胰岛是调节细胞生长、增殖和凋亡的关键信号，已证明在调节糖尿病及其并发症中起着重要作用[1-3]。糖尿病是由胰岛素抵抗及β细胞功能减退引起的。特征是胰岛素分泌受损，同时β细胞功能逐渐下降[4-6]。近年来，大量研究表明，外周组织中Hippo信号通路的异常表达可能导致糖尿病，并成为糖尿病并发症的原因[7]。调节凋亡、增殖和分化的Hippo信号通路在增殖和凋亡及胰腺、肝脏、肾脏和血管细胞的功能调节中起着至关重要的作用[8-9]。XMU-MP-1为经多化合物筛选获得的小分子化合物，通过ATP竞争特异性抑制细胞内MST1/2磷酸化，是Hippo信号通路抑制剂。在课题组前期工作中，血浆RNA全转录组测序结果提示原钙粘蛋白-16（dachsous 1，DCHS1）是MODY家系新的候选变异基因，是否通过Hippo通路调控β细胞的功能与存活尚不明确[10]。本研究构建DCHS1敲低稳转细胞株，探讨其是否通过调控Hippo通路发挥作用，为揭示DCHS1在糖尿病发病中的分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

MIN6细胞（货号：STCC20029G，武汉赛维尔生物科技有限公司）；敲低DCHS1慢病毒（上海吉玛圣物科技有限公司）；CCK8试剂盒（白鲨生物科技有限公司，货号：G4103-1ML）；XMU-MP-1（翌圣生物科技股份有限公司，货号：53544ES05）；小鼠胰岛素酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（上海优选生物科技有限公司，货号：BC2500）；流式细胞检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：E-CK-A218）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：XA1410）；β-actin（货号：23660-1-AP）、YAP（货号：13584-1-AP）、p-YAP（货号：29018-1-AP）、TAZ（货号：15506-1-AP）、BCL-2（货号：60178-1-ig）均购于武汉三鹰生物技术有限公司；p-TAZ（货号：ab277791，英国Abcam公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 慢病毒转染 取生长状态良好的MIN6细胞，将细胞铺于6孔细胞培养板，待细胞密度达到70%~80%时，根据预实验设计的感染复数（MOI）梯度（如MOI=50、70、100），分别加入相应滴度的慢病毒颗粒，并加入适量Polybrene以提高转染效率。感染24 h后更换为完全培养基，继续培养。MIN6细胞构建DCHS1敲低稳转细胞株，设计3条针对DCHS1基因的不同干扰序列，分别命名为Dchs1-Mus-2807（KD1）、Dchs1-Mus-3011（KD2）、Dchs1-Mus-9033（KD3）。分别转染3条不同靶向DCHS1干扰序列的慢病毒，均为DCHS1敲低细胞株。利用Western blot法鉴定DCHS1蛋白表达水平。

1.2.2 通过细胞增殖毒性检测确定XMU-MP-1的合适给药浓度 将细胞悬液按照每孔1×104个细胞、100 μl的体积接种至96孔板内。参考相关文献中报道的最优浓度为1 μmol/L，运用2～5倍等比稀释的方式，保证最终DMSO浓度不高于0.1%[11]。待细胞完成贴壁过程后，向各孔分别添加10 μl浓度依次为 0.0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μmol/L的XMU-MP-1溶液。随后加入CCK8溶液，把96孔板放置于37 ℃的培养箱中，进行避光孵育2 h，最后利用酶标仪测定每孔在450 nm波长处的吸光值（A）。

1.2.3 细胞分组及处理 将细胞分为空白对照组、阴性对照组、敲低组、空白对照组+XMU-MP-1、阴性对照组+XMU-MP-1、敲低组+XMU-MP-1。其中空白对照组不做任何病毒转染，阴性对照组感染携带scramble-shRNA的慢病毒（空载体），敲低组感染DCHS1-shRNA慢病毒，嘌呤霉素筛选2周，建立DCHS1稳定敲低株。空白对照组+XMU-MP-1在实验最后48 h，培养基内加入1 μmol/L XMU-MP-1，阴性对照组+XMU-MP-1最后48 h加入1 μmol/L XMU-MP-1，敲低组+XMU-MP-1最后48 h加入1 μmol/L XMU-MP-1。XMU-MP-1处理48 h后收集细胞（3个复孔），调浓度至约2.5×105/ml，2 ml/孔接种6孔板，37 ℃ 5% CO2培养。

