心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI）是一种冠状动脉管腔狭窄或闭塞引起的心肌供血不足，在心脏血供成功恢复的同时，出现心肌舒缩功能降低、再灌注时心律失常、心肌梗死面积扩大等损伤的现象[1]。目前，心血管研究多采用青年、成年动物模型，但多项体内及体外研究表明，老龄化伴随的衰老心肌对各种应激的耐受性显著降低[2-4]。克洛索作为一种具有心血管保护作用的激素样蛋白，其分泌型可通过调节多条信号转导通路与离子通道，发挥抗氧化、抗凋亡及抗衰老等效应[5-6]。

PI3K/Akt通路作为关键的促生存信号通路，调控细胞存活、凋亡及氧化应激等过程，与MIRI密切相关[7-8]。在老龄心血管病患者中，PI3K/Akt通路的活性降低，导致心肌缺血再灌注后损伤加重、预后更差[9]。激活PI3K/Akt通路可通过抑制细胞凋亡、促进血管生成等方式减轻心肌损伤[10-11]。本研究以克洛索的抗氧化、抗炎及抗凋亡作用为切入点，探讨克洛索对自然衰老大鼠心肌缺血再灌注后的保护作用，以期为老龄MIRI的防治提供新策略。

1 对象与方法

1.1 实验动物

SPF级SD雄性大鼠27只，6~8周龄，体质量180～200 g，购自新疆医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（新）2023-0001，实验动物使用许可证号：SYXK（新）2023-0004。实验动物饲养在温度（20±2）℃、湿度（40±5）%的环境中，光/暗周期为12 h/12 h，提供标准鼠粮和水。本研究经新疆医科大学实验动物伦理委员会审查并批准（IACUC-20220719-08）。

1.2 主要试剂

人重组克洛索蛋白（货号：100-53-250 UG）购自美国PeproTech公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒（货号：A001-3-2）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒（货号：A003-1-2）购自南京建成生物工程研究所；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）（货号：105-000446-00）、肌酸激酶MB型同工酶（creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB）（货号：105-000459-00）测定试剂盒购自深圳迈瑞生物有限公司；TTC染色液（货号：G1017）、HE染液（货号：G1076）、Masson三色染色液（货号：G1006）均购自武汉塞维尔生物科技有限公司。原位TUNEL[Terminal deoxynucleotidyl transferase（TdT）dUTP Nick-End Labeling，货号：C1089]凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；HiScript Ⅳ All-in-One Ultra RT SuperMix for qPCR（货号：R433-01）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；TB Green® Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（货号：RR820A）购自宝日医生物技术（北京）有限公司；Bcl-2（货号：HA721235）、Bax（货号：ET1603-34）、PI3K（货号：HA722474）、p-PI3K（货号：HA721672）、Akt（货号：ER1901-33）、p-Akt（货号：HA750179）、cleaved-Caspase-3（货号：ET1602-47）、GAPDH兔源单克隆抗体（货号：HA721136）和羊抗兔IgG二抗（货号：HA1001）均购自杭州华安生物技术有限公司；ECL试剂盒（货号：WBKLS0100）、细胞裂解液（货号：R1010）、蛋白酶抑制剂混合液（货号：P001）均购自北京兰杰柯科技有限公司。

1.3 实验分组及处理

27只大鼠饲养于SPF环境中18个月，建立自然衰老大鼠模型。采用随机数字表法将其分为假手术组、造模组、克洛索干预组，每组9只。造模组大鼠连续14 d腹腔注射100 μl生理盐水；克洛索干预组大鼠连续14 d按0.01 mg/kg剂量腹腔注射克洛索蛋白，2 d/次[12-13]。给药结束后，对造模组、克洛索干预组大鼠进行心肌缺血/再灌注造模，腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg，完全麻醉后仰卧位固定并连接心电图仪，气管插管连接呼吸机后进行手术，切开左侧第4肋间隙后用6-0缝线结扎左冠状动脉前降支30 min，解开缝线再灌注2 h。假手术组大鼠麻醉后分离冠状动脉左前降支，穿线但不结扎。

