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增生性瘢痕的产生与炎症反应、人皮肤成纤维细胞过度增殖、细胞外基质及胶原蛋白过度沉积密切相关，其不仅影响美观，还伴有瘙痒、疼痛等多种不适，严重影响着患者的身心健康[1-2]。目前临床治疗增生性瘢痕主要使用类固醇类激素，但激素药物存在明显的局部或全身副作用[3]。因此寻找一种安全有效，低不良反应的药物来治疗增生性瘢痕势在必行。

雷公藤红素（celastrol，CLT）是来源于中草药雷公藤根皮中的一类天然的五环三萜类化合物[4]。近年来研究发现，CLT在抗炎、抗氧化、抗纤维化等方面有良好药理活性，这为CLT治疗增生性瘢痕提供了理论依据[5-7]。凝胶制剂皮肤给药具有独特的优势，可增强药物皮肤滞留性能，延长药物作用时间，已在业内得到广泛关注[8-9]。

本研究在课题组前期研究工作基础上，重点考察雷公藤红素凝胶（celastrol loaded gel，CLT-Gel）对兔耳增生性瘢痕的治疗作用，为后续开发以CLT为活性成分的局部制剂，用于增生性瘢痕的治疗，提供有益的理论依据和实验基础。

1 对象与方法

1.1 实验动物

12只普通级新西兰兔，体重3.0～3.5 kg，雄性，购于贵州中医药大学实验动物研究所，实验动物使用许可证号：SCXK（黔）2021-0005，实验动物生产许可证号：SCXK（黔）2021-0003，实验动物合格证号：10662350000098。新西兰兔饲养于贵州中医药大学实验动物研究所，单笼喂养，可自由进食及饮水，室温15～25 ℃，空气湿度58%～84%，12 h光照/12 h无光照。本研究经贵州中医药大学实验动物伦理会批准（20220012）。

1.2 主要仪器与试剂

CLT（货号：23110703）购于成都普菲德生物科技有限公司；泊洛沙姆407、泊洛沙姆188（货号：1112Q022、917L023）购于北京索莱宝科技有限公司；羟丙基甲基纤维素（货号：C13506780）购于上海麦克林生化科技有限公司；乌来糖（货号：N06GS167134）购于上海源叶生物科技有限公司；转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、Col-Ⅲ酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（货号：T353IYE5QS、May2022）购于泉州市睿信生物科技有限公司。

电子天平（测量精度为0.1 mg，型号：AUW120D）购于上海菁海仪器有限公司；恒温水浴锅（型号：DK-98-Ⅱ）购于天津市泰斯特仪器有限公司；数显恒温磁力搅拌器（型号：HJ-6A）购于常州国华电器有限公司；水浴恒温振荡器（型号：DKZ-2）购于上海精宏实验设备有限公司；10 mm皮肤环钻购于易剪梅医疗器械公司；离心机（型号：H2050R）购于湖南湘仪离心机仪器有限公司；酶标仪（型号：MULTISKAN SKY）购于赛默飞世尔科技有限公司；手持式高速匀浆机（型号：LC-SFJ-10）购于上海力辰邦西仪器科技有限公司。

1.3 实验分组及处理

1.3.1 CLT-Gel的制备课题组前期已确定CLT-Gel的最优处方及制备工艺[10]，即：将3.2 g泊洛沙姆407、0.5 g泊洛沙姆188、0.16 g羟丙基甲基纤维素混合均匀后放入盛有10 ml蒸馏水西林瓶中，使其平铺在液面上，再吸取10 ml蒸馏水加入其中。4 ℃静置12 h，充分溶胀并除去气泡，得到透明澄清的基质溶液。精密称定0.060 g CLT于2 ml EP管中，加1.5 ml甲醇超声溶解后与凝胶基质溶液混合，磁力搅拌器将其混合均匀并搅拌过夜挥去甲醇，即得橙黄色的CLT-Gel溶液。

