DOI:10.20047/j.issn1673-7210.25102165
中图分类号:R283.1
王青平, 张涛, 施冲煜, 吕喆云, 吴佳妮, 刘建群
| 【作者机构】 | 江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 |
| 【分 类 号】 | R283.1 |
| 【基 金】 | 国家自然科学基金资助项目(82160731) 江西省中医药标委会标准化项目(2024A027) 江西中医药大学校级科技创新团队发展计划项目(CXTD22007)。 |
甘草为豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)或光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)的干燥根及根茎,具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛及调和诸药等功效[1]。其临床应用历史悠久,炮制方法丰富;不同炮制方法可改变甘草的药性功效及临床应用,体现其配伍灵活性,如生品甘草性味甘平,长于清热解毒;蜜炙后性转甘温,功偏补脾益气、润肺止咳;清炒后则性转温燥,功专温中散寒、燥湿运脾,临床多用于脾胃虚寒、脘腹冷痛之证[2-4]。在经典名方中,常运用甘草或其炮制品进行配伍,起到缓和药性、增效减毒、调和复方等作用[5]。经文献考证,古籍所载许多“经典名方”中,如厚朴温中汤,所用炙甘草实多指清炒甘草[6-7];然2025年版《中华人民共和国药典》仅收载蜜炙甘草,清炒甘草则散见于少数地方标准,且现有研究存在评价体系不完善、指标权重主观性强等问题,制约了其质量控制水平[8]。
为此,本研究系统集成Box-Behnken响应面法、AHP-CRITIC混合加权法与统计容忍区间法,构建清炒甘草工艺优化与质量评价体系。基于单因素试验,通过Box-Behnken响应面法建立工艺参数与评价指标的数学模型,优化炮制工艺[9]。同时采用AHP-CRITIC混合加权模型综合主客观信息,确定多指标复合权重并计算综合评分,提升评价体系的科学性[10-11]。基于优化工艺制备15批样品,系统评价其多项关键质量属性;再运用容忍区间法并参照2025年版《中华人民共和国药典》[1]及相关标准[12],科学制订质量限度,最终建立兼具统计科学性与实践适用性的清炒甘草质量标准,为其规范化生产与质量评价提供可靠依据。
Agilent 1260型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司);MS-10型多功能电热炒货机(常州市金坛迈斯机械有限公司);GZX-9146MBE数显鼓风干燥箱(上海博讯医疗生物仪器股份有限公司);DE-150万能高速粉碎机(浙江红景天工贸有限公司);BSA1248-CW万分之一电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)。
甘草苷、甘草酸铵对照品(批号和纯度分别为111610-202209、110731-202122和95.2%、94.4%)均购自中国食品药品检定研究院;乙腈(色谱纯,德国默克股份有限公司);磷酸(色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司);水为娃哈哈纯净水;其他试剂均为分析纯。
15批的甘草饮片的信息见表1,经江西中医药大学付小梅教授鉴定为豆科植物甘草的干燥根和根茎,均符合2025年版《中华人民共和国药典》[1](一部)甘草饮片项下相关规定。
表1 甘草饮片信息
S5240402 S10240405甘肃S11240206产地编号批号新疆S1240412 S2230627 S3240104 S4240416内蒙古S6240318 S7240223 S8240501 S9240511 S12240115 S13240507 S14240327 S15240309
将100 g甘草饮片(S10)置于预热的炒药机内,控制温度与时间,炒至饮片表面呈深黄色并略带焦斑,随即取出,于室温下摊开冷却,备用。