1.2.4 CCK8法检测细胞增殖 消化对数期细胞制备悬液，计数后按1 500个/孔接种于96孔板，每组8个复孔，设2个空白孔；按CCK8溶液∶细胞培养液=1∶10比例加10 μl CCK8溶液孵育1 h；酶标仪测450 nm波长处吸光度，监测24、48、72 h 3个时间点；数据统计分析，绘制增殖曲线。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 收集对数期细胞，调浓度至1.5×105个/ml加入15 ml离心管；1 000 r/min离心5 min，离心半径9.8 cm，弃上清PBS重悬清洗，重复1次；取500 μl悬液加1×Annexin-V Binding Solution，调终浓度至1×105个/ml；取100 μl悬液至1.5 ml离心管，加Annexin-V-FITC及5 μl PI染液混匀；室温避光孵育15 min，加400 μl 1×Annexin-V Binding Solution，1 h内流式检测。

1.2.6 ROS试剂盒检测MIN6细胞中的氧化应激水平取对数期MIN6细胞制备单细胞悬液接种于6孔板；细胞融合度达60%～80%时，按“1.2.1”方法转染，换液后37 ℃、5% CO2培养48 h；弃上清每孔加1 ml 1∶1 000稀释的DCFH-DA荧光探针工作液，37 ℃避光孵育30 min；用荧光倒置显微镜观察记录荧光情况。

1.2.7 葡萄糖刺激的胰岛素释放实验及胰岛素检测取对数期MIN6细胞，设2.8 mmol/L和25.0 mmol/L葡萄糖刺激浓度孵育各组细胞，培养完成后，每孔取250 μl上清液，-80 ℃保存，人工计数每孔细胞数（每组3次重复，取均值）；按ELISA试剂盒说明书检测，保证标准曲线批内误差＜5%、批间误差＜10%；以细胞计数校正胰岛素含量，作图并分析数据。

1.2.8 蛋白表达水平检测 采用RIPA试剂裂解提取总蛋白测定蛋白浓度，取等量蛋白经SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF膜封闭后加目的蛋白一抗（抗p-YAP、p-TAZ、YAP、TAZ、Bcl-2及β-actin抗体，1∶1 000）；置于4 ℃环境中孵育过夜，次日去除一抗，加入按1∶4 000比例稀释的HRP兔二抗，于室温孵育1 h；随后进行ECL化学发光显影，利用成像系统结合Image J软件分析条带灰度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0、GraphPad Prism 9.5统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DCHS1敲低慢病毒转染结果

空白对照组为正常细胞，阴性对照组为空载体病毒。根据预实验中不同MOI转染效率结果，当感染复数（MOI）为70时，转染效率最佳（图1A）。通过Western blot法检测确认，KD3可显著降低DCHS1蛋白表达水平，KD3与空白对照组、阴性对照组比较，DCHS1蛋白表达水平降低（P＜0.05）（图1B、C）。

图1 慢病毒转染细胞荧光图及转染细胞的DCHS1蛋白表达量

2.2 XMU-MP-1干预MIN6细胞的最佳浓度

随着XMU-MP-1浓度的增加，细胞存活率降低。XMU-MP-1在MIN6细胞中的最佳浓度为1 μmol/L。见图2。

图2 MIN6细胞系在各浓度 XMU-MP-1作用下的细胞存活率测定

2.3 敲低DCHS1对MIN6细胞增殖能力的影响

与空白对照组比较，敲低组细胞活力下降（P＜0.05）。与敲低组比较，空白对照+XMU-MP-1和阴性对照组+XMU-MP-1细胞活力升高（P＜0.05）。见图3。

图3 CCK8法检测各组细胞的增殖情况（n=3）

2.4 各组细胞凋亡率比较

与空白对照组和阴性对照组比较，敲低组和敲低组+XMU-MP-1细胞凋亡率升高（P＜0.05）。见图4。

图4 各组细胞中细胞凋亡情况的影响（n=3）

2.5 DCHS1敲低对MIN6细胞氧化应激情况的影响

与空白对照组、阴性对照组和敲低组比较，空白对照组+XMU-MP-1、阴性对照组+XMU-MP-1、敲低组+XMU-MP-1的ROS水平升高（P＜0.05）。见图5。