再灌注后，大鼠经腹主动脉采血后立即处死，血样于室温静置2 h后，在4 ℃条件下以3 000 r/min离心10 min，离心半径为10 cm，收集血清储存于-20 ℃中。每组取3只大鼠的心脏，进行TTC染色；剩余6只大鼠的心脏，用无菌生理盐水冲洗，滤纸吸干，去除心包膜及心房后，将左心室平均分为3份：一份置于4%多聚甲醛中固定；另两份用锡纸包裹，经液氮速冻后，转移至-80 ℃冰箱保存，用于后续mRNA及蛋白检测。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 心肌梗死面积测定 将心脏用生理盐水灌注后转移到PBS缓冲液（pH=7.4）中，在-20 ℃下冷冻15 min。沿冠状面将心脏切成2~3 mm厚的5个横截面，将心脏切片浸入1%的TTC溶液中，37 ℃避光孵育20 min，4%多聚甲醛固定过夜。正常心肌保持红色，梗死区的心肌变白。使用Image J软件分析并计算梗死区和非梗死区面积，心肌梗死面积=梗死面积/心脏面积×100%。

1.4.2 心肌损伤标志物检测 按照试剂盒说明书检测血清CK-MB及LDH活性。

1.4.3 氧化应激检测 按照试剂盒说明书检测心肌组织SOD活性及MDA水平。

1.4.4 心肌病理形态学观察 将大鼠心肌组织用生理盐水清洗后，在4%多聚甲醛中固定48 h，石蜡包埋后切成5 μm厚的薄片并固定。HE染色：切片用苏木精染色3 min，伊红染色1 min，最后用梯度乙醇脱水，封片，结果按表1进行评价。Masson染色：切片用苏木精染色6 min，丽春红染色6 min，1%磷钨酸水溶液处理5 min，2%苯胺蓝复染3 min，随后进行脱水、透明、封片，结果按表1进行评价。

表1 心肌染色评分标准

评分HE染色Masson染色0分正常心肌：心肌细胞形态正常，横纹清晰，细胞核大小、形态、染色无纤维化：心肌间质几乎无蓝色胶原纤维均一，无或极少炎症细胞浸润1分轻度损伤：心肌细胞肿胀，横纹部分模糊或消失。伴有局灶性的炎症轻度纤维化：心肌细胞间可见零星、细小的蓝色胶原纤维细胞（主要是中性粒细胞和淋巴细胞）浸润2分中度损伤：心肌细胞凝固性坏死（细胞质深染、嗜酸性增强），核固缩、中度纤维化：心肌细胞周围和血管周围有较明显的胶原纤维包绕，核碎裂现象明显。心肌纤维排列轻度分离，伴有大量炎症细胞浸润形成不连续的网状结构3分重度损伤：大片心肌细胞坏死、溶解，甚至出现收缩带坏死。心肌结构重度纤维化：致密的蓝色胶原纤维广泛分布于心肌间质，将心肌细胞严重破坏，伴有明显出血和弥漫性炎症细胞浸润分割、包裹，形成连续的纤维网

1.4.5 心肌细胞凋亡原位检测（TUNEL） 心肌组织切片按照TUNEL试剂盒说明书进行染色。使用共聚焦显微镜观察，心肌组织总细胞核用DAPI染色，阳性凋亡细胞核用绿色荧光染色标记，其比值为凋亡率。

1.4.6 RT-qPCR法检测mRNA表达 心肌组织采用Trizol法提取组织总RNA。取1 μg总RNA为模板进行反转录。反应体系（20 μl）包括：5 μl 4×All-in-One Ultra qRT SuperMix，1 μg RNA模板，并用RNase-free ddH2O补足至20 μl。反应程序：50 ℃孵育5 min，85 ℃加热5 s，合成的cDNA于-20 ℃保存备用。RT-qPCR反应体系总体积为20 μl，包括：TB Green® Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus） 10 μl，正、反向引物各0.8 μl，cDNA 2 μl，并用RNase-free ddH2O补足至20 μl。扩增条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45个循环；溶解曲线按仪器默认设置。引物序列见表2。

