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目前特殊类型糖尿病分为八大类，即胰岛β细胞功能缺陷型单基因糖尿病、药物或化学品所致糖尿病、胰岛素作用缺陷型单基因糖尿病、内分泌疾病所致糖尿病、胰源性糖尿病、感染相关性糖尿病、不常见的免疫介导性糖尿病和其他与糖尿病相关的遗传综合征[1-4]。其中胰岛β细胞功能缺陷型单基因糖尿病约占单基因糖尿病的90%，该类可分为新生儿糖尿病、青少年起病的成人型糖尿病、线粒体糖尿病和合并遗传综合征的单基因糖尿病[1]。因此，探索胰岛β细胞功能及与糖尿病相关的生物标志物的变化，成为当前糖尿病研究和治疗的重要方向。FN1具有自聚集特性，可与自身结合并吸附糖类、神经节苷脂等小分子物质。FN1缺失会特异性地阻断运动对肝脏胰岛素敏感性的改善作用，从而导致运动无法带来全身性的胰岛素增敏效应[5]。FN1与许多细胞的增殖凋亡有一定的联系，但目前鲜见其在胰岛β细胞中的研究。

胰岛β细胞功能的研究是糖尿病研究中必不可少的一部分。且随着糖尿病病程的进展，胰岛β细胞的数量不断减少，同时伴随细胞凋亡或淀粉样蛋白沉积，最终导致胰岛β细胞功能丧失[6-7]。因此，本研究以MIN6为实验细胞，研究FN1对胰岛β细胞功能的作用，为糖尿病的治疗提供新的视角。

1 材料与方法

1.1 材料

MIN6细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：CL-0674）；MIN6细胞专用培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：CM-0674）；FN1蛋白[翌圣生物科技（上海）股份有限公司，货号：40113ES03]；低表达FN1慢病毒（上海吉凯生物技术有限公司）；荧光倒置显微镜（徕卡显微镜系统公司，型号：Leica DMI8）；RNA提取试剂盒（北京全式金生物技术股份有限公司，货号：ER501-01-V2）；SweScript All-in-One RT SuperMix for qPCR试剂盒（武汉塞维尔生物科技有限公司，货号：G3337-100）；TB Green Premix Ex Taq（宝日医生物技术有限公司，货号：RR420A）；RIPA裂解液（上海雅酶生物医药科技有限公司，货号：PC101）；Annexin V-APC/7-AAD Apoptosis Kit（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：E-CK-A218）；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：P1200）；小鼠胰岛素酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒（上海优选生物科技有限公司，货号：YX-091419M）；β-actin抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：66009-1-lg）；FN1抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：66042-1-lg）；PI3K抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：20584-1-AP）；p-PI3K抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：29675-1-AP）；Akt抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：10176-2-AP）；p-Akt抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：80455-1-RR）；Bcl-2抗体（美国MedChemExpress，货号：HY-P80566）；Bad抗体（美国MedChemExpres，货号：HY-P86533）；PDX-1抗体（美国MedChemExpress，货号：HY-P80274）；山羊抗兔二抗（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：RGAR001）；山羊抗鼠二抗（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：SA00001-1）。

1.2 实验方法

1.2.1 FN1蛋白溶解及稀释配制FN1母液：将1 ml PH 7.2~7.4 PBS加入称取好的1 mg FN1蛋白的离心管中完成母液配制；稀释至工作液浓度：将配制好的1 mg/ml的母液按照10 μg/ml用完全培养基稀释并分装。

1.2.2 构建FN1稳定低表达的MIN6细胞株将MIN6细胞悬液以2×105个均匀地铺在6孔板中待细胞密度达到50%时将空载慢病毒序列（LV3-NC）与FN1敲低慢病毒序列（Fn1-Mus-421、Fn1-Mus-1113和Fn1-Mus-7604）按照MIN6细胞推荐的感染复数=100加入各孔板中，并加入促转染试剂Polybrene 5 μg/ml。用半血清培养基孵育12 h后弃掉感染液换完全培养基，24 h换1次完全培养基至转染72 h后加入嘌呤霉素筛选感染细胞。

