胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一[1]。胃癌的患病率及病死率在我国均居恶性肿瘤前2位，在世界范围也位居前3位[2-4]。其发病率居各种恶性肿瘤之首，胃癌具有高度的侵袭与转移和异常的细胞增殖等特性，其主要病理学特征为腺状细胞恶性增殖等。胃癌预后差、进展快、死亡率高。虾青素（astaxanthin，ATX）是一种常见的叶黄素类胡萝卜素，在生长、免疫等方面对机体产生影响，对多器官涉及抗氧化、抗炎等作用机制，作为一种常见的抗氧化剂，ATX已被证实对癌症、炎症和衰老具有各种各样的生物作用[5-6]。circRNA具有多种功能，其可通过与蛋白或其复合物互作来促进靶基因的转录、编码多肽等方式发挥其作用[7]。目前ATX对胃癌细胞诱导凋亡有关于circRNA的作用机制尚未明确，本研究探讨ATX对MGC-803人胃细胞凋亡的影响及是否与circ-SLIT3/Mcl-1/Caspase-7通路有关，为胃癌的进一步药物治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株

MGC-803胃癌细胞株购自Sage赛齐生物科技有限公司。

1.2 实验试剂

ATX（货号：sc-202327、SC25031801，圣克鲁斯生物技术公司）；DMEM培养基、胎牛血清（批号：3189521、3148762，格兰德岛生物公司）；CCK8试剂盒（批号：SB25040903，北京索莱宝科技有限公司）；异硫氰酸PI（批号：DG25021505，北京鼎国生物技术有限责任公司）；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（批号：4A25012208，北京四正柏生物科技有限公司）；一抗：兔抗人Mcl-1和Caspase-7抗体（批号：CST25030712、CST24110256，美国CST公司）；兔抗人β-actin抗体（批号：CST25021906，美国CST公司）；二抗：辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（批号：ZS25051109，北京中杉金桥生物技术有限公司）；FreeZol Reagent室温RNA提取试剂、RT-qPCR反转录试剂盒、PCR检测试剂盒（批号：NV25032604、NV25040207、NV25040208，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；蛋白质定量试剂盒[批号：YK25013010，亚科因（武汉）生物技术有限公司]；RT-qPCR引物序列（苏州吉玛基因股份有限公司）。

1.3 实验仪器

CO2培养箱（MCO-175，日本三洋公司）；超净工作台（JJT-900，江苏苏净集团有限公司）；多功能酶标仪（Infinite M1000 PRO，瑞士帝肯集团有限公司）；倒置荧光显微镜（MF53-N，广州市明美光电技术有限公司）；流式细胞仪（CyFlow Cube 8，日本希森美康株公司）；荧光定量PCR仪、凝胶电泳设备（CFX Opus 96、1658001，美国伯乐生命医学产品有限公司）；多功能成像仪（UVP Chemstudio 695，德国耶拿分析仪器股份公司）。

1.4 CCK8法

将进入对数生长期的MGC-803胃癌细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化后接种于96孔板，贴壁后换液，分别给予含20、40、60、80、100 μmol/L ATX的培养基，培养3 h，酶标仪测定450 nm处的吸光度（A）值[8]。细胞增殖程度=A实验组/A对照组×100%。

1.5 MGC-803细胞培养与实验分组

MGC-803胃癌细胞培养基为：900 ml/L DMEM培养基，100 ml/L胎牛血清，胃癌细胞在37 ℃、50 ml/L CO2的培养箱内培养。设置加入DMEM培养基MGC-803胃癌细胞组为空白对照组，加入20 μl浓度值为50 μmol/L 的ATX处理MGC-803胃癌细胞作为低浓度组。加入20 μl浓度值为100 μmol/L 的ATX处理MGC-803胃癌细胞作为高浓度组。

1.6 Annexin V-FITC/PI双染法

MGC-803胃癌细胞在无菌培养箱中处于对数生长期时进行收集，制成细胞数为每毫升0.5×106个的细胞悬液，以每孔2 ml的体积将胃癌细胞接种至6孔板（1×106细胞/孔）中，水平摇晃后于5% CO2、37 ℃培养箱孵育24 h。分组同“1.5”，每组设置3个复孔，干预不同时间（8、16、24 h）。利用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒进行染色，离心后的细胞用200 μl结合缓冲液重悬，加入3 μl Annexin V和5 μl PI孵育20 min。通过荧光显微镜观察未处理细胞及凋亡细胞形态、荧光（染色）强度并照相。

