模式

为了探讨CTSG与IL1RL1肥大细胞之间的相互作用特征，本研究结合CellChat内置的CellChatDB.human分析以推断和可视化单细胞数据的细胞通讯，根据CTSG与IL1RL1在肥大细胞的基因表达量分为CTSG+肥大细胞、CTSG-肥大细胞，以及IL1RL1+肥大细胞和IL1RL1-肥大细胞，确定了13种相互作用的细胞之间的显著联系（图5、6）。此外，结果显示CTSG+肥大细胞与CTSG-肥大细胞之间通讯配受体对信号通路之间的显著差异，以胶原蛋白信号通路和半乳糖凝集素信号通路为特征，提示CTSG+肥大细胞与基质细胞、髓样细胞之间存在着显著的相互作用（图7A）。IL1RL1+肥大细胞在半乳糖凝集素信号通路中以主要传出通讯与其他细胞交互，进一步发现了IL1RL1+肥大细胞主要集中在交互于B细胞和粒细胞的SEMA7信号通路和交互于内皮细胞、粒细胞和髓样细胞的细胞内黏附因子信号通路中（图7B）。

图5 13种相互作用的CTSG肥大细胞类型之间显著联系的圈线图

图6 13种相互作用的IL1RL1肥大细胞类型之间显著联系的圈线图

图7 细胞通讯分析

3 讨论

高通量测序技术的发展使得研究EOE的异质性有更加深入的见解，多项研究表明免疫细胞与EOE的发病机制有关[12-14]；scRNA-seq可以在单细胞水平上揭示EOE组织中细胞类型与表达谱，从而识别有关的标志基因，但单细胞转录组学研究侧重于反映细胞的总体特征，通常受到样本量和检测手段的限制。为此使用Sciccor算法将外部表型整合到Bulk RNA数据中，以结合单细胞数据分析，在单细胞分辨率下量化疾病进展有关的代谢途径，反映细胞信号传导和细胞增殖凋亡的生物学意义。结果提示，Scissor+细胞在氨基糖与核苷酸糖代谢脂肪酸代谢通路的活性显著高于Scissor-细胞，而Scissor-细胞在氮代谢、鞘脂代谢通路活性更高结果显示与疾病负相关的Scissor-细胞富集于肥大细胞，表明EOE进展期的T细胞与食管上皮细胞所依赖的代谢模式通过获取能量以维持免疫活化与炎症分泌，而缓解期的肥大细胞可能通过鞘脂代谢产生抗炎介质，这为后续研究EOE的代谢调控靶点提供了全新方向，通过剖析Scissor细胞的基因表达模式，揭示驱动疾病的特异性免疫基因，为它们参与EOE提供进一步的证据。研究结果显示这些差异表达基因主要由免疫相关通路组成，免疫过程是EOE发病机制的关键因素之一，既往阐明了EOE中的外周血存在Th2细胞因子，其中IL-4参与了趋化嗜酸性粒细胞与协调炎症反应，而具有高度可塑性的Th17细胞富集通路可进一步分化为其他T细胞亚群，这些信号通路激活进一步导致免疫细胞增殖并产生炎症因子，增加了在免疫细胞中代谢重编程的理解[15-16]。

本研究根据不同过滤器与分类器进行组合的机器学习算法确定诊断EOE特异性关键基因，其优势在于通过系统性的计算筛选能够增强无偏性和鲁棒性，不依赖于某个特定基因的先验偏好，能够发现真正具有高诊断判别力的特征，从而明确CTSG和IL1RL1作为EOE诊断标志物的核心价值，同时揭示其在免疫调控中的具体作用。在免疫过程对EOE发病机制影响下，CTSG的研究至关重要。本研究中CTSG表达量呈现明确的疾病状态依赖性，在活动期样本中表达量显著高于缓解期。此外，CTSG在食管样本中的表达量表明其具有病变部位特异性，可有效排除十二指肠非特异性疾病的干扰，既往研究表明CTSG参与炎症过程，并且与嗜酸性粒细胞增多有关，该基因在EOE缓解期显著上调，CTSG属于组织蛋白酶家族中的丝氨酸亚型，主要存储于中性粒细胞的嗜青颗粒中，其表达均可影响T细胞、B细胞、NK细胞及激活的单核细胞，在免疫反应过程中CTSG、中性白细胞弹性蛋白酶、PR3被激活，在免疫细胞表面表达并保持活性[17-18]。

有关CTSG在疾病过程中的作用强调了CTSG表达上调促进结直肠癌细胞凋亡，通过调节PI3K/Akt信号通路诱导癌细胞生长[19]。同样，白细胞介素1受体样1（interleukin-1 receptor-like 1，IL1RL1）作为一种潜在的生物标志物也受到广泛关注，IL1RL1与其配体IL-33基因编码蛋白相结合参与Th2细胞的成熟及肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和NK细胞的活化[20]；同时在细胞损伤时激活Toll样受体信号通路，加剧炎症反应，值得注意的是在一些变态反应性疾病中IL1RL1在血清和/或上皮的表达明显增高[21]；此外，IL-33/IL1RL1通路激活可能进一步使得Th2或Th17失衡，导致炎症反应的持久发生。在一项诱导小鼠EOE发展的实验中，通过IL-33和IL1RL1两种细胞因子介导TH2和ST2显著上调[22]。Sun等[23]结果表明Treg细胞中IL1RL1信号传导缺失抑制了抗肿瘤免疫，强调IL1RL1在免疫抑制中的动态表达。这些对CTSG和IL1RL1的见解提供了免疫分子机制的更深入理解，突出其作为治疗靶点的潜力。