1.3.2 CLT溶液的制备精密称定0.030 g CLT对照品于2 ml EP管中，加入1 ml甲醇，超声溶解。在25 ml EP管中加入18 ml 1%吐温80水溶液与1 ml乙醇，三者混合充分摇匀，制得橙黄色CLT溶液。

1.3.3 实验分组及处理采用随机区组分组方法对12只兔子进行分组。设定区组长度为4，使用计算机生成随机分配序列。将12只兔子按体质量顺序依次编号后，按序列顺序进行分配，确保在分配过程中每满4只动物时，4个处理组均被分配1次，最终形成4组（即空白对照组、模型组、CLT组、CLT-Gel组），每组3只。除空白组外，其余各组参照文献[11]进行造模，具体方法：兔耳缘静脉注射20%乌来糖溶液（4 ml/kg）麻醉，碘伏对兔耳腹侧进行消毒。避开动脉及明显血管，沿兔耳长轴方向，用直径为10 mm环砖制作圆形切口。用镊子沿切口小心剥离全层皮肤，再用骨膜分离器完全剔除兔耳创口处的软骨膜，并保留软骨。每只兔耳以耳中动脉为界限，每只耳各制作6个创面，创面间隔1.5 cm，促创完成后将兔子放回笼中正常饲养28 d。造模28 d后进行药物干预，空白组和模型组正常饲养；CLT组给予CLT溶液1 mg/kg，每天2次；CLT-Gel组给予CLT-Gel 2 mg/kg，每天1次。将药物均匀涂布在面积约为1.5 cm×1.5 cm增生性瘢痕处，避免将药物涂布到正常皮肤处。涂布后按摩促进吸收。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 瘢痕增生指数给药结束后，游标卡尺测量兔耳瘢痕厚度和周围正常皮肤的厚度，并计算瘢痕增生指数（scar elevation index，SEI），SEI=瘢痕组织厚度/正常皮肤厚度。当SEI＞1.6，认为存在明显瘢痕，提示瘢痕增生模型建立成功[12-13]。

1.4.2 温哥华瘢痕评分从血管分布、色泽、厚度、柔软度4个参数对兔耳增生性瘢痕给药前后情况进行评估，分值越高表明增生性瘢痕越严重，其评价标准如下，血管分布：瘢痕红润程度与正常皮肤近似记0分；肤色偏粉红记1分；肤色偏红记2分；肤色呈紫色记3分。色泽：色泽与正常皮肤近似记0分；色泽较浅记1分；混合色泽记2分；色泽较深记3分。厚度：正常记0分；＜1 mm记1分；1～2 mm记2分；＞2～4 mm记3分；＞4 mm记4分。柔软度：正常记0分；柔软（最小压力能使皮肤变形）记1分；柔顺（在压力下能变形）记2分；质硬（成块状不能变形，有对抗阻力）记3分；弯曲（呈绳状，伸展时会退缩）记4分；挛缩（永久性缩短导致残废与畸形）记5分。总分为15分，若单个瘢痕所得评分＜4分，则不纳为研究对象[13]。

1.4.3 HE染色给药结束后，空气栓塞法处死新西兰兔，用直径为10 mm的环钻于兔耳瘢痕中央取材，将组织用生理盐水洗净后4%多聚甲醛固定。HE染色后于光镜下观察其病理变化（×200），并测量皮肤厚度（真皮+表皮），利用Image-Pro Plus 6.0软件计算每视野成纤维细胞的数目[14]。

1.4.4 Col-Ⅲ及转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）含量测定按照ELISA试剂盒说明书具体操作流程制备组织匀浆液并检测ColⅢ及TGF-β1的含量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 27.0统计学软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（

）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔耳增生性瘢痕模型建立结果分析

造模第1～28天，兔耳增生性瘢痕经时变化如图1所示，结果显示，造模前期，除造模切口外，无明显红肿现象，组织液与血液凝固，用手触摸，水肿明显。造模中期，切口向外卷曲明显，创面呈火山口状隆起，创面毛细血管大量增生。造模后期，创面结痂完全，部分创面脱痂呈火山口状，色泽鲜红，切口边缘有鳞状细胞碎片脱落，开始上皮化。造模第28天，创面已基本完成上皮化，瘢痕明显隆起，质地较硬，瘢痕表面皱缩明显。兔耳增生性瘢痕组织块的厚度＞2 mm，触感与兔耳软骨接近时提示兔耳增生性瘢痕模型成功建立。