1.7 流式细胞术

选取对数生长期的MGC-803胃癌细胞用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种到6孔板，每孔以2 ml接种1×106个细胞。CCK8实验已确定ATX最佳处理浓度为100 μmol/L，最佳处理时间为24 h。待细胞贴壁后换液，分组同“1.5”，每组设置3个复孔。干预不同时间（8、16、24 h）后收集细胞，向每孔中均匀加入0.5 ml的0.25%的T/E用于消化细胞，晃动并震荡培养皿至细胞被完全消化。相同条件离心，吸弃上清液，留细胞团备用。每管加入200 μl结合液将细胞团混匀后，加入3 μl Annexin V-FITC和2 μl PI对细胞进行染色，检测早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞比例。

1.8 Western blot法

分组同“1.5”，每组设置3个复孔。干预MGC-803胃癌细胞，24 h后收集细胞提取细胞总蛋白，加入裂解液，冰上孵育30 min，12 000 r/min，离心30 min，取上清BCA法检测蛋白含量，制备使用SDS-PAGE凝胶，每孔上样量20 μg，在未处理组样品左侧梳孔中加入蛋白Marker。起始电泳电压为80 V，当蛋白质移动到分离胶后将电泳的电压调整到120 V持续1.5 h。以320 mA转膜90 min至NC膜。用TBST及脱脂乳（5%）按比例配制封闭NC膜2 h，分别加入兔抗人Mcl-1和Caspase-7（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5 min×6次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1∶5 000）室温孵育2 h，TBST洗膜5 min×6次，NC膜，浸泡在ECL化学发光试剂中备用。

为了进一步从分子水平上验证ATX诱导MGC-803胃癌细胞凋亡通路中hsa_circ_SLIT3是否存在对Caspase-7、Mcl-1的调控关系，在ATX处理MGC-803胃癌细胞前30 min加入过表达hsa_circ_SLIT3为实验组，并设置空载体为阴性照组对MGC-803细胞进行处理，空白对照组胃癌细胞无处理，每组设置3个复孔。利用Western blot法检测3个处理组中MGC-803细胞凋亡相关蛋白Caspase-7、Mcl-1的表达水平。内参采用β-actin。利用化学发光成像系统对Mcl-1和Caspase-7蛋白质条带进行显影，并用Image J图像分析软件检测蛋白质灰度，进行蛋白定量分析。

1.9 RT-qPCR技术

分组同“1.5”，每组设置3个复孔。干预MGC-803胃癌细胞24 h后收集空白对照组细胞和ATX低/ATX高浓度组细胞，提取总RNA，将总RNA反转录为cDNA。反转录体系（20 μl）：RNA模板1 μg，5×Prime-Seript Buffer 4 μl，RNase-Free H2O补足至20 μl；反转录条件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。circ_SLIT3的正向引物序列：5’-GCTACCTGGTGCTGTCTCTT-3’；反向引物序列：5’-CAGGGCTCTTCCTCTTCCTT-3’。GAPDH的正向引物序列：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’；反向引物序列：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。RT-qPCR反应体系（20 μl）：cDNA模板1 μl，2×TB Green Premix Ex Taq 10 μl，正、反向引物各1 μl，RNase-Free H2O 7 μl。反应条件：95 ℃，3 min；95 ℃，10 s；58 ℃，30 s；共40个循环。以GAPDH为内参，2-△△Ct法计算circ_SLIT3相对表达量。

1.10 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。使用GraphPad Prism 5.0计算IC50值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ATX抑制MGC-803胃癌细胞的增殖

对MGC-803胃癌细胞给予不同浓度的ATX处理。结果显示，CCK8检测IC50值为100 μmol/L。随着ATX浓度升高细胞存活率降低。见图1。

图1 不同浓度虾青素对MGC-803胃癌细胞的杀伤作用

2.2 Annexin V-FITC/PI双染色法观察ATX对胃癌MGC-803细胞凋亡的影响

ATX处理时间达到24 h时凋亡细胞内容物泄露，导致红色荧光蔓延到细胞外，凋亡晚期细胞周围出现成片的红色荧光，开始较难区分细胞膜边缘。见图2。

图2 荧光显微镜观察细胞形态变化

2.3 ATX对胃癌细胞MGC-803细胞凋亡的影响

干预8、16、24 h时，ATX低浓度组及ATX高浓度组胃癌MGC-803细胞凋亡数量多于空白对照组（P＜0.01）。干预24 h时ATX高浓度组凋亡率高于ATX低浓度组（P＜0.01）。见图3。