1.2.3 荧光显微镜观察慢病毒转染效率未进行转染的Control组细胞同转染完成的LV3-NC组、Fn1-Mus-421组、Fn1-Mus-1113组和Fn1-Mus-7604组细胞在荧光倒置显微镜100 μm倍镜下拍摄荧光图和明场图，并对图进行保存。

1.2.4 RT-qPCR验证FN1敲低效率待感染细胞达到一定密度后对正常对照细胞、感染LV3-NC细胞、感染Fn1-Mus-421细胞、感染Fn1-Mus-1113细胞和感染Fn1-Mus-7604细胞进行多次细胞传代提取总RNA。将总RNA反转录为cDNA。反转录体系为（20 μl）：总RNA 1 μg，5×SweScript All-in-One RT SuperMix for qPCR（4 μl），gDNA Remover（1 μl），无核酸酶水补足至20 μl；反转录条件：25 ℃ 5 min、42 ℃ 25 min和85 ℃ 5 s。RT-qPCR反应体系：cDNA（2 μl）、TB Green Premix Ex Taq（10 μl）、Rox（0.4 μl）、灭菌水（6 μl）正向引物（0.8 μl）和反向引物（0.8 μl），总反应体系20 μl。反应条件：第一步循环次数1次，95 ℃ 30 s；第二步循环次数40次，95 ℃ 0.05 s； 60 ℃ 34 s；第三步循环次数1次，95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。各组设置6个复孔，实验重复3次，以β-actin为内参，2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。见表1。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡将Control组、LV3-NC组、Fn1-Mus-1113组和Fn1-Mus-1113+FN1组（FNI蛋白以10 μg/ml外源性添加）细胞悬液以2×105个均匀地铺在6孔板中，待各组细胞密度达到50%后各孔加入不含EDTA的胰酶消化细胞，并用原培养液终止消化，1 000 r/min，离心5 min，离心半径9.8 cm，弃上清，收集细胞，PBS洗涤细胞1次，离心后弃上清，加入500 μl稀释的1×Annexin V Binding Buffer重悬细胞，细胞悬液中加入5 μl的Annexin V-APC Reagent和5 μl的7-AAD Reagent，轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15～20 min，上机检测，实验重复3次。

1.2.6 Western blot法检测蛋白相对表达量 RIPA裂解液提取总蛋白，包括Control组、LV-NC组、Fn1-Mus-421组、Fn1-Mus-1113组、Fn1-Mus-7604组和Fn1-Mus-1113+FN1组，测定蛋白浓度；制胶、上样加marker、恒压80 V电泳30 min、高压120 V电泳至溴酚蓝到达胶的底端处；裁膜、制备转膜“三明治”、转膜恒流300 mA、5%脱脂奶粉封闭2 h；洗膜10 min，重复3次；在稀释后的一抗液中4 ℃过夜（抗FN1、p-PI3K、Akt、p-Akt和Bad，1∶5 000稀释；抗PI3K、PDX-1和Bcl-2，1∶500稀释；抗β-actin，1∶20 000稀释）；回收一抗液、洗膜、将膜放入稀释后的二抗溶液中室温孵育1 h（兔/鼠二抗均以1∶5 000稀释）、洗膜、加显色液显影，利用成像系统结合ImageJ软件分析条带灰度值。实验重复3次。

1.2.7 ELISA试剂盒检测胰岛素含量将6孔板中Control组、LV3-NC组、Fn1-Mus-1113组和Fn1-Mus-1113+FN1组细胞的2 ml上清液全部吸入离心管中，在离心半径9.8 cm，3 000 r/min离心10 min，去除颗粒和聚合物，放入-20 ℃冰箱作为待测样本；6孔板中贴壁细胞使用RIPA裂解液进行蛋白质的提取，以总蛋白量校正各组细胞胰岛素分泌量（BCA定量每组3个复孔，取平均值为总蛋白量）；后续按照ELISA试剂盒说明书进行检测、标准曲线绘制、作图及数据分析。每组3个复孔，实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0、GraphPad Prism10.1.2软件相结合进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（