表2 引物序列

基因名称引物序列（5’→3’）引物（bp长）度PI3K正向引物：GCTGTTGATAGACCACCGCTTCC 23 反向引物：TGCCCTGTTCCTCTGCCTTCC 21 Akt正向引物：CAGGAGGAGGAGACGATGGACTTC 24 反向引物：CACACGGTGCTTGGGCTTGG 20 Bax正向引物：AGGCGAATTGGCGATGAACTG 21 反向引物：GCTGCCACACGGAAGAAGAC 20 Bcl-2正向引物：TGTGGATGACTGAGTACCTGAACC 24 反向引物：CAGCCAGGAGAAATCAAACAGAGG 24 Caspase-3正向引物：ATGGAAGCGAATCAATGGACT 21 反向引物：CTGTACCAGACCGAGATGTC 20 β-actin正向引物：GGGAAATCGTGCGTGACATT 20 反向引物：GCGGCAGTGGCCATCTC 17

1.4.7 Western blot法检测蛋白表达 将冻存于液氮中的心肌组织取出，按照试剂盒说明书提取心脏总蛋白，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度，每孔取20 μg蛋白进行上样电泳，分离蛋白后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入一抗Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶2 000）、cleaved-Caspase-3（1∶1 000）、PI3K（1∶2 000）、Akt（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，次日PBST清洗5次（5 min/次）后加入羊抗兔二抗（1∶8 000）室温孵育2 h。显影、曝光，以GAPDH为内参对大鼠心肌组织相关蛋白进行相对定量。

1.5 统计学方法

采用GraphPad Prism 9.5统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌梗死面积比较

与假手术组比较，造模组心肌梗死面积增加（P＜0.05）；与造模组比较，克洛索干预组心肌梗死面积降低（P＜0.05）。见图1。

图1 各组大鼠心肌梗死面积比较

2.2 各组大鼠血清CK-MB、LDH活性比较

与假手术组比较，造模组血清CK-MB、LDH活性升高（P＜0.05）；与造模组比较，克洛索干预组血清CK-MB、LDH活性降低（P＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠血清CK-MB、LDH活性比较（n=6）

2.3 各组大鼠心肌组织MDA含量、SOD活性比较

与假手术组比较，造模组心肌组织MDA含量升高、SOD活性降低（P＜0.05）；与造模组比较，克洛索干预组大鼠心肌组织MDA含量降低、SOD活性升高（P＜0.05）。见图3。

图3 各组大鼠心肌组织MDA含量、SOD活性比较（n=6）

2.4 各组大鼠心肌组织病理学结果

2.4.1 HE染色 假手术组大鼠心肌纤维排列整齐、致密，无炎症细胞浸润，未见纤维化或坏死区域；造模组大鼠心肌纤维损伤严重，肌纤维界限不清，心肌细胞出现大量的炎症细胞浸润；克洛索干预组大鼠心肌细胞排列紊乱，心肌损伤均较造模组减轻。与假手术组比较，造模组心肌病理损伤评分升高（P＜0.05）；与造模组比较，克洛索干预组心肌病理损伤评分降低（P＜0.05）。见图4。

图4 各组大鼠心肌组织损伤情况

2.4.2 Masson染色 假手术组大鼠心肌纤维结构完整、排列整齐；造模组大鼠心肌间质内出现大量蓝色胶原沉积，形成不连续的网状结构，符合中度纤维化；而与造模组比较，克洛索干预组大鼠心肌胶原纤维积聚均较造模组减少。与假手术组比较，造模组心肌胶原沉积评分升高（P＜0.05）；与造模组比较，克洛索干预组心肌胶原沉积评分降低（P＜0.05）。见图5。

图5 各组大鼠心肌胶原沉积情况

2.5 各组大鼠心肌细胞凋亡率比较

与假手术组比较，造模组心肌细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与造模组比较，克洛索干预组心肌细胞凋亡率降低（P＜0.05）。见图6。

图6 各组大鼠心肌细胞凋亡率比较

2.6 各组大鼠心肌组织PI3K、Akt、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达比较

各组心肌组织PI3K、Akt、Caspase-3 mRNA表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与假手术组比较，造模组心肌组织Bax mRNA表达升高，Bcl-2 mRNA表达降低（P＜0.05）；与造模组比较，克洛索干预组心肌组织Bax mRNA表达降低，Bcl-2 mRNA表达升高（P＜0.05）。见图7。

图7 各组大鼠心肌组织PI3K、Akt、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达比较（n=6）

