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系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种以存在针对核抗原的自身抗体和免疫复合物沉积，以及皮肤、关节和肾脏等典型靶器官的慢性炎症为特征的多系统自身免疫性疾病[1]。神经精神性狼疮（neuropsychiatric systemic lupus erythematosus，NPSLE）是SLE的一种严重并发症，临床表现呈多样化，如认知功能障碍、癫痫发作、脑卒中，甚至昏迷[2]。NPSLE的发病机制目前仍不完全清楚，是多方面因素作用的结果，普遍认为是与血-脑屏障功能障碍、自身抗体和细胞因子介入、脑内固有免疫、抗磷脂抗体相关血栓、血栓性微血管病变发生相关[3]。除针对神经精神性症状的对症处理外，NPSLE的治疗手段仍以SLE的治疗为主，如糖皮质激素、免疫抑制剂及生物制剂，存在费用高昂，疗效不理想的问题[4]。临床上NPSLE的诊治仍是难点，寻找生物标志物、挖掘治疗靶点、提高临床疗效为研究热点。

小胶质细胞（microglia，MG）占所有神经细胞的10%～15%，是中枢神经系统的主要免疫防御形式。它具有突触修剪、调节神经元和维持内部环境稳定的功能。MG被激活后可分为M1型和M2型，M1型介导炎症反应，M2型抑制炎症反应。有研究显示，MG参与NPSLE的发病机制，且抑制MG的活性可缓解NPSLE症状[5]。在NPSLE中，MG以M1型活化为主[6]。本团队前期实验发现，狼疮定可通过抑制NF-κB信号通路，使MG向M2型活化[7]。本研究旨在确定狼疮定对NPSLE的疗效，以及MG极化平衡的影响，期望为狼疮定在NPSLE的临床应用中提供实验和理论依据。

1 对象与方法

1.1 实验动物

8周龄SPF级雌性MRL/lpr小鼠30只，体质量（27.0±2.0）g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，实验动物质量合格证号：20170005071226，实验动物生产许可证号码：SCXK（沪）2017-0005；8周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠10只，体质量（20.0±2.0）g，由杭州医学院提供，实验动物质量合格证号：20220530Abzz0100018752，实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002。实验于杭州医学院（院动物房）SPF级动物实验室进行，使用许可证号：SYXK（浙）2021-0051，室温（22±2）℃，相对湿度60%～80%，昼夜节律，自由进食、饮水。本研究经浙江省实验动物中心实验动物福利伦理委员会批准（ZJCLA-IACUC-20010094），动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.2 研究药物

1.2.1 狼疮定由浙江中医药大学中药饮片有限公司提供（批号：20220530）。狼疮定由10味解毒、祛瘀、滋阴药配伍而成，包含干地黄15 g，炙鳖甲12 g，青蒿12 g，白花蛇舌草15 g，积雪草15 g，赤芍12 g，炒薏苡仁15 g，佛手片9 g，升麻9 g，甘草6 g。水煎，浓缩成生药含量1.56 g/ml，4 ℃保存[8]。

1.2.2 甘草酸单铵盐溶液使用生理盐水将甘草酸单铵盐配制成2 mg/ml的溶液，4 ℃保存。

1.3 主要仪器与试剂

荧光显微镜购于日本OLYMPUS公司（型号：BX53）；超级免疫组化油笔购于武汉赛维尔生物科技有限公司（型号：PEN-0002）；包埋机购于普瑞斯星（常州）医疗器械有限公司（型号：PBM-B）；轮转式切片机购于达科为生物技术股份有限公司（型号：MT1）；扫描仪购于匈牙利3DHISTECH公司（型号：Pannoramic MIDI）。

CD16购于美国Affinity公司（批号：2M46513）；CD206购于英国Abcam公司（批号：1068403-8）；Iba1购于英国Abcam公司（批号：1072951-12）；免疫荧光染色试剂盒（包含FSR-570Puls、FSR-520Puls、DAPI染色试剂）购于上海复生生物公司（货号：FSM0180-100T）；抗荧光淬灭封片剂购于安徽兰杰柯科技有限公司（批号：15124079L）；兔血清购于武汉赛维尔生物科技有限公司（批号：GP2408011）；无水乙醇购于国药集团化学试剂有限公司（货号：CAS：64-17-5，国药编码：100092183）；环保型脱蜡液购于武汉赛维尔生物科技有限公司（批号：2505F040）；PBS磷酸盐缓冲液干粉购于安徽兰杰柯科技有限公司（批号：21824437V）。