图5 各组细胞中ROS水平比较（n=3）

2.6 各组胰岛素分泌量比较

按照两种不同浓度（2.8 mmol/L、25.0 mmol/L）的葡萄糖分别处理各组细胞。与空白对照组、阴性对照组和敲低组比较，空白对照组+XMU-MP-1、阴性对照组+XMU-MP-1胰岛素分泌量升高（P＜0.05）。见图6。

图6 各组胰岛素分泌量比较（n=3）

2.7 DCHS1基因对MIN6细胞凋亡相关蛋白表达量的影响

与空白对照组、敲低组比较，空白对照组+XMU-MP-1、阴性对照组+XMU-MP-1、敲低组+XMU-MP-1 BCL-2蛋白表达水平升高（P＜0.05）。此外，与阴性对照组比较，空白对照组+XMU-MP-1组BCL-2蛋白表达水平升高（P＜0.05）。见图7。

图7 Western blot法检测DCHS1对MIN6细胞中BCL-2蛋白表达的影响（n=3）

2.8 DCHS1基因对Hippo信号通路关键蛋白表达变化

与空白对照组、阴性对照组比较，敲低组p-YAP与p-TAZ蛋白表达水平升高（P＜0.05）。与阴性对照组比较，敲低组+XMU-MP-1的p-YAP蛋白表达水平降低，p-TAZ蛋白的表达水平升高（P＜0.05）。见图8。

图8 Western blot法检测DCHS1对MIN6测细胞中Hippo信号通路的影响（n=3）

3 讨论

糖尿病是一种对全球人类健康构成严重威胁的慢性代谢疾病，在过去的几十年发病率显著增加。产生胰岛素的胰腺β细胞，对维持葡萄糖稳态至关重要，对于其功能障碍而导致糖尿病的进展至关重要[12-13]。随着糖尿病病程缓慢进展，胰岛β细胞数量不断减少，伴随细胞凋亡或淀粉样蛋白沉积，最终导致胰岛β细胞功能丧失[14]。信号转导的扰动发生在不同的信号水平上，导致调节网络的失衡，这可能有助于调节β细胞的质量和功能，从而促进糖尿病的进展[15]。识别调节胰腺β细胞存活、增殖和再生的细胞信号通路，以及对其作用机制的深入理解，是全面了解疾病机制及发现治疗糖尿病新药物的前提条件[16]。Hippo途径已成为一个复杂的信号网络，通过调节细胞/组织稳态和行为来控制器官大小[17-18]。本研究验证DCHS1是否经调控YAP/TAZ转录活性影响下游基因。有研究显示Hippo信号通路在调控胰腺β细胞分化及存活过程中起着不同的作用[19-20]。Hippo通路在糖尿病中的作用通常以功能性胰腺β细胞的丧失或功能障碍为特征[21]，因此，寻找促进β细胞增殖的方法可能是治疗糖尿病的潜在策略。

本研究中DCHS1敲低后YAP/TAZ蛋白表达升高的结果，与Gridnev[22]提出的DCHS1-FAT4复合物通过调控YAP/TAZ活性维持细胞增殖与极性平衡的机制高度一致，提示DCHS1-Hippo轴的紊乱可能是糖尿病发生的重要分子事件。同时Hippo通路抑制剂XMU-MP-1可部分逆转DCHS1敲低引起的β细胞功能异常，这一结果与Yin等[23]提出的Hippo通路激酶MST1/2是代谢疾病潜在治疗靶点的观点，进一步提示DCHS1-Hippo轴是调控β细胞功能的关键信号通路。

本研究借助慢病毒转染技术，探究DCHS1-Hippo轴对胰岛β细胞功能的影响。结果显示，沉默DCHS1基因后β细胞内ROS显著升高，伴随葡萄糖刺激的胰岛素分泌下降，提示该基因参与维持β细胞氧化还原稳态；沉默DCHS1会显著激活YAP/TAZ磷酸化，而Hippo通路抑制剂XMU-MP-1可重新激活YAP/TAZ，降低其磷酸化水平，部分逆转DCHS1敲低引发的氧化应激，提升胰岛细胞增殖能力与胰岛素分泌量[24]。