2.2.1 色谱条件 色谱柱Waterssymmetry C18(4.6 mm× 250 mm,5 μm);流动相乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B),梯度洗脱(0~8 min,19%A;8~35 min,19%~50%A;35~37 min,50%~100%A);流速1 ml/min;检测波长237 nm;柱温30 ℃;进样量10 μl。
2.2.2 混合对照品溶液的制备 取甘草苷对照品、甘草酸铵对照品适量,精密称定,加70%乙醇分别制成1 ml含甘草苷40 μg、甘草酸铵0.2 mg的溶液,即得对照品溶液(甘草酸的重量=甘草酸铵重量/1.020 7)。
2.2.3 供试品溶液制备 取“2.1”项下清炒甘草样品粉末0.1 g,精密称定,置于100 ml具塞锥形瓶中,精密加入70%乙醇50 ml,称定质量,超声处理(功率500 W,频率40 kHz)30 min;放冷,再次称定质量,用70%乙醇补足减失的质量,摇匀;滤过,取续滤液,即得供试品溶液。
2.2.4 系统适用性考察 取“2.2.2”“2.2.3”项下溶液,按“2.2.1”项色谱条件进样分析,记录色谱图。结果见图1,在该色谱条件下,理论板数按甘草苷峰计 ≥5 000,甘草苷和甘草酸的色谱峰与相邻峰可完全分离,阴性对照无干扰。
图1 高效液相色谱图
2.2.5 线性关系考察 分别配制浓度为0.004 8、0.009 6、0.019 2、0.038 3、0.076 6、0.153 3、0.306 5 mg/ml的甘草苷对照品溶液,浓度为0.023 7、0.047 5、0.095 0、0.190 0、0.380 0、0.759 9、1.519 8 mg/ml的甘草酸对照品溶液,按“2.2.1”项色谱条件进样测定,记录峰面积。以各对照品的浓度(mg/ml)为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归,得到甘草苷的回归方程为Y=17 903X-23.827(R2=0.999 6)、甘草酸的回归方程为Y=5 413.3X-61.959(R2=0.999 6),提示甘草苷在浓度为0.004 8~0.306 5 mg/ml范围内线性关系良好,甘草酸在浓度为0.023 7~1.519 8 mg/ml范围内线性关系良好。
2.2.6 精密度试验 取“2.2.3”项下供试品溶液,按“2.2.1”项色谱条件连续进样6次,测定峰面积并计算RSD。结果显示,甘草苷、甘草酸的RSD值分别为0.86%、0.03%(n=6),提示仪器精密度良好。
2.2.7 稳定性试验 取“2.2.3”项下供试品溶液,按“2.2.1”项色谱条件于0、2、4、6、8、10、12、24 h分别进样测定,测定峰面积并计算RSD。结果显示,甘草苷与甘草酸的RSD分别为1.03%和0.14%(n=8),提示供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.2.8 重复性试验 按“2.2.3”项方法平行制备6份供试品溶液,在“2.2.1”项色谱条件下测定,计算甘草苷与甘草酸的含量及RSD。结果显示,二者平均含量分别为0.67%和3.02%,RSD分别为0.92%和1.08%(n=6),提示该方法重复性良好。
2.2.9 加样回收率试验 按“2.2.3”项方法平行制备6份供试品溶液,在已知含量的样品中加入适量甘草苷与甘草酸铵对照品,并按“2.2.1”项下色谱条件测定。结果显示,甘草苷与甘草酸的平均加样回收率分别为101.08%和101.91%,RSD分别为1.31%和0.28%(n=6),提示该方法准确性良好。
参照2025年版《中华人民共和国药典》[1]四部通则2201的热浸法,通过比较不同溶剂对清炒甘草的浸出效果,优化并确定其浸出物测定的最佳溶剂条件,结果见表2。结果显示,以20%乙醇为溶剂时浸出物含量最高。然而,由于低浓度乙醇过滤困难,实验的重复性与操作稳定性受到影响。经综合评估浸出物含量与实验可操作性,最终选用40%乙醇作为提取溶剂。
表2 浸出物测定溶剂考察结果
溶剂浓度(%)浸出物含量平均值(%)乙醇9523.597037.404039.602043.47水-35.72
注 “-”表示纯水。
选取切面颜色与形态、气味等关键外观性状作为评价指标,构建综合评分公式:传统外观性状综合评分=(切面颜色及形态评分/切面颜色及形态评分最大值)×0.6+(气味评分/气味评分最大值)×0.4,以系统评估清炒甘草的炮制程度,评分规则见表3。
表3 清炒甘草的外观性状评分规则