1.4 实验分组及处理

10只C57BL/6小鼠作为对照组；30只MRL/lpr小鼠按照随机数字表法分为模型组、中药组、甘草酸组，每组10只。对照组、模型组按体质量每天给予单蒸水灌胃1次，中药组每天按体质量给予狼疮定灌胃1次，甘草酸组每天按体质量给予甘草酸腹腔注射1次，给药剂量为10 ml/kg，干预8周。给药剂量参考本团队前期研究[9]。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 旷场实验各组动物干预8周后进行旷场实验。旷场实验在1个四周封闭的开敞箱（50 cm×50 cm）中进行，箱底部中心设立中央区（25 cm×25 cm），其余部分为周边区。实验开始时将小鼠置于旷场底部中央，用摄像头记录小鼠5 min内活动情况。使用Labmaze动物行为学分析软件统计小鼠活动情况。

1.5.2 强迫游泳实验准备高40 cm，内径20 cm的透明圆柱体容器，将小鼠放入装有干净水的圆柱容器内，水深30 cm，水温25 ℃，强迫小鼠游泳，从实验开始到结束约6 min，记录小鼠后4 min不动状态持续时间。不动状态是指动物放弃主动挣扎，躯体处于漂浮不扭动状态。被动地漂浮在水上，微微拱起但竖直状态，鼻子在水面上。

1.5.3 免疫荧光镜下检测小鼠脑皮质中MG的活化情况及活化分型行为学评估后，处死小鼠，分离大脑皮质，将新鲜组织按体积大小剪开，PBS洗去多余血液，部分置于4%多聚甲醛中固定并在4 ℃冰箱中过夜。

取出固定后的脑皮质组织，洗去固定液，梯度蔗糖溶液脱水，用OCT胶包裹标本，液氮速冻，将冰冻好的组织在leica冷冻切片机上连续切片，厚度为8～10 μm，丙酮固定切片后，低温晾干，-20 ℃保存备用。将小鼠脑皮质组织切片置于65 ℃恒温箱中烘烤1.5～2.0 h。二甲苯脱蜡，柠檬酸缓冲液（pH6.0）抗原修复。灭活内源性过氧化物酶后封闭。①一抗（CD16，1∶1 000；CD206，1∶20 000）4 ℃孵育过夜。与一抗相应种属的HRP标记的山羊抗兔/鼠通用二抗避光室温孵育50 min。对应的TSA（FSR-520Plus，1∶100）避光室温孵育15 min，封闭。②一抗（Iba1，1∶10 000）4 ℃孵育过夜。与一抗相应种属的HRP标记的山羊抗兔/鼠通用二抗避光室温孵育50 min。对应的TSA（FSR-570Plus，1∶100）避光室温孵育15 min。DAPI染核，封片。荧光显微镜下观察并拍照。采用Image J软件对免疫荧光图像进行半定量分析。每张切片随机选取3个非重叠视野（×400），以Iba1/CD16或Iba1/CD206双标阳性细胞占总细胞数（DAPI染色）的百分比作为统计指标。

1.5.4 脑皮质尼氏染色取10%中性甲醛固定后的小鼠脑皮质组织，常规石蜡包埋并切片（厚度为5 μm）。切片常规脱蜡至水后，置于焦油紫染液中，连同染色缸一并置于56 ℃温箱中浸染1 h，去离子水冲洗。将切片置于尼氏分化液中分化60 s，依次经无水乙醇脱水，二甲苯透明，最后使用中性树胶封片。在光学显微镜下观察小鼠大脑皮质神经元及尼氏体的形态分布并采集图片。

1.6 统计学方法

使用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，Graph-Pad Prism 5.0软件进行图像绘制。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（