2.2 各组治疗前后瘢痕组织形态观察

各组治疗效果如图2所示，可见给药15 d后，CLT组与CLT-Gel组瘢痕中央的瘤样突起明显消退，色泽与周围皮肤接近，毛细血管增生相比治疗前有所消退，瘢痕厚度明显降低。

2.3 各组治疗后SEI比较

与空白组比较，模型组SEI增高（P＜0.05）。与模型组比较，CLT组、CLT-Gel组SEI降低（P＜0.05），与CLT组比较，CLT-Gel组SEI降低（P＜0.05）。见图3。

2.4 各组治疗后温哥华评分比较

与空白组比较，模型组温哥华瘢痕评分升高（P＜0.05）；与模型组比较，CLT组、CLT-Gel组温哥华瘢痕评分降低，且CLT-Gel组温哥华瘢痕评分低于CLT组（P＜0.05）。见图4。

2.5 HE染色结果

空白组表皮及真皮完整，胶原纤维束及弹力纤维平行排列，皮下可见完整的软骨结构。模型组中表皮结构类似于厚皮组织（5层结构），粗大密集的胶原纤维束及弹力纤维，排列杂乱无章，呈旋涡状；可见大量薄壁微血管及中量炎细胞弥漫浸润并可见明显增生的瘢痕组织形成。CLT组表皮及真皮完整，可见粗大密集的胶原纤维束及弹力纤维，卷曲程度较模型组有所减轻。CLT-Gel组表皮及真皮完整，由致密结缔组织组成，可见胶原纤维束及弹力纤维，卷曲程度较CLT组减轻。见图5。

2.6 各组成纤维细胞数量及皮肤厚度测定结果比较

与空白组比较，模型组成纤维细胞数目和皮肤厚度增高（P＜0.05）；与模型组比较，CLT组肤厚度降低，CLT-Gel组成纤维细胞数量和皮肤厚度降低（P＜0.05），且CLT-Gel组成纤维细胞数量和皮肤厚度低于CLT组（P＜0.05）。见图6。

2.7 ELISA检测结果

与空白组比较，模型组TGF-β1、Col-Ⅲ含量升高（P＜0.05）；与模型组比较，CLT组、CLT-Gel组TGF-β1、Col-Ⅲ含量降低（P＜0.05）。见图7。

3 讨论

目前，临床治疗增生性瘢痕主要通过手术及药物来治疗，相较于手术，局部涂抹药物因其方便给药、无痛、不良反应少、患者依存性高等优点而被大众所接受，但增生性瘢痕角质层增厚，真皮增生，导致药物难以渗透吸收，难以达到药物治疗有效浓度[15-17]。凝胶制剂是一种具备良好生物相容性及理化性质的组织工程材料，也是一种理想的皮肤创面敷料，作用于皮肤伤口后短时间内可促进皮肤伤口闭合，抑制伤口炎症反应并促进胶原纤维的生成[18]。研究发现，利用冷溶法制备的凝胶具有高黏滞性，能长时间贴附于用药部位，使药物缓慢释放，有助于维持药物在治疗区域的浓度稳定，从而提高治疗效果并减少给药频率，以提高药物的生物利用度[19-20]。CLT是从中药雷公藤根部提取的一种五环三萜类化合物，近年研究发现其具有良好抗炎、抗氧化、抗纤维化等药理活性。杨洋等[21]研究发现CLT可以通过抑制IL-34/CSF-1R/STAT3信号通路减轻急性胰腺炎的早期炎症反应，从而对其具有一定的保护作用。Luo等[22]研究发现，CLT可以通过抑制炎症反应及有助于支持炎症反应的Warburg效应来减轻脓毒症引起的组织损伤。Zhu等[23]研究发现CLT可以通过靶向LRP1来抑制成纤维细胞分泌CCL2，减少CCL2介导的巨噬细胞募集，阻断成纤维细胞-巨噬细胞串扰，从而改善银屑病症状。Luo等[24]研究发现，CLT可以通过修饰PRDX蛋白的活性半胱氨酸位点来抑制其酶活性，并且可上调HO-1的表达而导致LPO、ROS和Fe2+的积累，从而诱导活化的肝星状细胞发生铁死亡来有效改善肝纤维化。基于此，本研究建立兔耳增生性瘢痕模型，以SEI、温哥华瘢痕评分、HE染色、皮肤厚度、瘢痕成纤维细胞数目及ELISA检测来考察CLT-Gel与CLT溶液兔耳增生性瘢痕治疗情况，结果显示CLT-Gel组对兔耳增生性瘢痕具有显著治疗效果。