切面颜色切面深黄色,颜色均匀,偶有焦斑,形成层环明显,5色,形成层环颜色深,焦斑明显多切面较生品颜色无太大变化,切面显示黄白色1~2气味具焦香气,无生味或焦煳味,味甜而特殊5略带焦香气,味甜而特殊或焦香气重,略带轻微3~4煳味评分项目外观描述评分(分)及形态射线放射状切面较生品颜色加深,显黄色,颜色均匀,有明显3~4放射状纹理及形成层环,无焦斑。或切面显深褐或浅黄色。或切面黑褐色,多数饮片出现焦煳现象甘草有生味或焦煳味明显1~2
2.5.1 层次分析(analytic hierarchy process,AHP)法计算权重 选取甘草苷、甘草酸、浸出物及外观性状为关键指标,构建层次结构模型。将该模型中的指标分为目标层与准则层,通过构建判断矩阵进行两两比较,确定各指标相对重要性权重。结果见表4,该矩阵的一致性比率为0.000 6(<0.1),提示矩阵满足一致性要求,权重系数有效可信[13]。
表4 AHP法判断矩阵
指标甘草酸浸出物外观性状甘草苷权重系数一致性比率甘草酸18110.317 3浸出物1/811/91/80.038 5外观性状19110.326 80.000 6甘草苷18110.317 3
2.5.2 客观赋权(criteria importance through intercriteria correlation,CRITIC)法计算权重 采用SPSS AU在线分析系统中的CRITIC法计算各评价指标的变异性、冲突性及信息量,并据此确定各指标的客观权重系数,结果见表5。
表5 CRITIC相关数据
指标甘草苷甘草酸浸出物外观性状指标变异性0.285 20.283 80.258 20.315 3指标冲突性1.826 32.270 92.085 23.638 1信息量0.520 90.644 50.538 41.147 1权重系数0.182 70.226 10.188 90.402 4
注 CRITIC:客观赋权。
2.5.3 AHP-CRITIC复合加权法的指标权重确定 为综合AHP法的主观评价优势与CRITIC法的客观数据特性,本研究采用乘法合成法计算组合权重[14]。具体公式如下:
Yi为第i项指标的组合权重;ωi(AHP)为通过AHP法确定的第i项指标的权重;ωi(CRITIC)为通过CRITIC法确定的第i项指标的权重;n为评价指标的总数。
该方法通过乘法合成与归一化处理,使最终权重分配兼顾专家经验与数据客观性。经计算,甘草苷、甘草酸、浸出物及外观性状的组合权重系数分别为0.215 9、0.267 2、0.027 1和0.489 7。
2.5.4 综合评价结果 综合评分作为评价清炒甘草样品整体质量的核心指标,通过对甘草苷含量、甘草酸含量、浸出物及外观性状四项关键指标进行加权归一化处理而得。其计算公式为综合评分=(ω1×Y1/Y1max+ω2×Y2/Y2max+ω3×Y3/Y3max+ω4×Y4/Y4max)×100,式中Y1~Y3为甘草苷、甘草酸、浸出物的实测值,Y4为外观性状评分值,Y1max~Y4max为各指标测定的最大值、ω1~ω4为各指标对应的复合权重系数[14]。
选取炒制温度(A)、炒制时间(B)、投料量(C)作为考察清炒甘草工艺的因素,进行三因素五水平的单因素实验,以甘草苷、甘草酸、浸出物和外观性状为评价指标,运用AHP-CRITIC混合加权法确定复合权重并计算综合评分,15组实验结果见表6。
表6 单因素实验结果汇总
单因素实验编号变量参数甘草苷含量(%)甘草酸含量(%)浸出物含量(%)外观性状总评分(分)综合评分(分)炒制温度(℃)1800.662.9737.870.3674.1921000.733.1236.380.4881.2731200.692.9537.320.7687.4241400.633.0037.940.8086.2551600.592.9937.210.5275.65炒制时间(min)6100.662.7035.820.3671.807150.663.1337.890.4878.648200.692.9537.320.7687.429250.743.5236.810.9297.2210300.683.0236.870.7285.71投料量(g)11500.613.1835.750.6079.14121000.692.9537.320.7687.42131500.773.1439.530.6890.81142000.593.2437.680.4875.91152500.713.0236.890.2071.93