2.7 各组大鼠心肌组织PI3K、Akt、Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3蛋白表达比较

造模组和假手术组心肌组织PI3K、cleaved-Caspase-3蛋白表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与假手术组比较，造模组心肌组织Bax蛋白表达升高，p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表达降低（P＜0.05）。与造模组比较，克洛索干预组心肌组织PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2蛋白表达升高，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白表达降低（P＜0.05）。见图8。

图8 各组大鼠心肌组织PI3K、Akt、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达比较

3 讨论

MIRI在临床上较为常见，减少这种损伤对患者的治疗和预后至关重要。目前，冠心病、心肌梗死等心血管疾病的高危人群多集中在老年人群。老年心肌缺血/再灌注患者因各系统生理功能的老化，机体自身伴随如心血管功能减退、自由基生成增多、心肌收缩功能减弱、细胞坏死和凋亡的敏感性增加等一系列的病理生理变化，相较于年轻人更易发生MIRI且更难治愈[14-15]。探索如何有效缓解中老年MIRI也是目前临床研究的重点。

MIRI的发生机制涉及多种病理生理过程，如氧化应激、炎症反应、细胞自噬、细胞凋亡等。药物预处理是临床上常见的MIRI治疗方法[16]。克洛索作为一种重要的抗衰老蛋白，分为膜型克洛索和分泌型克洛索。分泌型克洛索通过调节心肌内氧化应激、炎症和凋亡作用参与心脏的保护，心脏中克洛索的缺失会导致严重的心律失常及死亡。有研究显示，克洛索蛋白因具有降压作用可以减缓心力衰竭[17-18]；另有研究显示，克洛索在心肌缺血再灌注期间有效降低心肌损伤和炎症[19-20]。而关于克洛索对老年MIRI的研究较少。本研究结果显示，与造模组比较，克洛索干预组大鼠心肌梗死面积减少，心肌损伤标志物（CK-MB、LDH活性）、与氧化应激相关指标（MDA含量、SOD活性）改善；同时，病理结果显示，心肌组织炎症细胞浸润减少且心肌纤维化明显改善，提示克洛索对自然衰老大鼠心肌缺血/再灌注造成的心肌病理损伤具有改善作用。

PI3K/Akt通路在MIRI的过程中具有重要作用。心肌在早期处于缺血、缺氧阶段，Ca2+内流增加，氧自由基前体蓄积，线粒体电子传递链受阻[21-22]；而再灌注后，初始几分钟出现较强的氧化应激反应，氧自由基暴发性蓄积，Ca2+超载加剧，导致线粒体严重损伤，促进细胞存活的Bcl-2表达减少，促进细胞凋亡的Bax表达增加，线粒体释放大量细胞色素c和凋亡诱导因子至细胞质，最终激活胱天蛋白酶（Caspase）凋亡级联反应，导致心肌细胞凋亡和心肌损伤[23-24]。Akt活化后可增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，抑制细胞色素c和凋亡诱导因子的释放，进而抑制Caspase家族激活，发挥抑制心肌细胞凋亡的作用[25-27]。有研究报道，克洛索通过负调控PI3K/Akt通路增强FoxO3介导的抗氧化基因表达，克洛索通过激活PI3K/Akt/mTOR通路改善心肌梗死后的心力衰竭，提示克洛索是PI3K/Akt通路的重要调控因子，其调控方向具有背景依赖性[28-29]。本研究结果显示，克洛索能抑制心肌细胞凋亡，促进心肌再生和修复，这种保护作用与PI3K/Akt通路的激活及下游与凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、Caspase-3）的调控存在相关性，提示克洛索可能通过激活PI3K/Akt通路来抑制心肌细胞凋亡。但克洛索与PI3K/Akt通路的直接关系还需后期使用特异性激动剂或抑制剂进行功能实验验证，这也是下一步研究需要解决的关键问题。

综上所述，克洛索对自然衰老大鼠的MIRI具有保护作用，具体表现为减轻心肌损伤、抑制氧化应激和细胞凋亡，改善心肌纤维化。这些保护效应可能与PI3K/Akt通路的激活有关，但该通路的确切作用机制仍需进一步深入研究。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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Study on the effect and mechanism of Klotho protein on myocardial ischemia/reperfusion injury in naturally aging rats