成纤维细胞是瘢痕增生过程中主要的细胞，也是修复创伤的主要功能细胞，其增殖与凋亡的失衡被认为是瘢痕形成的细胞学基础，是形成增生性瘢痕的关键因素，在病理性瘢痕愈合过程中，成纤维细胞被激活分化为肌成纤维细胞，产生大量α-平滑肌肌动蛋白，导致I、Ⅲ型胶原蛋白及纤维蛋白等细胞外基质过度沉积[18,25-27]。研究表明，CLT具有显著的抗纤维化作用[28]。本研究通过HE染色观察CLT-Gel组与CLT组的病理情况及对成纤维细胞数目和皮肤厚度进行统计分析，结果显示CLT溶液能显著降低瘢痕皮肤厚度，但未能显著减少成纤维细胞数量。这可能是因为溶液剂型局部清除快，药物暴露不足，仅能抑制成纤维细胞的合成功能，而不足以有效诱导其凋亡或抑制其持续增殖。比较之下，CLT-Gel组能显著降低成纤维细胞数目及皮肤厚度，有助于增生性瘢痕的恢复，这与凝胶递送系统通过延长药物局部驻留、提供缓释作用，确保靶组织内持续有效的药物浓度有关。在进行统计学分析时，当观察到统计上存在显著差异时，尽管现实中没有差异，也会出现第一类错误；而当观察不到统计上显著差异时，即使真的存在差异，也会出现第二类错误[29-30]。本研究参照相关文献[29]，使用G*Power软件（版本3.1.9.7）对实验的结果进行事后统计效能分析，以成纤维细胞数量为例，在效应量的大小未明确时，根据每组的平均值和标准偏差计算出“effect size f”值为1.144 554，随后将其值输入相应的位置即得效能值 ≥80%。

TGF-β1广泛分布于各种细胞组织中，参与创伤愈合的全过程，与增生性瘢痕的形成密切相关，在细胞内主要依赖于TGF-β1/Smad信号传导通路发挥作用，同时控制Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白及纤维蛋白的表达，是介导皮肤成纤维细胞形成的重要通路[8]。大量证据显示，TGF-β1可通过TGF-β1/Smad通路调控启动成纤维细胞的增殖分裂，导致胶原蛋白的大量合成并在细胞外基质过度沉积，最终形成纤维化的组织病理学改变[31]。本研究通过ELISA法测定不同组别TGF-β1、Col-Ⅲ蛋白表达情况，结果显示CLT-Gel组与CLT组均能显著降低两种因子的表达水平。

综上所述，CLT-Gel能够治疗增生性瘢痕，CLT-Gel相较于CLT溶液，能更好地发挥其剂型优势，给药时在体温的作用下由液态转变为胶凝态提高自身的黏滞性，在瘢痕部位达到局部给药并持续释药的目的，相较于CLT溶液其可在一定程度上减少用药次数，同时显著提高治疗效果。本研究提示，CLT凝胶制剂具有抑制兔耳瘢痕增生的作用，后期笔者将对其治疗机制进行深入研究。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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【作者机构】	贵州中医药大学药学院；贵州汉方药业有限公司
【分类号】	R965
【基金】	国家自然科学基金资助项目（81960650）贵州省科技计划项目（黔科合中引地[2023]006）贵阳市科技计划项目（筑科合同[2023]48-7号）。

雷公藤红素凝胶对兔耳增生性瘢痕作用的实验研究

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