2.6.1 炒制温度考察 取同一批次(S10)生甘草5份,每份100 g,分别在80、100、120、140、160 ℃下炒制20 min。结果显示,在120 ℃条件下炒制的样品综合评分最高(表6)。据此,将炒制温度的优化范围确定为100~140 ℃,并以120 ℃作为后续响应面分析的中心点。
2.6.2 炒制时间考察 取同一批次生甘草5份,每份100 g,在120 ℃下分别炒制10、15、20、25、30 min。结果显示,在25 min条件下炒制的样品综合评分最高(表6)。据此,将炒制时间的优化范围确定为20~30 min,并选取25 min作为后续响应面分析的中心点。
2.6.3 投料量考察 取同一批次生甘草5份,投料量分别为50、100、150、200、250 g,在炒制温度120 ℃、炒制时间20 min的条件下进行炮制。结果显示,当投料量为150 g时,样品的综合评分最高(表6)。据此,将清炒甘草投料量的优化范围确定为100~200 g,并选取150 g作为后续响应面分析的中心点。
2.7.1 Box-Behnken响应面法实验设计 在单因素实验基础上,采用Box-Behnken响应面设计方法,借助Design-Expert 13软件,以炒制温度(A:100、120、140 ℃)、炒制时间(B:20、25、30 min)、投料量(C:100、150、200 g)三因素三水平,进行Box-Behnken响应面实验设计分析。
2.7.2 Box-Behnken响应面实验方案与结果 以炒制温度(A)、炒制时间(B)、投料量(C)为自变量,以甘草苷、甘草酸、浸出物和外观性状的综合评分为因变量,采用Box-Behnken设计进行实验,具体方案与结果数据见表7。
表7 Box-Behnken试验设计与结果
实验编号温度(℃)时间(min)投料量(g)甘草苷含量(%)甘草酸含量(%)浸出物含量(%)外观性状总评分(分)综合评分(分)1100201500.652.9435.880.4072.272140201500.652.7835.390.6082.023100301500.652.9034.500.6082.934140301500.552.7734.690.5274.135100251000.682.9334.720.7290.926140251000.572.8334.590.7286.357100252000.542.6833.880.6077.508140252000.572.8134.880.7286.229120201000.602.7635.810.8091.3810120301000.592.9035.640.6885.5311120202000.552.7935.100.5274.4412120302000.552.7134.260.8089.0113120251500.622.6535.220.8895.4214120251500.512.6033.050.8891.2915120251500.622.7535.450.8896.2116120251500.622.8235.440.8896.9217120251500.642.8534.770.8897.62
2.7.3 Box-Behnken响应面实验结果分析 应用Design-Expert 13.0软件对表7中的实验数据进行拟合分析,建立二次多元回归模型:综合评分=95.49+0.637 5A+1.44B-3.38C-4.64AB+3.32AC+5.10BC-8.75A2-8.91B2-1.49C2。模型方差分析结果显示:回归模型达到显著水平(P<0.01),而失拟项不显著(P=0.819 8>0.05)(表8)。模型的决定系数R2=0.972 1,调整决定系数R2adj=0.936 3,提示该模型能够解释93.63%的响应值变化,具有优良的拟合度和预测可靠性。各工艺参数对综合评分的影响强度依次为:投料量(C)>炒制时间(B)>炒制温度(A),其中投料量(C)的影响达到高度显著水平。
表8 方差分析结果