图3 ATX对MGC-803胃癌细胞凋亡的影响（n=3）

2.4 ATX处理后MGC-803细胞凋亡相关蛋白表达情况

与空白对照组比较，ATX低浓度组及ATX高浓度组促凋亡蛋白Caspase-7表达水平升高，抑制凋亡蛋白Mcl-1的表达水平降低（P＜0.01）。与ATX低浓度组比较，ATX高浓度组促凋亡蛋白Caspase-7表达水平升高，抑制凋亡蛋白Mcl-1表达水平降低（P＜0.01）。见图4。

图4 ATX对MGC-803胃癌细胞凋亡/抗凋亡蛋白的影响（n=3）

2.5 ATX处理后MGC-803细胞中hsa_circ_SLIT3的表 达情况

与空白对照组比较，ATX低浓度组及ATX高浓度组hsa_circ_SLIT3表达量下降（P＜0.01）。与ATX低浓度组比较，ATX高浓度组has-SLIT3表达量下降（P＜0.01）。见图5。

图5 RT-qPCR检测ATX干预后MGC-803中hsa_circ_SLIT3的表 达量（n=3）

2.6 过表达hsa_circ_SLIT3预处理MGC-803细胞后凋亡通路相关蛋白表达情况

实验组中细胞中Mcl-1的蛋白表达量较空白对照组及阴性对照组升高，Caspase-7蛋白表达量较空白对照组、阴性对照组降低（P＜0.01）。见图6。

图6 circ_SLIT3过表达对Caspase-7、Mcl-1表达的影响（n=3）

3 讨论

胃癌是我国第二大常见恶性肿瘤，其发生和发展迅速，易侵袭，易转移，易复发，预后差。前期有实验研究表明，ATX可通过多种机制影响体内体外抑制肿瘤细胞生长的作用。ATX能够抑制小鼠Lewis肺癌、大鼠乳腺癌、膀胱癌细胞增殖，虾青素通过作用于JAK/STAT3、NF-κB、ERK分子靶标抑制口腔癌细胞增殖、侵袭，促进口腔癌细胞凋亡[9-10]。此外，ATX通过作用于分子靶标，抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭并诱导细胞凋亡而发挥体内体外抗肿瘤作用，同样ATX也通过作用于JAK-1/STAT3信号通路发挥体内体外抗肝癌细胞的作用，并对转氨酶调节存在作用[11-12]。有研究表明，ATX通过调控 miR-214/Bcl-2轴抑制胃癌细胞增殖并诱导其凋亡[13]。综上所述，ATX在多种肿瘤中发挥作用，而在较为多见的胃癌中的作用及可能的作用机制并不完全清楚。

本研究结果显示，经过不同浓度ATX及不同时间梯度处理过的实验组MGC-803人胃癌细胞存活率低于对照组，而凋亡数目均明显高于对照组，提示ATX可通过促进MGC-803人胃癌细胞的凋亡抑制胃癌的发展。

Caspase家族是诱导细胞凋亡的重要因子，Caspase-3是该家族的核心蛋白，而Caspase-7则是Caspase-3的重要辅助蛋白，激活后可诱导细胞解体[14-15]。Mcl-1与Bax是一对拮抗蛋白，Mcl-1为抗凋亡蛋白，发挥开启/关闭凋亡信号通路的作用，能够抑制下游Caspase-3的激活，进而抑制细胞的凋亡发生[16]。Bax为促凋亡蛋白，当接收凋亡信号时，被激活的Bax可在线粒体上形成同源二聚体，增强线粒体膜通透性，引起凋亡因子释放并诱导细胞死亡。同时已有研究表明，Mcl-1可增强天然化合物处理的胃癌细胞中Caspase-7激活的凋亡效应[17]。本研究结果显示，与空白对照组比较，ATX低浓度组及ATX高浓度组Mcl-1蛋白相对表达水平降低，Caspase-7蛋白相对表达水平升高，提示ATX可通过上调促凋亡蛋白的表达，下调抗凋亡蛋白的表达，进而发挥诱导MGC-803胃癌细胞凋亡的作用。