）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验（方差齐）或Dunnett’s-T3（方差不齐）检验；不符合正态分布的计量资料采用中位数（M）和四分位数（P25，P75）表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用Kruskal-Wallis单因素ANOVE（k样本）进行多重比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组旷场实验结果比较

与对照组比较，模型组中心区运动距离增加、中心区运动距离比升高（P＜0.05）；与模型组比较，中药组中心区运动距离减少、中心区运动距离比降低（P＜0.05）。见表1。

2.2 各组总不动时间比较

与对照组比较，模型组总不动时间延长（P＜0.05）；与模型组比较，中药组总不动时间缩短（P＜0.05）。见表2。

2.3 各组脑皮质尼氏染色结果

镜下大体观察，对照组大脑皮质神经元排列规则、整齐，胞浆内尼氏体深染、排列密集；模型组大脑皮质神经元排列较紊乱，数量减少，胞浆内尼氏体数量减少，染色浅，排列较疏松；与模型组比较，中药组大脑皮质神经元数量增多，排列较规则，胞浆内尼氏体数量增加，染色深，排列较密集。见图1。

2.4 免疫荧光

2.4.1 Iba1与M1、M2型MG标志物双标免疫荧光结果 Iba1与M1型MG标志物CD16双标免疫荧光结果显示，小鼠脑皮质中Iba1呈红色，多表达于细胞膜；CD16呈绿色，多表达于细胞膜。对照组Iba1、CD16及共表达阳性细胞均较少；与对照组比较，模型组Iba1、CD16及共表达阳性细胞数量均增多；与模型组比较，中药组Iba1、CD16及共表达阳性细胞数量均减少。见图2。

Iba1与M2型小胶质细胞标志物CD206双标免疫荧光结果显示，对照组小鼠脑皮质中Iba1呈红色，多表达于细胞膜；CD206呈绿色，多表达于细胞膜。对照组Iba1、CD206及共表达阳性细胞均较少；与对照组比较，模型组Iba1及共表达阳性细胞数量增多，CD206阳性细胞数量减少；与模型组比较，中药组Iba1阳性细胞数量未见差异，CD206及共表达阳性细胞数量增多。见图3。

2.4.2 脑皮质组织M1、M2阳性细胞率与对照组比较，模型组M1阳性细胞率、M1阳性细胞/M2阳性细胞升高，M2阳性细胞率降低（P＜0.05）；与模型组比较，中药组M1阳性细胞率、M1阳性细胞/M2阳性细胞降低，M2阳性细胞率升高（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

NPSLE以抑郁样行为、癫痫等神经精神症状为特征，MG与抑郁样行为呈正相关[10]。MG的激活会促进促炎细胞因子释放，导致突触被修剪过多，从而发生神经元的损伤，MG的激活已被证实在NPSLE空间记忆障碍的病理机制中发挥作用[11-12]。其中MG活化时更倾向于转变成M1型促使炎症反应，与NPSLE的发生、发展相关。当MG活化异常时，突触修剪功能亢进，除去修剪冗余突触外，同样修剪具有功能的突触，导致神经系统病变。M2具有保护突触、营养神经的作用，可以缓解MG异常活化带来的后果。一定情况下，M1和M2可以互相转化，维持MG的极化平衡可能成为NPSLE治疗靶点研究的重要方向之一。本研究结果显示，与对照组比较，模型组中心区运动距离增加、中心区运动距离比升高（P＜0.05），提示小鼠存在焦虑样行为；与对照组比较，模型组总不动时间延长（P＜0.05），提示小鼠存在抑郁样行为。