方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型1 064.069118.2327.150.000 1显著A(炒制温度)3.2513.250.750.416 2不显著B(炒制时间)16.51116.513.790.092 6不显著C(投料量)91.26191.2620.960.002 6显著AB 86.03186.0319.750.003 0显著AC 44.11144.1110.130.015 4显著BC 104.221104.2223.930.001 8显著A2322.351322.3574.02<0.000 1显著B2333.911333.9176.67<0.000 1显著C29.4119.412.160.185 1不显著残差30.4874.35失拟误差5.7231.910.310.819 8不显著纯误差24.7746.19总离差1 094.5416
通过进一步分析,获得反映投料量、炒制温度及炒制时间三因素间交互效应的3D响应面图及等高线图。图2显示,投料量与炒制温度、投料量与炒制时间的交互作用较强,对综合评分影响显著。借助Design Expert 13.0软件进行最优参数解析,模型拟合预测的最佳炮制工艺参数为炒制温度118.08 ℃、炒制时间24.37 min、投料量100.31 g。
图2 各因素交互作用对清炒甘草综合评分影响的三维响应面图与等高线图
2.7.4 最佳工艺验证 考虑便于生产实际,对优选出的清炒甘草最佳炮制工艺进行了圆整,确定清炒甘草的最佳炮制工艺为炒制温度120 ℃、炒制时间25 min、投料量100 g。据此工艺进行3次平行验证试验,结果显示,3次试验平均综合评分为98.41分,RSD为1.18%,与预测分值97.37分接近,提示该工艺条件稳定可行,模型拟合效果良好。
2.8.1 炮制 取“1.2”项下的15批生甘草饮片(S1~S15),按照上述优化得到的最佳炮制工艺,在炒药机中进行炮制,得到相应的15批清炒甘草样品(P1~P15)。
2.8.2 性状 炒制后的甘草呈类圆形或椭圆形的厚片;外表皮红棕色或灰棕色,具纵皱纹。炒制品切面较生品色泽加深,呈现黄色至棕黄色,微具焦斑,略显纤维性,有明显放射状纹理及形成层环。质坚实,具粉性。有焦香气,味甜而特殊。
2.8.3 显微鉴别 粉末淡棕黄色,纤维成束,直径为8~14 μm,壁厚,微木化,周围薄壁细胞含草酸钙方晶,形成晶纤维。草酸钙方晶多见。具缘纹孔导管较大。稀有网纹导管。木栓细胞红棕色,多角形,微木化。
2.8.4 薄层鉴别 参照2025年版《中华人民共和国药典》[1](一部)中“甘草”项下的薄层鉴别法,对15批清炒甘草饮片进行薄层鉴别。结果见图3,在紫外光灯(365 nm)下检视,各供试品色谱中,与甘草对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色荧光斑点;在与对照品色谱相应的位置上,显相同橙黄色荧光斑点。
图3 清炒甘草的薄层鉴别
2.8.5 水分、总灰分及酸不溶性灰分检查 依据2025年版《中华人民共和国药典》[1]通则0832第二法及通则2302,测定15批清炒甘草样品的水分、总灰分及酸不溶性灰分。结果见表9,水分含量为1.37%~2.03%,总灰分为3.12%~4.25%,酸不溶性灰分为0.09%~0.40%。
表9 水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、甘草苷及甘草酸的测定结果(%)
样品编号水分总灰分酸不溶性灰分浸出物甘草苷甘草酸P12.034.120.4034.980.953.21 P21.783.530.3437.430.672.79 P31.704.000.1738.720.643.09 P41.633.700.2238.400.713.15 P51.704.090.1345.430.703.16 P61.614.250.3539.620.743.29 P71.653.330.2341.180.472.41 P81.373.380.1437.620.722.93 P91.813.280.1736.240.592.75 P101.743.120.1737.570.602.90 P111.493.560.1134.530.753.23 P121.473.760.1339.970.813.16 P131.523.600.1141.800.762.75 P141.433.610.0940.920.933.25 P151.593.720.1237.620.873.56平均值1.633.670.1938.800.733.04