WANG Kun1 LYU Xiaomin1 ZHAO Xiaoguo1 LIAN Jun1 SUN Zhan2

1.Technology Innovation and Achievement Transformation Service Center, Xinjiang Medical University, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830017, China; 2.School of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830017, China

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of Klotho protein on myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI) in naturally aging rats. Methods A total of 27 male SD rats were raised in an SPF environment for 18 months to establish a naturally aging rat model. The model rats were divided into sham-operated group, model group,and Klotho intervention group, with nine rats in each groups. The Klotho intervention group was intraperitoneally injected with Klotho protein at a dose of 0.01 mg/kg (2 days each time); while the sham-operated group and the model group received an equal volume of normal saline via the same route and schedule, for 14 consecutive days. MIRI was induced in the Klotho intervention group and model group by ligating the left anterior descending coronary artery for 30 min, followed by 2 hours of reperfusion. Myocardial infarct size was measured by TTC staining; myocardial tissues morphology and collagen deposition were observed by HE and Masson staining; the activities of serum creatine kinase MB isoenzyme (CK-MB) and lactate dehydrogenase (LDH), as well as the activities of superoxide dismutase(SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) in myocardial tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay; the apoptosis rate of myocardial cell was detected by TUNEL staining; and the mRNA and protein expressions of PI3K, Akt, Bax, Bcl-2, and Caspase-3 in myocardial tissues were detected by RT-qPCR and Western blot. Results Compared with the sham-operated group, the Myocardial infarct size and the activities of serum CK-MB and LDH in the model group increased (P＜0.05); compared with the model group, the myocardial infarct size and the activities of serum CK-MB and LDH in the Klotho intervention group decreased (P＜0.05). Compared with the sham-operated group, the MDA content in myocardial tissue of the model group increased and the SOD activity decreased (P＜0.05); compared with the model group, the MDA content in the myocardial tissue in the Klotho intervention group decreased and the SOD activity increased (P＜0.05). Compared with the sham-operated group, the myocardial pathological injury score and myocardial collagen deposition score in the model group increased (P＜0.05); compared with the model group, the myocardial pathological injury score and myocardial collagen deposition score in the Klotho intervention group were decreased (P＜0.05). Compared with the sham-operated group, the apoptosis rate of myocardial cells in the model group increased (P＜0.05); compared with the model group, the apoptosis rate of myocardial cells in the Klotho intervention group decreased (P＜0.05). Compared with the sham-operated group, the expression of Bax mRNA in myocardial tissues of the model group increased, and the expression of Bcl-2 mRNA decreased (P＜0.05); compared with the model group,the expression of Bax mRNA in myocardial tissues of the Klotho intervention group decreased; the expression of Bcl-2 mRNA increased (P＜0.05). Compared with the sham-operated group, the expression of Bax protein in myocardial tissues of the model group increased; while the expressions of p-PI3K, Akt, p-Akt, and Bcl-2 protein decreased (P＜0.05); compared with the model group, the expressions of PI3K, p-PI3K, Akt, p-Akt, and Bcl-2 protein in myocardial tissues of the Klotho intervention group increased; while the expressions of Bax and cleaved-Caspase-3 protein decreased (P＜0.05). Conclusion Klotho has a protective effect on MIRI in naturally aging rats. The mechanism may be related to the activation of the PI3K/Akt pathway, which in turn inhibits oxidative stress and cardiomyocyte apoptosis.However, the directness to this pathway needs further verification.

[Key words] Aging; Myocardial ischemia/reperfusion injury; Klotho; Myocardial cell; Apoptosis

[中图分类号] R542.2；R322.1

[文献标识码] A

[文章编号] 1673-7210（2026）04（c）-0055-08

DOI：10.20047/j.issn1673-7210.25092305

[基金项目] 新疆维吾尔自治区自然科学基金青年科学基金项目（2022D01C719）。

[作者简介]

王昆（1992.10-），女，硕士，主要从事心血管方面的研究工作。

[通讯作者] 孙湛（1979.7-），女，博士，教授，博士生导师，主要从事衰老及心血管疾病的研究工作。

（收稿日期：2025-09-29）

（修回日期：2026-01-04）