中医药在NPSLE中的治疗具有一定效果。SLE在中医中称“阴阳毒”“红蝴蝶疮”“温毒发斑”等，证属本虚标实，多因热毒炽盛、禀赋不足而生。SLE在温病学说卫气营血理论中则以“热象偏重，易化燥伤阴”的特点为主，这是由于先天禀赋不足、真阴亏虚，后复感外邪，使卫气营血功能失调[13]。SLE患者体病而久则虚，若素体肝肾阴虚者，肝阴不足则阳热上亢，热燔风动，甚则煎灼营血，炼津成痰；肾阴不足则髓海不足，兼之痰浊已生，脑络痹阻，本虚而标实，迁延难愈，其治疗多兼顾化痰与滋阴，佐以通络，注重肝肾同调。全国名中医范永升教授认为SLE以阴虚为本，热毒瘀血为标，提出“二型九证”的SLE分型与“三维一体”的激素减量疗法。狼疮定是范永升教授治疗SLE的经验效方，出自《金匮要略》，由升麻鳖甲汤化裁而来，在SLE的治疗中有增效减毒的作用，可缓解MRL/lpr小鼠抑郁样行为、焦虑症状[9，14]。狼疮定还可降低MRL/lpr小鼠小脑组织中白细胞介素（interleukin，IL）-6、γ干扰素水平，减轻免疫炎症，稳定NPSLE病情[15]。本研究通过MRL/lpr小鼠的脑皮质组织发现，狼疮定可下调MG标志物Iba1、M1型标志物CD16的表达，上调M2型标志物CD206表达，提示狼疮定可抑制MG活化，维持MG的极化平衡，可作为NPSLE治疗的基础方。方中干地黄、炙鳖甲共为君药，奏滋阴之效；炙鳖甲辅以退虚热。青蒿、赤芍清热凉血；白花蛇舌草清热解毒，化湿通淋；升麻清热解毒透疹，均为臣药。积雪草、炒薏苡仁联合使用，有清热利湿消肿之效；佛手片疏肝解郁，理气止痛，均为佐药。甘草清热解毒、调和诸药，为使药。诸药相合，共奏清热凉血，解毒散瘀，益肾养阴之功。本研究发现，狼疮定与甘草酸均适用于治疗NPSLE。相较于含有甘草酸的狼疮定，甘草酸具有以下差异：首先，狼疮定中甘草酸浓度较低，由于中药采用煎煮法释放活性成分，这种传统熬煮工艺会导致甘草酸收效率降低；其次，给药方式差异对于吸收效率的影响，本研究采用腹腔注射甘草酸，而狼疮定通过灌胃给药。目前中药主要采用口服方式，因此中药组小鼠的治疗效果更接近人类临床情况。若后续实验将甘草酸组改为灌胃给药，结果可能更具参考价值。

MG是中枢神经系统中调节神经元、修剪突触和维持内环境稳定的重要细胞。MG分为静息状态和活化状态，通常情况下为静息状态，表现为具有三或四级分支的树枝状，功能类似巨噬细胞。MG活化时可分为M1和M2型，M1型介导炎症反应，表面抗原有CD80、CD86等，可分泌IL-6、IL-10；M2型减轻或抑制炎症反应，表面抗原有CD206，分泌胰岛素样生长因子-1、转化生长因子-β等，可保护突触，抑制突触修剪。M1表型扩大病原体损伤，而M2表型修复组织病变[14]。现有研究发现，NPSLE患者脑脊液中的IL-6含量升高，认为在NPSLE中MG更倾向于活化为促进炎症反应的M1型[16]。以肿瘤坏死因子-α、IL-1β、IL-6为特征的M1型促炎细胞因子减少与抑郁症的恢复相关[17]。组织修复的生物标志物与中枢炎症病变的改善相关，如以IL-4、IL-10、精氨酸酶-1、Ym1和Fizz1为特征的M2型标志物。有研究显示，MRL/lpr小鼠从M1型到M2型转换可抑制NPSLE中神经精神症状[18]。本研究发现，狼疮定可维持MG极化平衡，抑制NPSLE神经精神症状。

综上所述，NPSLE的治疗仍然是临床难点，狼疮定通过抑制MG的活化，减轻NPSLE的神经精神损伤。本研究结果为临床治疗NPSLE提供参考价值。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

[1] HOI A，IGEL T，MOK C C，et al. Systemic lupus erythematosus [J]. Lancet，2024，403（10441）：2326-2338.

[2] LEGGE A C，HANLY J G. Recent advances in the diagnosis and management of neuropsychiatric lupus [J]. Nat Rev Rheumatol，2024，20（11）：712-728.

[3] 侯晓钰，杨娉婷. 神经精神性狼疮研究现状[J]. 中国实用内科杂志，2020，40（12）：974-977.