综上所述，DCHS1低表达导致胰岛β细胞数目增加、氧化应激与凋亡增强，增殖及胰岛素分泌减弱；其通过调控胰岛β细胞凋亡、氧化应激及Hippo通路参与糖尿病发病，为其分子机制研究提供新视角。本研究阐明DCHS1-Hippo轴调控β细胞功能的机制，为糖尿病发病研究提供新思路，该轴有望成为糖尿病精准医疗核心靶点，为治疗提供潜在方向。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Mechanism of DCHS1 low expression regulating pancreatic islet β-cell function via the Hippo signaling pathway

Muyesai Maihemuti WANG Yinmei Huzaer Janati Abidan Abulizi LIU Yiwei Abuduxukuer Yuemaier Patamu Mohemaiti

Department of Public Health, Xinjiang Medical University,Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830017, China

[Abstract] Objective To investigate the impact of protocadherin-16 (DCHS1) low expression on islet β-cell function and its underlying mechanism based on the Hippo signaling pathway. Methods MIN6 cells were transfected with lentiviral vectors, and the optimal administration concentration of XMU-MP-1 was determined by cell proliferation toxicity assay. The cells were divided into blank control group, negative control group, knockdown group, blank control group+XMU-MP-1, negative control group+XMU-MP-1, and knockdown group+XMU-MP-1. Cell proliferation ability was observed by CCK8 assay in each group; cell apoptosis was detected by flow cytometry in each group; high glucosestimulated insulin secretion test was performed to measure insulin secretion in each group; the reactive oxygen species(ROS) detection kit was used to measure the ROS content in cells; the protein expression level was detected by Western blot method. Results Compared with the blank control group and the negative control group, DCHS1 protein expression level was decreased in the knockdown group(P＜0.05). The concentration of XMU-MP-1 in MIN6 cells was set at 1 μmol/L. Compared with the blank control group and the negative control group, cell proliferation ability was reduced and apoptosis rate was increased in the knockdown group (P＜0.05). Compared with the blank control group, negative control group, and knockdown group, ROS levels were elevated in the blank control group+XMU-MP-1, negative control group+XMU-MP-1, and knockdown group+XMU-MP-1(P＜0.05). Compared with the knockdown group, apoptosis rates were significantly decreased in the blank control group+XMU-MP-1, negative control group+XMU-MP-1, and knockdown group+XMU-MP-1 (P＜0.05). Compared with the blank control group, negative control group, and knockdown group, insulin secretion levels were significantly elevated in the blank control group +XMU-MP-1 and negative control group +XMU-MP-1 (P＜0.05). Compared with the blank control group and the knockdown group, BCL-2 protein expression levels were elevated in the blank control group+XMU-MP-1, negative control group+XMU-MP-1, and knockdown group+XMU-MP-1 (P＜0.05). Compared with the negative control group,BCL-2 protein expression level was elevated in the blank control group+XMU-MP-1 (P＜0.05).Compared with the blank control group，and negative control group, p-YAP protein expression level was decreased and p-TAZ protein expression levels were increased in the knockdown group (P＜0.05). Compared with the negative control group, YAP and TAZ protein expression levels were elevated in the knockdown group and knockdown group+XMU-MP-1 (P＜0.05). Conclusion Pancreatic islet β-cell function is impaired by DCHS1 hyperexpression through suppression of the Hippo pathway,which led to excessive activation of downstream YAP/TAZ. Reducedn β-cell proliferation capacity,increased apoptosis susceptibility, heightened oxidative stress responses, and diminished insulin secretion levels are resulted in by this process, and the pathogenesis of diabetes is thereby contributed to.

[Key words] Dachsous 1; Cell proliferation; Cell apoptosis; Cell oxidative stress levels; Hippo pathway

[中图分类号] R587.1

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）04（c）-0001-07

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25101858

[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（82560662）。

[作者简介]

木也赛·买合木提（1999-），女，新疆医科大学公共卫生学院2023级劳动卫生与环境卫生学专业在读硕士研究生，主要从事慢性非传染性疾病防控研究工作。

[通讯作者] 帕它木·莫合买提（1972-），女，博士，教授，主要从事慢性非传染性疾病防控研究工作。

（收稿日期：2025-10-27）

（修回日期：2026-01-05）