为了进一步估计与EOE诊断生物标志物相关的免疫细胞丰度，对Bulk RNA数据集进行免疫浸润分析。结果一致显示肥大细胞是EOE炎症环境中的关键免疫组分，这一关键效应细胞揭示在EOE的炎症与重塑过程中介导的免疫激活，推动组织纤维化典型病理改变。静息与激活肥大细胞的高度应答提示肥大细胞不仅在EOE急性期活跃，其表达在缓解期依然增加，肥大细胞作为参与细胞活化的关键调节因子，其密度与食管上皮内的嗜酸性粒细胞浸润相关，在一项有关肥大细胞的单细胞测序研究结果中，EOE疾病缓解组表现出增加的肥大细胞数量，特异性肥大细胞表达在食管上皮显著表达，肥大细胞来源的TGF-β1通过诱导平滑肌肥大和增生导致食管运动障碍[24-25]。

特征基因相关的肥大细胞通讯网络展示了CTSG+Mast细胞参与了胶原蛋白与半乳糖凝集素信号通路，其细胞亚群很可能是EOE食管组织纤维化重塑的关键效应细胞，胶原蛋白通路与TGF-β、MAPK、Wnt等多种信号转导密切相关，研究报道胶原蛋白交联酶在EOE食管上皮中激活BMP通路以维持食管上皮稳态，而半乳糖凝集素有着潜在的优化免疫功能反应，直接参与基质的破坏与重建，这为EOE晚期常见的食管狭窄和顺应性下降提供新的机制解释[26-28]；受IL1RL1+Mast细胞调控的SEMA7信号通路可启动T细胞介导的炎症反应且促进辅助型T细胞分化，ICAM信号通路可介导细胞间相互作用以响应细胞信号转导与活化，研究观察到在活动性EOE中ICAM-1水平显著降低，且ICAM-1在EOE不同取样部位中有着明显异质性[29-30]；提示EOE中上皮损伤至肥大细胞IL1RL1从而激活的招募和活化嗜酸性粒细胞调控模式，与Th2型炎症疾病的本质特征高度吻合，这一调控直接导致肥大细胞脱颗粒从而维持和放大局部食管炎症。这些结果强调不同诊断标志物所标注的肥大细胞有着独特的亚型特异性，后续研究可探索调节EOE中细胞通讯的潜在诊疗方法。

综上所述，本研究整合单细胞和Bulk RNA数据，揭示嗜酸性粒细胞食管炎相关肥大细胞的免疫分子特征，能够为EOE的诊断和治疗提供新的策略，但缺乏体外或体内实验的验证，虽然在转录组水平上与疾病状态表现出极强的相关性，但仍需要进一步在细胞或临床试验中进行评估；其次，样本量相对有限，可能会影响结论的泛化性，尽管整合多个Bulk RNA-seq队列以增加统计效能，但用于定义细胞图谱的单细胞RNA-seq数据仅来源于10个样本，虽然单细胞研究的重点在于细胞数量的深度解析，但较小的样本量可能无法完全捕捉EOE患者群体中巨大的异质性，如不同疾病阶段、年龄组或治疗反应亚群之间的差异，这可能导致识别出的细胞亚群和表达谱在某些患者亚群中代表性不足；数据来源异质性可能会引入潜在的偏倚，来自不同GEO队列的数据表现为不同差异的实验流程生成，尽管已经采用Harmony算法和标准化流程来减少批次效应，但无法完全消除对结果异质性的影响。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Machine learning algorithms integrate single-cell and bulk RNA data to reveal the immuno-molecular characteristics of mast cells in eosinophilic esophagitis

LI Zhihong1 Iliminur Ahemai2 LI Zimei3 WU Jie1▲

1.Operating Room, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Zhejiang Province, Wenzhou 325027, China; 2.Department of Medical Services, Xinjiang International Medical Center, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830011, China; 3.Department of Gastroenterology, Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture People’s Hospital, Yunnan Province, Jinghong 666100, China

[Abstract] Objective To integrate single-cell and bulk RNA sequencing data via machine learning algorithms for identifying molecular biomarkers associated with eosinophilic esophagitis, thereby providing insights for diagnosis and treatment. Methods Single-cell and bulk transcriptomic data from eosinophilic esophagitis patients were obtained from the GEO database. Following annotation and clustering of the single-cell data, the Scissor algorithm was applied to integrate single-cell and bulk analyses. Metabolic pathways in Scissor-identified cell subsets were further characterized, and molecular diagnostic models were constructed using 11 machine learning algorithms. Cell communication analysis was subsequently performed on high-diagnostic-performance molecules in combination with immune infiltration patterns. Results Twelve cell types were annotated. The Scissor algorithm identified cell subpopulations positively (Scissor+) and negatively (Scissor-) correlated with disease progression. Differentially expressed genes were significantly enriched in immune-related pathways. Core diagnostic genes CTSG and IL1RL1 were screened using multiple machine learning models and showed significantly elevated expression in eosinophilic esophagitis tissues. Immune infiltration analysis further demonstrated their close association with mast cell infiltration. Cell communication analysis revealed that CTSG+and IL1RL1+ mast cells participate in intercellular communication via the collagen/galectin and SEMA7/ICAM signaling pathways, respectively. Conclusion Machine learning models demonstrate promising molecular diagnostic performance and offer valuable guidance for the diagnosis and treatment of eosinophilic esophagitis.

[Key words] Machine learning; Eosinophilic esophagitis;Mast cells; Molecular diagnostics; Core genes

[中图分类号] R574

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）04（a）-0045-10

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25091014

▲通讯作者

（收稿日期：2025-09-13）

（修回日期：2025-12-19）