有研究发现，hsa_circ_SLIT3在肝癌细胞中呈高表达，而影响肝细胞癌的发生、发展[18-19]。同时hsa_circ_SLIT3通过miRNA调控Mcl-1表达促进胃癌进展[20]。本研究结果显示，ATX低浓度组及ATX高浓度组中胃癌细胞hsa_circ_SLIT3相对表达量低于空白对照组，提示ATX可能通过下调hsa_circ_SLIT3表达，通过过表达hsa_circ_SLIT3，发现Mcl-1表达量增加，Caspase-7表达量下降。由此可推断hsa_circ_SLIT3可通过调节Mcl-1、Caspase-7的表达对MGC-803人胃癌细胞的凋亡产生影响，为ATX促进胃癌细胞凋亡信号通路上的关键靶点。

综上所述，ATX可通过抑制circ_SLIT3的表达，使Circ_SLIT3通路上调促凋亡蛋白Caspase-7表达，下调抗凋亡蛋白Mcl-1的表达，促进MGC-803人胃癌细胞凋亡。因肿瘤的发生和发展是细胞抗凋亡能力降低及细胞异常增殖协同后的结果，但本研究未在circ_SLIT3是否存在诱导细胞异常增殖方面进行深入研究，且仅通过检测相关凋亡蛋白表达情况反映其对胃癌细胞凋亡行为的影响。同时虽然本研究核心为凋亡效应及机制研究，非浓度-稳定性关系探究，两个关键浓度已能满足研究需求，但较常规实验中设置3个药物浓度验证稳定性稍差。后续将在ATX实验浓度及circ_SLIT3对凋亡影响上进一步开展更加全面的研究，以期为后续胃癌的临床治疗方案提供更多的数据支持。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Effect of astaxanthin on the apoptosis of gastric cancer cells by regulating the circ_SLIT3/Mcl-1/Caspase-7 pathway

WANG Tan HUO Zhanwei WU Panpan HAN Feng CHEN Yadong

The Second Department of General Surgery, Lianshui People’s Hospital of Kangda College Affiliated to Nanjing Medical University, Jiangsu Province, Lianshui 223400, China

[Abstract] Objective To explore the molecular mechanism by astaxanthin (ATX) induces gastric cancer cell apoptosis via the circ_SLIT3/Mcl-1/Caspase-7 pathway. Methods Human gastric cancer cells were treated with ATX (20, 40, 60,80, 100 μmol/L), and cell viability was detected by CCK8 assay. MGC-803 cells were divided into blank control(DMEM), low-dose (50 μmol/L) ATX group, and high-dose (100 μmol/L) ATX group, intervened for 8, 16, and 24 h.Annexin V/PI staining and flow cytometry were used to assess apoptosis of gastric cancer cells. The ATX low-dose group, the ATX high-dose group and the blank control group were treated for 24 h, Caspase-7 and Mcl-1 protine expression was detected by Western blot, and hsa_circ_SLIT3 expression was detected by RT-qPCR detected.Additionally, MGC-803 cells were transfected with hsa_circ_SLIT3 overexpression vector (experimental group), empty vector (negative control) or left untreated (blank control), and Caspase-7/Mcl-1 expression was detected by Western blot. Results As the concentration of ATX increased, the cell survival rate decreased. The expression levels of caspase-7 protein in the ATX low-dose group and the ATX high-dose group were higher than those in the blank control group,while the expression level of Mcl-1 protein was lower than that in the blank control group (P＜0.01). The expression levels of hsa_circ_SLIT3 in the ATX low-dose group and the ATX high-dose group were lower than those in the blank control group (P＜0.01).Compared with the ATX low-concentration group, the expression level of caspase-7 protein in the ATX high-concentration group increased, the expression level of Mcl-1 protein decreased, and the expression level of hsa_circ_SLIT3 decreased (P＜0.01). In the experimental group, the expression level of Mcl-1 was higher than that in the negative control group and the blank control group, while the expression level of Caspase-7 was lower than that in the negative control group and the blank control group (P＜0.01). Conclusion ATX inhibits proliferation and promotes apoptosis of gastric cancer cells by regulating apoptosis-related proteins via the circ_SLIT3/Mcl-1/Caspase-7 pathway.

[Key words] Astaxanthin; Gastric cancer cell MGC-803; circ_SLIT3; Apoptosis

[中图分类号] R734.2

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）04（b）-0073-07

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25081106

[基金项目] 江苏省淮安市自然科学研究计划项目（HAB2024094）；南京医科大学康达学院科研发展基金课题（KD2025KYJJ038）。

[作者简介]

王坦（1990.2-），男，硕士；研究方向：肿瘤分子生物学研究。

[通讯作者] 陈亚东（1975.1-），男，主任医师；研究方向：胃肠肿瘤防治方向。

（收稿日期：2025-08-17）

（修回日期：2025-12-31）