[4] 杨科朋，张丹君，陈慕芝，等. 范永升教授论治狼疮脑病经验采撷[J]. 浙江中医药大学学报，2022，46（6）：629-632.

[5] NESTOR J，ARINUMA Y，HUERTA T S，et al. Lupus antibodies induce behavioral changes mediated by microglia and blocked by ACE inhibitors [J]. J Exp Med，2018，215（10）：2554-2566.

[6] 司静怡，朴思蓉，吴昊. 小胶质细胞在神经精神性狼疮发病机制中的研究进展[J]. 复旦学报（医学版），2021，48（5）：685-689，696.

[7] BASSETT B，SUBRAMANIYAM S，FAN Y，et al. Minocycline alleviates depression-like symptoms by rescuing decrease in neurogenesis in dorsal hippocampus via blocking microglia activation/phagocytosis [J]. Brain Behav Immun，2021，91：519-530.

[8] JI L，FAN X，HOU X，et al. Jieduquyuziyin prescription suppresses inflammatory activity of MRL/lpr mice and their bone marrow-derived macrophages via inhibiting expression of IRAK1-NF-κB signaling pathway [J]. Front Pharmacol，2020，11：1049.

[9] 张芹，张丹君，曹莹，等. 基于NF-κB信号通路探究狼疮定对红斑狼疮MRL/lpr小鼠炎症反应的调节作用[J]. 浙江中医药大学学报，2023，47（7）：730-736.

[10] XU J，YANG C，ZENG S，et al. Disturbance of neuronmicroglia crosstalk mediated by GRP78 in neuropsychiatric systemic lupus erythematosus mice [J]. J Neuroinflammation，2023，20（1）：150.

[11] MAKINDE H M，WINTER D R，PROCISSI D，et al. A novel microglia-specific transcriptional signature correlates with behavioral deficits in neuropsychiatric lupus [J].Front Immunol，2020，11：230.

[12] TAO W，HU Y，CHEN Z，et al. Magnolol attenuates depressive-like behaviors by polarizing microglia towards the M2 phenotype through the regulation of Nrf2/HO-1/NLRP3 signaling pathway [J]. Phytomedicine，2021，91：153692.

[13] 曹莹，张丹君，张芹，等. 从温病学说卫气营血辨证论治系统性红斑狼疮[J]. 中国医药科学，2022，12（9）：91-93，138.

[14] 祖筠筠，陆海美，王晓宇，等. 解毒祛瘀滋阴方对MRL/lpr小鼠神经精神症状的保护作用[J]. 中成药，2017，39（12）：2592-2594.

[15] 宋静宜. 狼疮定调节脑组织脂质代谢降低免疫炎症治疗NPSLE的机制研究[D]. 杭州：浙江中医药大学，2024.

[16] YOSHIO T，OKAMOTO H，KURASAWA K，et al. IL-6，IL-8，IP-10，MCP-1 and G-CSF are significantly increased in cerebrospinal fluid but not in sera of patients with central neuropsychiatric lupus erythematosus [J]. Lupus，2016，25（9）：997-1003.

[17] LI L F，LU J，LI X M，et al. Antidepressant-like effect of magnolol on BDNF up-regulation and serotonergic system activity in unpredictable chronic mild stress treated rats [J]. Phytother Res，2012，26（8）：1189-1194.

[18] NAGATA W，GOTOH M，KOIZUMI A，et al. Two-carba cyclic phosphatidic acid treatment promotes phenotypic switch from M1 to M2 microglia and prevents behavioral abnormalities in a mouse model of neuropsychiatric systemic lupus erythematosus [J]. Hum Cell，2023，36（6）：2006-2015.

【作者机构】	浙江中医药大学附属第三医院神经内科；浙江中医药大学第二临床医学院；浙江中医药大学附属第二医院风湿免疫科
【分类号】	R338.2+5
【基金】	浙江省中医药科技计划项目（2024ZL086）国家中医药管理局科技司-浙江省中医药管理局共建科技计划项目（GZY-ZJ-KJ-24017）。

基于形态学探讨狼疮定对小胶质细胞极化平衡的影响与对神经精神性狼疮的疗效

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