）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法，不符合方差齐性的多组间比较采用非参数检验，两两比较采用Kruskal-Wallis H法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FN1慢病毒转染荧光图及低表达效率验证

Control组未出现荧光，LV3-NC组和Fn1-Mus-1113组出现较强绿色荧光，见图1。Western blot法结果显示，LV3-NC组FN1蛋白表达水平与Control组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与Control组比较，Fn1-Mus-1113组和Fn1-Mus-7604组蛋白表达水平降低（P＜0.05）。RT-qPCR结果显示，LV3-NC组FN1 mRNA表达量与Control组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与Control组比较，Fn1-Mus-421组、Fn1-Mus-1113组和Fn1-Mus-7604组FN1 mRNA表达量降低（P＜0.05）；与Fn1-Mus-421组比较，Fn1-Mus-1113组FN1 mRNA表达量降低（P＜0.05）；与Fn1-Mus-1113组比较，Fn1-Mus-7604组FN1 mRNA表达量升高（P＜0.05）。见图2。综上所述，后续实验选择低表达效果最佳的Fn1-Mus-1113慢病毒序列。

2.2 FN1低表达对Min6细胞凋亡的影响

与Control组比较，LV3-NC组和Fn1-Mus-1113+FN1组细胞早期凋亡率降低（P＜0.05）。与Control组、LV3-NC组比较，Fn1-Mus-1113组细胞早期凋亡率增加（P＜0.05）；与Fnl-Mus-1113组比较，Fn1-Mus-1113+FN1组细胞早期凋亡率降低（P＜0.05）。与Control组和LV3-NC组比较，Fn1-Mus-1113组细胞晚期凋亡率增加（P＜0.05），而Control组、LV3-NC组、Fn1-Mus-1113+FN1组的细胞晚期凋亡率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

2.3 FN1低表达对PI3K/Akt信号通路和凋亡相关蛋白的影响

与Control组比较，Fn1-Mus-1113组p-Akt蛋白、p-PI3k蛋白和Bcl-2蛋白相对表达水平降低（P＜0.05），Bad蛋白相对表达水平升高（P＜0.05）。与Control组比较，Fn1-Mus-1113+FNI组p-PI3K蛋白相对表达水平降低，Bad蛋白相对表达水平升高（P＜0.05）。与Fn1-Mus-1113组比较，Fn1-Mus-1113+FN1组的p-Akt蛋白、p-PI3K蛋白、Bcl-2蛋白相对表达水平升高（P＜0.05），Fn1-Mus-1113+FN1组Bad蛋白相对表达水平与Fn1-Mus-1113组比较，差异无统计学意义。Control组和LV3-NC组各蛋白比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

2.4 FN1低表达对胰岛素分泌的影响

与Control组比较，Fn1-Mus-1113组和Fn1-Mus-1113+FN1组胰岛素分泌量下降（P＜0.05）。与Control组比较，Fn1-Mus-1113组PDX-1蛋白相对表达水平降低（P＜0.05）。Control组与LV3-NC组胰岛素分泌量、PDX-1蛋白相对表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

3 讨论

胰岛β细胞分泌的胰岛素是维持机体血糖稳态的关键，胰岛β细胞功能进行性衰退是2型糖尿病病程发展的诱因之一，因此，保护和改善胰岛β细胞功能对长期控制血糖，减少并发症具有重要意义[8]。本研究通过构建慢病毒稳转细胞株，发现FN1可能通过调控胰岛β细胞凋亡和胰岛素分泌进而参与糖尿病的发生。

FN1是一种高分子量的糖蛋白，具有多种生物学功能[9]。FN1位于细胞外基质中，是调控细胞黏附、生长、迁移和分化的核心，并协助维持细胞形态[10]。作为细胞外基质核心成分，参与调控胰岛素分泌，在胰岛分离过程中细胞外基质分子的酶促降解会使整合素结合能力丧失，进而影响胰岛β细胞内分泌功能、存活和形态[11-12]。胰岛β细胞通过整合素α3β1、α5β1和αvβ3与FN1结合从而促进细胞存活[13]。在1型糖尿病患者下调基因中发现FN1为关键下调基因[14]。FN1通过与整合素ITGA2、ITGB4和ITGA3结合使PI3K和Akt磷酸化活化，从而促进胰腺癌细胞侵袭与转移[15]。体外研究实验表明FN1可以通过增加Bcl-2和p65的核定位来抑制细胞的凋亡[16]。以上研究说明，FN1作为细胞外基质在PI3K/Akt信号通路和胰岛β细胞功能中的调控作用。