2.8.6 浸出物测定 依据2025年版《中华人民共和国药典》[1]通则2201热浸法,以40%乙醇为溶剂,测定15批清炒甘草饮片的浸出物。结果见表9,浸出物含量为34.53%~45.43%。
2.8.7 甘草苷和甘草酸含量测定 对15批清炒甘草饮片中甘草苷与甘草酸的含量进行测定。结果见表9,甘草苷与甘草酸的质量分数分别为0.47~0.95 mg/g和2.41~3.56 mg/g。
2.8.8 统计分析方法与限度确定依据 为科学制订质量限度,本研究采用统计容忍区间法。该方法已被ISO等国际标准化组织推荐为建立限量标准的统计学依据[15]。基于表9测定数据,运用Minitab软件进行分析,设定95%置信水平与95%覆盖比例,计算得到各指标的单侧统计容忍限:水分、总灰分及酸不溶性灰分的上限分别为2.07%、4.52%和0.56%;浸出物、甘草苷和甘草酸含量的下限分别为31.58%、0.40%和2.31%。该方法可确保未来95%批次的产品以95%的置信度符合上述统计限度,从而为质量标准的确立提供概率学基础。
在清炒甘草质量标准制定中,本研究以容忍区间法统计结果为核心依据,同时综合参考了2025年版《中华人民共和国药典》[1]甘草项下通用限度、省级炮制规范及大生产实际可行性。为兼顾标准权威性、适用性与生产合理波动,最终限度在衔接《中华人民共和国药典》[1]基础上,对部分统计容忍限作了科学调整,确定如下指标:水分 ≤5.0%、总灰分 ≤5.0%、酸不溶性灰分 ≤1.0%、浸出物 ≥30.0%、甘草苷 ≥0.50%、甘草酸 ≥1.8%。
经验证,15批样品中14批符合上述标准,符合率为93.3%。不合格批次主要因甘草苷含量不足。结果显示,本标准在不脱离统计科学依据的前提下,充分考虑了生产实际,能够被绝大多数合格产品所满足,具有良好的科学性与可行性。
有研究表明,三萜皂苷与黄酮类是甘草及其炮制品的主要药效物质。其中,甘草酸与甘草苷分别是两类成分中含量最高、活性明确的代表,二者协同作用能全面反映清炒甘草的质量与功效[16-17]。在炮制过程中,甘草苷对温度敏感,可监控炒制稳定性;甘草酸与“存性”相关,二者共同指示工艺合理性[18];此外,二者均为《中华人民共和国药典》甘草项下的法定指标,便于标准衔接与实际检测。基于此,本研究选取二者作为清炒甘草质量评价的关键定量分析指标。为进一步完善评价体系,同步引入浸出物测定以宏观表征其可溶性物质总量[19]。同时将传统外观性状(形、色、气、味)鉴别纳入体系,实现传统经验与现代分析技术的有机结合,从而提升评价的系统性与可靠性[20-21]。
基于此,本研究构建了以外观性状(颜色与气味)、浸出物、甘草苷及甘草酸含量为核心的综合评价体系。采用AHP-CRITIC混合加权法科学确定各指标权重,有效整合了专家经验的主观判断与数据本身的客观信息;继而,运用Box-Behnken响应面设计对炮制工艺进行优化,确定最佳工艺参数为投料量100 g、炒制温度120 ℃、炒制时间25 min。为验证模型与工艺的可靠性,在最优条件下进行3批验证实验,所得样品的综合评分分别为98.47、97.22和99.54分(RSD=1.18%),与模型预测值(97.37分)接近,提示所建模型的预测能力良好,且优化工艺稳定可行。
在质量标准研究中引入统计容忍区间法,该方法通过设定95%置信水平与95%覆盖比例,为质量限度的制定提供了严格的概率学保证,克服了传统方法仅基于样本数据的局限性[22-24]。基于15批清炒甘草饮片测定数据,采用容忍区间法计算各质量属性参考限,并结合2025年版《中华人民共和国药典》及相关标准要求,综合拟定了各项质控限度。
本研究通过系统运用现代分析方法,构建了从工艺优化到质量标准制定的完整研究路径,形成了涵盖性状、检查项、浸出物及有效成分含量的全面质量控制体系。该体系在保留传统经验特色的同时融入现代统计原理,显著提升了质量标准的科学性、严谨性与可操作性;不仅为清炒甘草提供了可靠的质量控制方案,也为同类中药饮片的现代化、标准化研究提供了可借鉴的系统性思路与方法学参考。
利益冲突声明:本文所有作者均声明不存在利益冲突。
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王青平(1999-),女,硕士;研究方向:中药药效物质基础及质量评价。
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