PI3K/Akt信号传导是胰岛β细胞质量和功能的核心因素[17]。一项关于他克莫司与移植后糖尿病关系的研究表明，p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平的降低、诱导胰岛β细胞凋亡，使胰岛β细胞活性降低、胰岛素分泌降低，最终导致糖尿病[18]。另外在BeWo和JEG-3细胞中敲低了FN1基因发现p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值相对于对照组和阴性对照组明显下降而过表达则比值明显增加，其中敲低FN1使BeWo细胞中凋亡增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达量下降[19]。在C666-1细胞和5-8F细胞中敲低FN1也出现了同样的结果，敲低组中细胞凋亡率上升且同样出现了Bcl-2表达下降、Caspase-3表达上升的现象[16]。FN1敲低显著降低了LOVO和SW1116细胞的Bcl-2抗凋亡蛋白，增加了Bax和Caspase-3等促凋亡蛋白[20]。本研究中，FN1的低表达降低了PI3K和Akt蛋白的磷酸化活化，抑制了下游抗凋亡蛋白Bcl-2表达和激活了下游促凋亡蛋白Bad表达，增加了细胞的早期和晚期凋亡率。

在2型糖尿病中，胰岛β细胞的渐进性凋亡导致胰岛β细胞数量减少和功能缺陷，最终导致胰岛素分泌不足[21]。PDX-1作为调控胰腺发育、胰岛β细胞分化及胰岛功能的关键因子具有调控胰岛素分泌的作用[22]。当PDX-1缺失时，胰腺形成障碍导致胰岛结构改变，胰岛素分泌不足，从而诱导糖尿病发生[23]。抑制PI3K/Akt磷酸化活化抑制PDX-1的表达[24]。当PI3K和Akt磷酸化水平增加时激活FOXO1磷酸化，而PDX-1作为胰岛素转录的典型启动子，其表达可通过增加胰岛β细胞中FOXO1磷酸化而上调[25]。本研究中FN1低表达降低了PDX-1蛋白表达水平，FN1作为细胞外基质，缺失或低表达时会影响PI3K和Akt的磷酸化活化，进一步可能使FOXO1磷酸化受阻影响下游蛋白PDX-1的表达，最终使胰岛素分泌降低。本研究利用慢病毒转染技术探究FN1-PI3K/Akt对胰岛β细胞凋亡的调控及对胰岛素分泌的影响。结果发现FN1低表达组的p-PI3K和pAkt显著降低，经外源性添加FN1蛋白后可使p-PI3K与p-Akt蛋白水平增加。

本研究存在一定的局限性：实验仅在体外细胞模型中进行，缺乏体内动物模型验证，因此在一定程度上无法完整地评估FN1对胰岛β细胞功能的调控。未来研究中可以在动物模型中利用基因敲除技术，进一步验证FN1对胰岛β细胞功能的调控及对PI3K/Akt信号通路更多下游靶点的调控，深入探索FN1参与糖尿病发病的作用机制。

综上所述，FN1低表达抑制PI3K和Akt磷酸化活化，进而抑制Bcl-2蛋白的表达和激活Bad蛋白的表达，诱导胰岛β细胞凋亡，损害胰岛β细胞的功能，抑制胰岛素相关蛋白PDX-1的表达，引起胰岛素分泌减少。本研究进一步揭示了FN1在胰岛β细胞功能中的作用，为糖尿病的治疗提供了潜在靶点。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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【作者机构】	新疆医科大学公共卫生学院
【分类号】	R319
【基金】	国家自然科学基金资助项目（82560662）。

FN1低表达对胰岛β细胞存活与胰岛素分泌功能的影响

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